Name: 用制备薄层色谱和MALDI-TOF质谱分析的三酸甘油酯含量的蝙蝠外皮血脂 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: 学习利用制备薄层色谱和MALDI-TOF质谱技术分离鉴定蝙蝠皮脂腺分泌物中的甘油三酯含量，分析脂质组成差异，揭示其在宿主病原体相互作用中作为化学信号的功能机制。该方法可应用于其他哺乳动物系统。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

在实验室方法的开发过程中，Scott Treece、Katelyn Arter、Jeremy Ragsdell、Tony LaMark James、Amy Fischer、Hannah Blair 和 Cheyenne Gerdes 提供了协助。我们感谢 Medina-Bolivar 实验室（Luis H. Nopo-Olazabal；阿肯色生物科学研究所）在薄层色谱扫描密度测定方面的帮助。本项目所使用的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）由美国国家科学基金会EPSCoR研究基础设施改进计划——阿肯色ASSET计划P3中心（EPS-0701890）在阿肯色生物科学研究所提供。本研究的资金由美国鱼类及野生动物管理局/阿肯色州野生动物拨款、国家洞穴学会以及印第安纳州立大学北美蝙蝠研究与保护中心提供。

警告：请提前获取处理、运输和储存蝙蝠所需的所有州级和联邦许可。还必须获得所在机构动物护理与使用委员会以及机构生物安全委员会的批准。如果需要接触活体蝙蝠（或神经系统组织），操作人员应接种狂犬病疫苗。本研究中使用的蝙蝠于2010年夏季根据标准方法从阿肯色州的奥扎克-圣弗朗西斯国家森林采集（阿肯色州立大学机构生物安全委员会批准编号 # 135349-1）28。
1. 组织处理与脂质提取
<ol>
	<li>在采集不同个体的组织样本之前及之间，均需用甲醇清洁所有器械。使用剪刀从皮肤上剪取毛发（约1.0 g），置于125 ml锥形瓶中。用4–6个浸有氯仿:甲醇溶剂（C:M；3:2 v/v）的棉球擦拭翼部表面以采集皮脂，并将这些棉球放入另一个锥形瓶中。</li>
	<li>用含有0.5%丁基化羟基甲苯（BHT）的10 ml氯仿:甲醇（2:1 v/v）提取组织，以防止氧化29仅使用高效液相色谱级溶剂。</li>
	<li>2小时后，向每个烧瓶中加入约0.5 g无水硫酸盐，短暂混合，然后通过滤纸过滤收集溶剂。</li>
	<li>重复步骤 1.2 和 1.3 两次，第一次使用 1:1 C:M，随后使用 1:2 C:M。合并滤液。</li>
	<li>在 N₂ 气流下蒸发合并的滤液2，测定干重后，将脂质残留物溶解于3:2的氯仿:甲醇溶液（含0.5% BHT）中，浓度为10 mg/ml。样品储存于玻璃小瓶中，置于-20 °C保存。通常建议在样品采集后一个月内完成分析，并尽量减少冻融循环次数。</li>
</ol>
2. 通过制备型薄层色谱法分离脂质
<ol>
	<li>提前准备经溶剂清洗的1.5 ml微量离心管：用3:2的C:M溶液（氯仿:甲醇）填充，丙酮冲洗，然后空气干燥。此步骤旨在去除可能干扰后续质谱分析的增塑剂。将样品管储存于无尘容器中，并仅戴手套操作，以防止皮肤油脂污染。</li>
	<li>用3:2的氯仿:甲醇（C:M）溶剂对薄层色谱板进行预展开活化。向薄层色谱展开槽中加入足够量的溶剂，使其深度达到1 cm，然后将色谱板放入展开槽中（用玻璃盖盖紧），让溶剂完全上升至板的顶端。此过程约需45分钟。</li>
	<li>移去平板，在通风橱中干燥至溶剂完全挥发（约15分钟），然后置于120 °C烘箱中至少10分钟。在平板顶端用铅笔做标记，以确保加样时保持方向一致。在距平板底边1.5 cm处用铅笔画一条直线，作为样品和标准品点样的基线。</li>
	<li>通过裁剪一张足够大的滤纸，以衬于薄层色谱（TLC）展开室的两个短边和一个长边内壁。将滤纸衬层放入展开室中，当溶剂加入展开室后，滤纸会完全润湿。</li>
	<li>配制100 ml流动相溶剂，即正己烷:乙醚:乙酸（H:E:A；80:20:2，v/v/v）。将溶剂倒入层析缸中，液面深度约为1 cm。用玻璃盖盖住层析缸，沿缸口顶部边缘涂抹硅脂密封。使用前让层析缸平衡过夜。</li>
	<li>用毛细管或移液器将样品手动点样至已制备好的薄层色谱板上，从一端边缘约1.5 cm处开始，连续划线至另一端边缘前1.5 cm处。推荐使用自动点样仪，因其可形成更均匀的条带。在薄层色谱板的外侧通道点样约20 μl的甾醇、游离脂肪酸（FFAs）、甘油三酯（TAGs）和甾醇酯标准品混合物（浓度为10 mg/ml；可使用市售预混制剂）。</li>
	<li>将点样后的薄层色谱板放入已平衡的展开 chamber 中，盖上盖子，展开至溶剂前沿到达板的顶端边缘。使用此处所述的流动相展开约需 45 分钟。从 chamber 中取出色谱板，置于通风橱中挥干多余溶剂约 1 分钟。</li>
	<li>用含0.05%罗丹明6G的95%乙醇溶液喷雾染色，在长波长紫外灯下观察脂质条带，并用铅笔标记Rf 确定样品和标准品中荧光条带的位置。此时可拍摄照片记录。</li>
	<li>确定与TAG标准品对应的条带，用刮刀将硅胶刮下并转移至一张较大的玻璃纸称量纸上。将硅胶转移至一个经溶剂清洗过的1.5 ml微量离心管中。</li>
	<li>向样品管中加入1.0 ml 3:2 C:M溶剂，超声1分钟，离心沉淀二氧化硅，然后将上清液转移至一支预先称重的新管中。重复上一步骤，合并滤液，并在氮气气流下蒸发溶剂2.</li>
	<li>将含有TAGs的干燥残留物在氮气环境下储存2 在4 °C避光条件下孵育，同时通过薄层色谱法（TLC）分离额外的组织样品。样品中含有罗丹明6G，但其在正己烷中不溶，因此在质谱分析前的样品溶解过程中被迅速去除。</li>
</ol>
3. 通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱进行TAG分析
<ol>
	<li>将10 mg CHCA溶解于1 ml溶剂（49.5%乙醇、49.5%乙腈和1%含0.1%三氟乙酸的水溶液）中，配制新鲜的α-氰基-4-羟基肉桂酸（CHCA）基质溶液。</li>
	<li>准备促肾上腺皮质激素（ACTH；18-39 片段，2465.1989 Da），用于仪器分辨率和灵敏度测试：将 1 μl ACTH（1 mg/ml）与 39.5 μl 0.1% 三氟乙酸（TFA）混合，得到 10 pmol/μl 的储备液。该溶液可于 -20 °C 保存，以备后续使用。</li>
	<li>取1 μl浓度为10 pmol/μl的ACTH储备液，加入9 μl 0.1% TFA，配制成1 pmol/μl的新鲜工作液，再与10 μl CHCA基质溶液等体积混合，得到浓度为500 fmol/μl的溶液。</li>
	<li>在3:2的氯仿:甲醇（C:M）溶液中配制浓度为10 mg/ml的TAG标准品，用于MALDI仪器校准（例如 三癸酸甘油酯 [470.361 Da]、三辛酸甘油酯 [554.455 Da]、三月桂酸甘油酯 [638.549 Da]、三棕榈酸甘油酯 [722.642 Da]、三棕榈油酸甘油酯 [800.689 Da]、三肉豆蔻酸甘油酯 [806.736 Da]、三油酸甘油酯 [884.783 Da]、三亚油酸甘油酯 [968.877 Da] 和三芥酸甘油酯 [1052.971 Da]。</li>
	<li>以3:2的氯仿:甲醇（C:M）配制10 mg/ml的三油酸甘油酯，作为外部锁质量校准的TAG标准品。</li>
	<li>将储存的TAG样品溶解于正己烷中，配制成10 mg/ml的溶液。</li>
	<li>配制 0.5 M（77.06 mg/1.0 ml）的 2,5-二羟基苯甲酸（DHB）储备液，使用 90% 甲醇作为样品和标准基质。同时配制 1.0 M（2.0 g/50.0 ml）的 NaOH 溶液。用铝箔包裹盛有 DHB 溶液的试管，避光保存。</li>
	<li>在预清洗的离心管中，加入 10.0 μl DHB 基质、10.0 μl 样品或标准品以及 5.0 μl 1.0 M NaOH，混匀后短暂离心，使混合液沉至管底。</li>
	<li>将1.0 μl的标准品、样品或ACTH点样至MALDI不锈钢靶板上，置于干燥器中直至干燥。将靶板放入仪器中进行数据采集。</li>
	<li>在正离子反射模式下进行基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）分析。使用促肾上腺皮质激素（ACTH）和三酰甘油（TAG）标准溶液，按照仪器制造商的说明对仪器进行调谐和校准。</li>
	<li>获取靶板上每个样品点的质谱数据（参数需符合仪器规格；本实验采用的参数为：激光发射频率5 Hz，每点采集约100次以获得平均谱图）。对MALDI质谱数据进行平滑处理并扣除背景后，使用在线搜索引擎LIPID MAPS手动处理离子峰<a href="http://www.lipidmaps.org/tools/ms/glycerolipids_batch" target="_blank">www.lipidmaps.org/tools/ms/glycerolipids_batch</a>).</li>
	<li>将谱图列表复制粘贴至前体离子列表及强度框中。将搜索范围限定为所需的酰基组成。根据各样本谱图中出现的离子质荷比（m/z）鉴定三酰甘油（TAGs）。若已有通过独立的气相色谱-质谱（GC/MS）分析获得的脂肪酸甲酯（FAME）百分比数据，可将这些数据加入以计算存在的三酰甘油的可能概率。</li>
</ol>
仪器：本研究中使用的质谱仪为沃特斯 MALDI Micro MX（配备 337 nm 20 Hz 的 N2 激光器）。任何厂商生产的具有正离子反射模式功能的 MALDI 仪器均可使用。所用的一般参数设置为：脉冲电压 2,000 V；反射器电压 5,200 V；源电压 15,000 V，数据采集使用 MassLynx 软件（版本 4.0）。这些操作条件可提供高于 12,000 的质谱分辨率。

<ol><li>Pappas, A., Anthonavage, M., Gordon, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+fate+and+selective+utilization+of+major+FAs+in+human+sebaceous+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Metabolic fate and selective utilization of major FAs in human sebaceous gland.</a> Journal of Investigative Dermatology. 118 (1), 164-171 (2002).</li>
<li>Nicolaides, N., Hwei, H. C., Rice, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+skin+surface+lipids+of+man+compared+with+those+of+eighteen+species+of+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">The skin surface lipids of man compared with those of eighteen species of animals.</a> Journal of Investigative Dermatology. 51 (2), 83-89 (1968).</li>
<li>Desbois, A. P., Smith, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibacterial+free+fatty+acids%3A+activities%2C+mechanisms+of+action+and+biotechnological+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Antibacterial free fatty acids: activities, mechanisms of action and biotechnological potential.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 85 (6), 1629-1642 (2010).</li>
<li>Munoz-Garcia, A., Williams, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutaneous+water+loss+and+lipids+of+the+stratum+corneum+in+Dusky+Antbirds%2C+a+lowland+tropical+bird%5BTitle%5D)+AND+%22Condor%22%5BJournal%5D)">Cutaneous water loss and lipids of the stratum corneum in Dusky Antbirds, a lowland tropical bird.</a> Condor. 109 (1), 59-66 (2007).</li>
<li>Catala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+function+of+very+long+chain+polyunsaturated+fatty+acids+in+the+pineal+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">The function of very long chain polyunsaturated fatty acids in the pineal gland.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1801, 95-99 (2010).</li>
<li>Stahl, J., Niedorf, F., Kietzmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+epidermal+lipid+composition+and+skin+morphology+of+animal+skin+ex+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Characterization of epidermal lipid composition and skin morphology of animal skin ex vivo.</a> European Journal of Pharmacology. 72 (2), 310-316 (2009).</li>
<li>Picardo, M., Ottaviani, M., Camera, E., Mastrofrancesco, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sebaceous+gland+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22Dermato-Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Sebaceous gland lipids.</a> Dermato-Endocrinology. 1 (2), 68-71 (2009).</li>
<li>Ro, B. I., Dawson, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+sebaceous+gland+activity+and+scalp+microfloral+metabolism+in+the+etiology+of+seborrheic+dermatitis+and+dandruff%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">The role of sebaceous gland activity and scalp microfloral metabolism in the etiology of seborrheic dermatitis and dandruff.</a> Journal of Investigative Dermatology. 10, 194-197 (2005).</li>
<li>Davoudi, S. M., Sadr, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+of+skin+sebum+and+elasticity+level+in+patients+with+sulfur+mustard-induced+dermatitis+and+healthy+controls%5BTitle%5D)+AND+%22Skin+Research+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Comparative study of skin sebum and elasticity level in patients with sulfur mustard-induced dermatitis and healthy controls.</a> Skin Research and Technology. 16 (2), 237-242 (2010).</li>
<li>Zampeli, V. A., Makrantonaki, E., Tzellos, T., Zouboulis, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+pharmaceutical+concepts+for+sebaceous+gland+diseases%3A+implementing+today%27s+pre-clinical+data+into+tomorrow%27s+daily+clinical+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Pharmaceutical+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">New pharmaceutical concepts for sebaceous gland diseases: implementing today's pre-clinical data into tomorrow's daily clinical practice.</a> Current Pharmaceutical Biotechnology. 13 (10), 1898-1913 (2012).</li>
<li>Horton, H. R., Moran, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHorton%2C+HR+%22Principles+of+Biochemistry%22">Principles of Biochemistry</a>. , Prentice Hall. Englewood Cliffs, NJ. (1993).</li>
<li>Fahy, E., Subramaniam, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+classification+system+for+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Lipid+Science+and+Technology%22%5BJournal%5D)">A comprehensive classification system for lipids.</a> European Journal of Lipid Science and Technology. 107 (5), 337-364 (2005).</li>
<li>Fahy, E., Subramaniam, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+of+the+LIPID+MAPS+comprehensive+classification+system+for+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Update of the LIPID MAPS comprehensive classification system for lipids.</a> Journal of Lipid Research. 50 (5), S9-S14 (2009).</li>
<li>Fuchs, B., Süß, R., Nimptsch, A., Schiller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MALDI-TOF-MS+directly+combined+with+TLC%3A+A+review+of+the+current+state%5BTitle%5D)+AND+%22Chromotagraphia%22%5BJournal%5D)">MALDI-TOF-MS directly combined with TLC: A review of the current state.</a> Chromotagraphia. 69, S95-S105 (2009).</li>
<li>Savary, B. J., Vasu, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSavary%2C+BJ+%22Recombinant+Gene+Expression%2C+Reviews+and+Protocols%22">Recombinant Gene Expression, Reviews and Protocols</a>. Lorence, A. , 3rd, Humana Press. New York, NY. (2011).</li>
<li>Gidden, J., Liyanage, R., Durham, B., Lay, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reducing+fragmentation+observed+in+the+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionization+time-of-flight+mass+spectrometric+analysis+of+triacylglycerols+in+vegetable+oils%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Communications+in+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Reducing fragmentation observed in the matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometric analysis of triacylglycerols in vegetable oils.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 21, 1951-1957 (2007).</li>
<li>Fuchs, B., Schiller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+MALDI-TOF+mass+spectrometry+in+lipidomics%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Lipid+Science+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Application of MALDI-TOF mass spectrometry in lipidomics.</a> European Journal of Lipid Science and Technology. 111 (1), 83-98 (2009).</li>
<li>Fuchs, B., Sϋβ, R., Schiller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+update+of+MALDI-TOF+mass+spectrometry+in+lipid+research%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">An update of MALDI-TOF mass spectrometry in lipid research.</a> Progress in Lipid Research. 49 (4), 450-475 (2010).</li>
<li>Karas, M., Bachmann, D., Hillenkamp, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+the+wavelength+in+high-irradiance+ultraviolet+laser+desorption+mass+spectrometry+of+organic+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Influence of the wavelength in high-irradiance ultraviolet laser desorption mass spectrometry of organic molecules.</a> Analytical Chemistry. 57 (14), 2935-2939 (1985).</li>
<li>Hillenkamp, F., Karas, M., Holtkamp, D., Klusener, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energy+deposition+in+ultraviolet+laser+desorption+mass+spectrometry+of+biomolecules%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Mass+Spectrometry+and+Ion+Processes%22%5BJournal%5D)">Energy deposition in ultraviolet laser desorption mass spectrometry of biomolecules.</a> International Journal of Mass Spectrometry and Ion Processes. 69 (3), 265-276 (1986).</li>
<li>Knochenmuss, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKnochenmuss%2C+R+%22Electrospray+and+MALDI+Mass+Spectrometry%3A+Fundamentals%2C+Instrumentation%2C+Practicalities%2C+and+Biological+Applications%22">Electrospray and MALDI Mass Spectrometry: Fundamentals, Instrumentation, Practicalities, and Biological Applications</a>. Cole, R. B. , 2nd, John Wiley and Sons. NJ. 149-262 (2010).</li>
<li>Pannkuk, E. L., Gilmore, D., Savary, B. J., Risch, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triacylglyceride+%28TAG%29+profiles+of+integumentary+lipids+isolated+from+three+bat+species+determined+by+matrix-assisted+laser+desorption+-+ionization+time-of-flight+mass+spectrometry+%28MALDI+-+TOF+MS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Zoology%22%5BJournal%5D)">Triacylglyceride (TAG) profiles of integumentary lipids isolated from three bat species determined by matrix-assisted laser desorption - ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI - TOF MS).</a> Canadian Journal of Zoology. 90 (9), 1117-1127 (2012).</li>
<li>Blehert, D., Hicks, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bat+white-nose+syndrome%3A+An+emerging+fungal+pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bat white-nose syndrome: An emerging fungal pathogen.</a> Science. 323 (5911), 227-228 (2009).</li>
<li>Gargas, A., Trest, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geomyces+destructans+sp.+nov.+associated+with+bat+white-nose+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Mycotaxon%22%5BJournal%5D)">Geomyces destructans sp. nov. associated with bat white-nose syndrome.</a> Mycotaxon. 108, 147-154 (2009).</li>
<li>Lorch, J. M., Meteyer, C. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+infection+of+bats+with+Geomyces+destructans+causes+white-nose+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Experimental infection of bats with Geomyces destructans causes white-nose syndrome.</a> Nature. 480 (7377), 376-378 (2011).</li>
<li>Frick, W. F., Pollock, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+emerging+disease+causes+regional+population+collapse+of+a+common+North+American+bat+species%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">An emerging disease causes regional population collapse of a common North American bat species.</a> Science. 329 (5992), 679-682 (2010).</li>
<li>Boyles, J. G., Cryan, P. M., McCracken, G. F., Kunz, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+economic+importance+of+bats+in+agriculture%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The economic importance of bats in agriculture.</a> Science. 332 (6025), 41-42 (2011).</li>
<li>Sikes, R. S., Gannon, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+of+the+American+Society+of+Mammalogists+on+the+use+of+wild+mammals+in+research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Mammalogy%22%5BJournal%5D)">Guidelines of the American Society of Mammalogists on the use of wild mammals in research.</a> Journal of Mammalogy. 92 (1), 235-253 (2011).</li>
<li>Law, S., Wertz, P. W., Swartzendruber, D. C., Squier, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional+variation+in+content%2C+composition%2C+and+organization+of+porcine+epithelial+barrier+lipids+revealed+by+thin+layer+chromatography+and+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Oral+Biology%22%5BJournal%5D)">Regional variation in content, composition, and organization of porcine epithelial barrier lipids revealed by thin layer chromatography and transmission electron microscopy.</a> Archives of Oral Biology. 40 (12), 1085-1091 (1995).</li>
<li>Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+the+isolation+and+purification+of+total+lipids+from+animal+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues.</a> Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).</li>
<li>Nicolaides, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+lipids%3A+Their+biochemical+uniqueness%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Skin lipids: Their biochemical uniqueness.</a> Science. 186 (4158), 19-24 (1974).</li>
<li>Camera, E., Ludovici, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+analysis+of+the+major+lipid+classes+in+sebum+by+rapid+resolution+high-performance+liquid+chromatography+and+electrospray+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Comprehensive analysis of the major lipid classes in sebum by rapid resolution high-performance liquid chromatography and electrospray mass spectrometry.</a> Journal of Lipid Research. 51, 3377-3388 (2011).</li>
<li>Fuchs, B., Süß, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+analysis+by+thin-layer+chromatography-+A+review+of+the+current+state%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+A%22%5BJournal%5D)">Lipid analysis by thin-layer chromatography- A review of the current state.</a> Journal of Chromatography A. 1218 (19), 2754-2774 (2011).</li>
</ol>

作者声明不存在竞争性财务利益。

本文介绍了一种简单且稳健的方法，用于通过制备型薄层色谱法（TLC）分离从哺乳动物皮肤组织中提取的宽泛脂质类别，并通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）测定甘油三酯（TAG）的谱型，且无需对脂质分子进行耗时的衍生化处理。利用MALDI-TOF MS获得高质量甘油三酯谱图的关键步骤包括：1）尽可能减少污染或氧化，成功提取目标化合物；2）通过色谱法实现充分的分离与纯化；3）MALDI-TOF MS具备高分辨率和高质量精度。
本文通过提取和分离东部红蝙蝠翼膜中的中性脂质组分，获得甘油三酯（TAG）的质谱谱型。尽管本研究使用了一种蝙蝠物种（哺乳纲：翼手目），但这些方法可推广应用于任何哺乳动物皮肤脂质的研究。蝙蝠皮肤脂质的特征主要为胆固醇，含有较低含量的甘油三酯（TAGs）、游离脂肪酸（FFAs）、角鲨烯以及甾醇/蜡酯。蝙蝠皮脂中的脂质比例与人类不同：其中角鲨烯含量较低（相比之下，人类可达16%），而胆固醇比例较高（人类为1–7%，蝙蝠则为26–62%）22,31。人类毛发中甘油三酯含量约为3%，而东部红蝙蝠毛发中该比例可达28%。从蝙蝠中提取脂质样本的方法与其他物种相似。本研究中使用浸有溶剂的棉球去除皮脂，也可通过将含有溶剂的小瓶或样品管多次倒置接触皮肤表面来实现提取。此外，专用胶带产品也提供了提取表面脂质的替代方法32。正确进行脂质提取的关键环节是尽量减少皮肤油脂的污染。这一问题可通过以下方式轻松解决：使用装有甲醇的挤压瓶喷洒所有玻璃器皿和工具，在处理每个样品之间用纸巾擦拭工具，并佩戴检查用手套。为防止多不饱和酰基的氧化，需添加BHT，无论样品在何种温度下储存，均应使用该抗氧化剂。
生物分子分析通常需要色谱步骤，以将目标分子与杂质分离。本方法采用薄层色谱法（TLC），避免了气相或液相色谱对仪器设备的要求，且获得可靠、可重复结果所需的技术经验较少。根据目标脂质类别，可使用多种不同的流动相。此外，采用高效薄层色谱（HPTLC）板结合扫描光密度法，可实现定量分析。尽管薄层色谱法的变体种类繁多，无法在此一一列举，但脂质薄层色谱中一些常用的流动相包括：用于分离磷脂和糖脂的氯仿:甲醇:水体系，以及用于分离非极性脂质的异辛烷:乙醚体系28。在将三酰甘油（TAGs）与其他脂质类别分离方面，H:E:A溶剂体系效果稳定，并可提供可比的结果。
使用薄层色谱（TLC）的另一个优势在于，无需对分析物进行预先衍生化，即可利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）快速分析目标条带。在本研究中，通过超声处理将薄层板上的硅胶去除，并用溶剂洗脱分析物，随后经离心分离吸附剂，再蒸发洗脱溶剂以获得分析物。或者，也可将基质直接涂布于薄层板上已分离的分析物条带处，随后直接进行MALDI-TOF MS分析33。MALDI-TOF MS的成功分析依赖于充分的样品制备以及操作人员对仪器调谐和校准的熟练程度。仪器应每日使用涵盖目标分子分子量范围的标准品进行校准。还应每日使用促肾上腺皮质激素（ACTH）确认仪器具备适当的灵敏度和分辨率（例如 ≥10,000）。
哺乳动物体表皮脂中的脂质成分可能在细菌/真菌病原体的定植过程中发挥作用。因此，了解不同物种及个体间化学成分的差异，可能为人类和野生动物疾病的发生过程提供线索。患病个体与健康个体之间的种内差异可能表现为有助于疾病检测和诊断的临床标志。此外，若存在特定抑制微生物生长的化合物，则可将其鉴定并用于疾病的治疗与预防。

哺乳动物的皮肤组织包括表皮、角质结构（例如 毛发和指甲）以及外分泌腺。皮脂型外分泌腺与毛囊相关联，两者共同构成毛囊皮脂腺单位1。皮脂腺会向皮肤表面释放一种油性分泌物，称为皮脂。皮脂主要由甘油酯类（例如 三酰甘油 [TAGs]）、游离脂肪酰基（FFAs）、甾醇/蜡酯和角鲨烯组成。皮脂的化学组成具有物种特异性2。除了作为先天免疫系统的一部分并发挥抗菌功能3外，皮脂脂质还影响多种重要的生理过程，包括经皮肤的蒸发性水分流失4、细胞完整性与基因调控5以及药物吸收6。皮脂脂质的组成也可作为疾病标志物。皮脂中各大类脂质的比例和含量改变是多种疾病的临床表现，如寻常痤疮7、头皮屑8、脂溢性皮炎8、无脂症9等10。表皮和毛发组织中含有成分各异的脂质谱，包括甾醇及其衍生物、三酰甘油（TAGs）、游离脂肪酸（FFAs）、神经酰胺、磷脂及其他微量脂质成分。由于皮肤脂质可能参与疾病过程，因此确定健康个体与患病个体之间三酰甘油化学组成的差异，可能对疾病的临床诊断具有重要意义。
脂质通常被定义为不溶于水、具有非极性或非极性-极性取代基的有机化合物11。脂质结构可以是长链烃、含氧烷烃（包括蜡酯、游离脂肪酸、醇类、酮类和醛类），或如胆固醇等复杂的环状结构12。根据结构可分为八大类脂质（游离脂肪酸、甘油酯[GL]、甘油磷脂[GP]、鞘脂[SP]、固醇脂质[ST]、类异戊二烯脂质[PR]、糖脂[SL]和聚酮[PK]），不同类别表现出广泛的化学性质差异13。由于各类脂质的化学性质差异较大，理想的方法是无需预先衍生化即可直接进行脂质分子的分析。近年来脂质研究中兴起的一种方法是薄层色谱（TLC）与基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）联用技术14。
MALDI-TOF MS 因其对肽离子质量的高精度测定，被广泛应用于蛋白质组学研究中，用于鉴定蛋白质并将其与特定的氨基酸序列相关联 &#34;指纹&#34; 由胰蛋白酶消化的蛋白质生成15MALDI-TOF MS 还可用于分析其他生物分子类别，包括甘油三酯（TAGs）等脂质16-18基质辅助激光解吸电离（MALDI）需要使用基质，通常为含有芳香环和共轭双键结构的有机化合物。基质分子可将激光能量温和地传递给待分析物，促进质子转移，并生成单电荷的气相离子19-21离子在高真空条件下经高电压场作用被加速进入飞行时间（TOF）质量分析器，其中离子根据其质荷比决定的速度差异而实现分离。即使是非常大的生物大分子也可被电离且几乎不发生碎裂，从而产生单一电荷的分子离子物种，简化了质谱分析。MALDI-TOF MS 能够无需事先衍生化而直接分析脂质分子，因而被脂质组学研究广泛采用18.
本文介绍了一种常规方法，用于从东部红蝙蝠（Lasiurus borealis）的毛发、皮脂分泌物以及翼膜中分离和分析皮肤脂质。该方法可用于确定蝙蝠皮肤脂质的种间差异，从而阐明白鼻综合征（White-Nose Syndrome, WNS）的发病机制22。WNS 是一种由新近描述的嗜冷真菌Geomyces destructans引起的蝙蝠真菌性疾病23-25。该病已导致超过500万只北美洞栖蝙蝠死亡，并威胁到一些易感蝙蝠物种的生存，可能对农业产业造成数十亿美元的经济损失26,27。为了研究G. destructans感染过程中的变化，从东部红蝙蝠的毛发和翼膜组织中提取脂质，并通过薄层色谱法（TLC）将其分离为不同的主要脂质类别，以分离出甘油三酯（TAG）组分，随后采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）进行分析。TAG含有较短的酰基链，且在MALDI-TOF MS检测中信号明显，基质干扰小，易于检出。

<table><tbody><tr><td>丁基化羟基甲苯</td><td>MP Biomedicals, LLC</td><td>101162</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.mpbio.com&quot; target=&quot;_blank">www.mpbio.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>TLC 柔性板</td><td>Whatman</td><td>4410-222</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.whatman.com&quot; target=&quot;_blank">www.whatman.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>ACTH</td><td>Sigma-Aldrich Chem. Co.</td><td>A8346-5X1VL</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com&quot; target=&quot;_blank">www.sigmaaldrich.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>三油酸甘油酯</td><td>Sigma-Aldrich Chem. Co.</td><td>44895-U</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>TLC 脂质标准品</td><td></td><td>TLC 18-1</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.nu-chekprep.com&quot; target=&quot;_blank">www.nu-chekprep.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>MALDI TAG 标准品</td><td>Nu-Check Prep., Inc.</td><td>NIH Code 53B</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>MALDI TAG 标准品</td><td>Sigma-Aldrich Chem. Co.</td><td>17810-1AMP-S</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>带聚四氟乙烯盖的玻璃小瓶</td><td>U.S. National Scientific Co.</td><td>B7800-2</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.nationalscientific.com/&quot; target=&quot;_blank">www.nationalscientific.com/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>DHB</td><td>Sigma-Aldrich Chem. Co.</td><td>50862-1G-F</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>CHCA</td><td>Sigma-Aldrich Chem. Co.</td><td>C8982-10X10 mg</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Sebutape</td><td>CuDerm</td><td>S100</td><td>&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

通过制备型薄层色谱与基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析蝙蝠皮肤脂质中的三酰甘油成分

Profiling the Triacylglyceride Contents in Bat Integumentary Lipids by Preparative Thin Layer Chromatography and MALDI-TOF Mass Spectrometry

哺乳动物的皮肤附属器包含皮脂腺，可向皮肤表面分泌油性物质。皮脂的生成是先天免疫系统的一部分，对病原微生物具有防护作用。皮脂分泌异常及其化学成分改变也是某些皮肤疾病的临床症状。皮脂含有复杂的脂质混合物，其中包括具有物种特异性的三酰甘油。由于多种脂质类别表现出广泛的化学特性，阻碍了对皮脂成分的特异性测定。脂质分析技术通常需要进行化学衍生化处理，这类操作耗时费力，并增加样品制备成本。本文介绍如何从哺乳动物皮肤附属器中提取脂质，通过薄层色谱法分离主要脂质类别，并利用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱分析三酰甘油成分。该方法稳定可靠，可直接测定不同物种及个体间的三酰甘油谱型，且可便捷地应用于任何哺乳动物分类群。

Folch30描述的从组织中分离总脂质的提取方法是一种简单的操作流程，本文对此进行了适当调整。在组织提取并蒸发溶剂后，脂质通常呈现为淡黄色薄膜。这种黄色很可能来源于蛋白质污染物，可通过液-液萃取去除。但在本实验中无需进行额外的样品处理步骤，因为制备型薄层层析（TLC）能够将三酰甘油（TAG）组分与这些污染物分离开。在所有过滤步骤中加入新鲜的无水硫酸钠，有助于减少水分污染，从而确保脂质称重结果的准确性。
使用H:E:A作为流动相，通过制备型薄层色谱（TLC）对哺乳动物皮肤脂质进行分析时，通常可分离出四种不同的条带，分别对应于（从原点开始）甾醇、游离脂肪酸（FFA）、三酰甘油（TAG）以及甾醇酯/蜡酯/角鲨烯（图1）。在某些情况下，若采用高效分析型（HP）TLC并以H:E:A为流动相，甾醇酯、蜡酯和角鲨烯会彼此分离，呈现为三条独立的条带。在本研究采用的条件下，甾醇酯与蜡酯未被分开。如果需要对这些条带进行分辨，可将流动相更换为异辛烷:乙醚（95:5 v/v），并通过扫描光密度法对高效薄层色谱（HPTLC）板进行分析。其他因素也可能导致分离效果不佳。通过在展开槽中放置滤纸、在盖子上涂抹凡士林以确保密封性、前夜充分平衡展开槽，以及保持TLC展开槽的清洁，通常可消除这些问题，从而获得稳定且高质量的TLC分离结果和数据。
显示了从东部红蝙蝠中分离出的三酰甘油（TAG）的代表性基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF）图谱（见图2和图3）。这些图谱包含质荷比（m/z）在850–910范围内的TAG离子峰，该范围对于从非水生哺乳动物中分离的TAG具有典型性。添加1.0 M NaOH可促进形成比H+离子更稳定的单电荷Na+离子。除了提高稳定性外，H+和K+离子的缺失也使图谱分析更为简便。质荷比（m/z）850–910范围内的离子峰对应于TAG中主要的酰基组分，即16:0、18:0、18:1和18:2脂肪酸（FA）部分（见表1）。TAG可能的脂肪酸组分可初步通过MALDI-TOF质谱图中出现的总离子m/z值来确定，并据此推断不同物种和个体之间的差异。然而，若需获得酰基组分的具体比例，则必须使用串联质谱（MS/MS）或气相色谱（GC/MS）。通过观察图谱中二酰甘油区域的峰，可进一步推断酰基比例信息（见图4）。二酰甘油是由MALDI源中TAG发生碎裂而产生的，在m/z 590–650范围内可观察到。通过省略1.0 M NaOH的添加，可增强TAG的碎裂16。东部红蝙蝠的翼膜组织在m/z 879.7处呈现一个主导峰，而毛发组织的主导峰位于m/z 881.8（分别见图2和图3）。在毛发组织中，m/z 907.8、879.7和855.7（POP、PPoS）处的峰强度大致相等（约50%），而853.7处的峰强度约为40%。
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td fo:width="2in">组成</td>
			<td fo:width="1in">元素组成</td>
			<td fo:width="1in">观测质量</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na+TAGs</td>
			<td> </td>
			<td>Na+TAGs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSO</td>
			<td>C57H108O6</td>
			<td>911.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OOS, LSS</td>
			<td>C57H106O6</td>
			<td>909.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OOO, LnSS, LSO</td>
			<td>C57H104O6</td>
			<td>907.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LOO, LLS</td>
			<td>C57H102O6</td>
			<td>905.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LLO, OOLn</td>
			<td>C57H100O6</td>
			<td>903.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LLL</td>
			<td>C57H98O6</td>
			<td>901.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LLLn</td>
			<td>C57H96O6</td>
			<td>899.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LLnLn</td>
			<td>C57H94O6</td>
			<td>897.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LnLnLn</td>
			<td>C57H92O6</td>
			<td>895.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OSP</td>
			<td>C55H104O6</td>
			<td>883.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSP, OOP, SOPo</td>
			<td>C55H102O6</td>
			<td>881.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LOP, LnSP, LSPo</td>
			<td>C55H100O6</td>
			<td>879.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LLP, LnOP, LOPo</td>
			<td>C55H98O6</td>
			<td>877.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LnLP, LLPo, LnOPo</td>
			<td>C55H96O6</td>
			<td>875.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LnLnP, LnLPo</td>
			<td>C55H94O6</td>
			<td>873.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LnLnPo</td>
			<td>C55H92O6</td>
			<td>871.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PPS</td>
			<td>C53H102O6</td>
			<td>857.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POP, PPoS</td>
			<td>C53H100O6</td>
			<td>855.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OOM, PPL, PoPoS, POPo</td>
			<td>C53H98O6</td>
			<td>853.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PPLn, PPoL, PoPoO, MyOO</td>
			<td>C53H96O6</td>
			<td>851.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LLM, LnOM</td>
			<td>C53H94O6</td>
			<td>849.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PPP, SSLa</td>
			<td>C51H98O6</td>
			<td>829.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PPPo, OSLa</td>
			<td>C51H96O6</td>
			<td>827.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PPoPo, PMyO</td>
			<td>C51H94O6</td>
			<td>825.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LnLnLa</td>
			<td>C51H86O6</td>
			<td>817.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MMS, SLaP, PPM</td>
			<td>C49H94O6</td>
			<td>801.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SLaPo, PPoM, PPMy</td>
			<td>C49H92O6</td>
			<td>799.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PoPoM, OOCa</td>
			<td>C49H90O6</td>
			<td>797.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MMP</td>
			<td>C47H90O6</td>
			<td>773.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MMPo, OCaP</td>
			<td>C47H88O6</td>
			<td>771.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCaPo</td>
			<td>C47H86O6</td>
			<td>769.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MMM, PPCa, PMLa</td>
			<td>C45H86O6</td>
			<td>745.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PoPCa, PoMLa</td>
			<td>C45H84O6</td>
			<td>743.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PoPoCa</td>
			<td>C45H82O6</td>
			<td>741.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LaLaP, MMLa, MCaP</td>
			<td>C43H82O6</td>
			<td>717.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LaLaPo</td>
			<td>C43H80O6</td>
			<td>715.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OO</td>
			<td>C39H72O5</td>
			<td>643.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OL</td>
			<td>C39H70O5</td>
			<td>641.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LL</td>
			<td>C39H68O5</td>
			<td>639.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP</td>
			<td>C37H72O5</td>
			<td>619.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OP</td>
			<td>C37H70O5</td>
			<td>617.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LP</td>
			<td>C37H68O5</td>
			<td>615.5</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1. 三酰基甘油和二酰基甘油的钠加合物的脂肪酸组成、元素组成及同位素质量。 Ln=亚麻酸（18:3），L=亚油酸（18:2），O=油酸（18:1），S=硬脂酸（18:0），P=棕榈酸（16:0），Po=棕榈油酸（16:1），M=肉豆蔻酸（14:0），My=肉豆蔻脑酸（14:1），La=月桂酸（12:0），Ca=癸酸（10:0）。
<img alt="脂质的薄层色谱；甾醇分离；脂质谱图；生物化学分析。" src="/files/ftp_upload/50757/50757fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 使用正己烷:乙醚:乙酸（80:20:2 v/v/v）作为流动相进行广谱脂质类别分离的薄层色谱图。 位于甾醇和游离脂肪酸（FFA）之间的条带未通过标准品鉴定，但可能是脂肪醇或蜡质二酯。
<img alt="显示分子量峰分析的质谱图。" src="/files/ftp_upload/50757/50757fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 东部红蝙蝠（L. borealis）翼组织中钠加合三酰甘油（TAG）的 MALDI-TOF 质谱图在 m/z 700 - 950 范围内的扩展 TAG 区域。 在 m/z 853.7（OOM、PPL、PoPoS、POPo）和 m/z 879.7（LOP、LnSP、LSPo）处鉴定出峰。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50757/50757fig2large.jpg" target="_blank">点击此处查看高清大图</a>。
<img alt="质谱结果；光谱分析、峰强度、分子鉴定、化学分析。" src="/files/ftp_upload/50757/50757fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 
图3. 东部红蝙蝠（L. borealis）毛发组织中钠加合物三酰甘油（TAG）的MALDI-TOF质谱图扩展区域（m/z 700 - 950）。 在 m/z 905.8（LOO, LLS）和 m/z 907.8（OOO, LnSS, LSO）处鉴定出峰。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50757/50757fig3large.jpg" target="_blank">点击此处查看高清大图</a>。
<img alt="质谱图，显示分子离子峰的 m/z 值，用于蛋白质分析。" src="/files/ftp_upload/50757/50757fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 4"> 
图 4. 东部红蝙蝠（L. borealis）翼组织中钠化 DAG 片段的 MALDI-TOF 质谱图的 DAG 区域（m/z 530 - 730）。 在 m/z 643.5（OO）和 m/z 615.5（LP）处鉴定出峰。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50757/50757fig4large.jpg" target="_blank">点击此处查看大图</a>。

哺乳动物皮肤及其附属结构含有可溶剂提取的脂质，这些脂质可提供具有物种特征性的化学组成。本文介绍了一种常规方法，利用薄层色谱法分离自皮肤及其附属组织中提取的各类主要脂质，并通过基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱法测定其甘油三酯谱型。

哺乳动物的皮肤系统包含皮脂腺，可将油性物质分泌到皮肤表面。皮脂分泌是先天免疫系统的一部分……

本实验的总体目标是分离并鉴定蝙蝠皮脂分泌物中存在的甘油三酯成分。首先，在尽量减少污染和氧化的条件下，从皮肤组织中提取表面脂质组分。然后通过薄层色谱法分离脂质，以获得甘油三酯组分。现在使用仪器配套软件处理光谱数据，并利用在线化学数据库进行分析。最终，通过制备型薄层色谱和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法，确定实验组与对照组之间甘油三酯组成谱的差异。该方法可用于帮助鉴定在宿主-病原体相互作用中可能作为化学信号分子的分泌性脂质。尽管我们正在使用该方法研究白鼻综合征的临床症状，但该方法也可应用于其他哺乳动物系统，包括性信号研究或不同物种间乳汁成分的差异分析。在采集不同个体的组织样本之前及之间，均需使用甲醇彻底清洁所有仪器。从皮肤上剪取约一克毛发，置于125毫升的锥形瓶中。采集翼面皮脂样本。用氯仿-甲醇溶剂润湿棉球，擦拭皮肤，并将棉球放入单独的烧瓶中。现在用含有0.5% BHT的10毫升氯仿-甲醇溶液提取组织，以防止氧化，提取约两小时后加入约0.5克无水硫酸钠，通过滤纸过滤以收集溶剂。随后依次用1:1和1:2的氯仿-甲醇溶液重复提取。然后合并滤液，并在氮气流下蒸发合并的滤液。测定干重，并将脂质残留物溶解至浓度为10毫克/毫升。将样品储存于玻璃小瓶中，在零下20摄氏度条件下保存不超过一个月，以去除可能干扰后续质谱分析的塑化剂。用三至二比例的氯仿-甲醇填充1.5毫升微量离心管。然后用丙酮冲洗，并用空气干燥，将样品管储存于无尘容器中，并且仅戴手套操作这些管子，以防止皮肤油脂污染。通过先用三至二的氯仿-甲醇预展开，对薄层色谱板进行活化。向薄层色谱展开缸中加入溶剂，深度达1厘米。然后将薄层板放入展开缸中，使溶剂完全上升至板的顶端。取出薄层板，置于通风橱中干燥，直至溶剂完全挥发。然后在120摄氏度下加热平板至少10分钟。现在用铅笔在平板顶部做一标记。从平板底边向上1.5厘米处用直尺画一条铅笔线，作为标记样品和标准品加样位置的基线。接下来，剪取一张足够大的滤纸，以衬在薄层色谱展开槽的两个短边和一个长边上。将滤纸衬层插入展开槽中。倒入 100 毫升新配制的流动相溶剂，深度约为 1 厘米。在腔室的上边缘涂抹一层硅脂密封。盖上玻璃盖，平衡过夜。使用手动或自动加样器将样品以连续划线的方式接种。使用TLC板的外侧点样位置，点样约20微升的标准品混合物。将点样后的TLC板放入已平衡的展开室中。盖上盖子，展开至溶剂前沿到达板的顶端边缘。大约 45 分钟后，取出培养板，置于通风橱中使过量溶剂挥发。用 95% 乙醇中含 0.05% 碘化六G（rodine six G）的溶液喷雾。然后在长波长紫外灯下用铅笔观察脂质条带。标记样品和标准品中荧光条带的 RF 位置。拍摄照片记录。接着，识别与标签标准品相对应的条带。将其转移至一块较大的玻璃和滤纸，然后放入一个经过溶剂清洗的 1.5 毫升微量离心管中。向样品中加入 1 毫升氯仿-甲醇（3:2）溶剂，超声处理 1 分钟。通过离心沉淀二氧化硅，然后将溶剂转移至新的预称重试管中。重复一次 1 毫升的提取过程，合并滤液，然后在氮气流下蒸发溶剂。将含有标签的干燥残留物在避光条件下，用氮气保护，于 4 摄氏度保存，同时通过 TLC Rho Domine 分离其他组织样品。样品中含有六 G，但它在己烷中不溶，在样品溶解过程中被去除。在质谱分析前立即按照文本方案所述，配制 500 fmol/µL 的 A CTH 工作溶液和 10 mg/mL 的标签标准品溶液。同时，用90%甲醇配制0.5摩尔的DHB储备溶液，用于样品和标准品的基质。用铝箔包裹试管，避免光照。现在将10微升DHB基质、10微升样品或标准品以及5微升1摩尔的氢氧化钠溶液混合，短暂离心试管，使混合液聚集至底部斑点处。取1 µL标准样品或A CTH点样于MALDI不锈钢靶板上，置于干燥器中干燥。然后将靶板放入仪器中进行数据采集。在正离子反射模式下进行MALDI飞行时间质谱分析。使用 A CTH 和标签标准溶液，按照仪器制造商的说明对仪器进行调谐和校准。在靶板上点样各待测样品后，通过在线检索引擎 Lipid Maps 手动对 Aldi 谱图进行平滑处理并扣除背景，识别离子峰，将获得的谱图列表复制粘贴至前体离子列表及强度输入框中。将搜索范围限定为目标所需的 AAL 组成，根据各样品谱图中出现的离子的质荷比确定相应的标签。如果脂肪酸甲酯的百分比数据来自单独的气相色谱-质谱（GCMS）分析，则添加这些数据以获得标签的概率。采用高效吸附剂（HEA）作为流动相，通过制备型薄层色谱对哺乳动物皮肤脂质进行分析，通常可分离出四条明显的条带，分别对应于甾醇、游离脂肪酸（FFAs）标签、无菌酯蜡（EERs）和角鲨烯。这些多质量谱数据是通过对东部红蝙蝠中分离出的标签物质获得的。对于非水生哺乳动物的样品制备而言具有典型性。质谱图中包含质荷比在850至910范围内的离子峰。脂肪酸部分是AAL的主要成分和特征标记。通过观察光谱中 D 型 AAL 甘油酯区域的峰形，可以进一步推断 AAL 比例，这些峰代表了标签的碎裂。MALDI 谱图显示出三个不同的标签区域，其中主电荷比基于碳原子数目。中国台湾红蝙蝠翼组织在这三个区域的主电荷比分别为 853 0.7、79 0.7 和 907.8，呈现出显著的峰。请注意，在处理活体或已处死的蝙蝠时，必须获得这些动物在操作、储存和运输过程中所需的所有许可。此外，还必须获得所在机构动物护理与使用委员会以及机构生物安全委员会的批准。如果操作涉及活体蝙蝠或蝙蝠的神经组织，应确保所有操作人员均已接种狂犬病疫苗。此外，在处理某些浴场蝙蝠病原体（如 Geo MiSiS 蚂蚁）时，需要在生物安全二级实验室中进行操作。

profiling-triacylglyceride-contents-bat-integumentary-lipids

Research

科研

JoVE Journal

Chemistry

化学

用制备薄层色谱和MALDI-TOF质谱分析的三酸甘油酯含量的蝙蝠外皮血脂

通过一种简单且可靠的脂质谱分析实验，测定极性脂质提取物的组成以及单个甘油酯的脂肪酸组成。为此，采用薄层色谱法分离甘油酯，并对其酰基进行甲酯化反应。脂肪酰基甲酯通过气液色谱法进行定量分析。...

Arabidopsis thaliana 极性甘油酯谱型分析：薄层色谱法（TLC）联合气液色谱法（GLC）

我们介绍了用于研究Caenorhabditis elegans脂质储存的可靠生化与显微方法。一种快速、简便的固定-染色法可利用亲脂性染料尼罗红（Nile...

秀丽隐杆线虫中脂肪含量的生化与高通量显微评估

此前已有报道称，二蒽醇（DT；1,8-二羟基-9,10-二氢蒽-9-酮）可作为小分子组织成像的基质辅助激光解吸电离（MALDI）基质；本文提供了在超高清分辨率四极杆-傅里叶变换离子回旋共振（quadrupole-FTICR）仪器上，采用正离子模式MALDI-MS技术，利用DT对组织切片表面内源性脂质进行MALDI成像的实验方案 。...

使用二蒽醇作为基质在傅里叶变换离子回旋共振质谱仪上进行基质辅助激光解吸/电离成像

脂肪酸13C同位素异构体分析为研究无脊椎动物消费者营养级碳转移及脂质代谢提供见解

在爬行动物中，来自同种个体的皮肤脂质对性信号传递至关重要，并可能用于入侵物种的管理。本文描述了从蜕皮或完整个体中提取皮肤脂质、测定与分析总脂质质量，以及通过组分分离对脂质进行分离的实验方案。 通过...

化学分离、定量与爬行动物皮肤脂质的分离

本方案用于测定海水和生物样品中的脂质。滤液中的脂质采用氯仿提取，对于固体样品则使用氯仿与甲醇的混合溶液进行提取。脂质类别通过棒状薄层色谱结合火焰离子化检测进行测定，各类脂质含量之和即为总脂质含量。...

海洋样品中总脂质及脂质类别的测定

啮齿类动物组织的 shotgun 脂质组学

本实验方案的目的是为小组织（如 果蝇 脑组织，采用基质辅助激光解吸/电离（MALDI）质谱成像技术。...

快速脂质分析的样品制备 果蝇 利用基质辅助激光解吸/电离质谱成像技术研究大脑

本文介绍了一种通过稳定同位素标记，结合保留时间、迁移率和碎片化特征来筛选脂质结构的方法。...

示踪 从头合成 使用稳定同位素标记的液相色谱-传输区离子淌度-飞行时间质谱/质谱分析脂质

本方案描述了一种独特的临床方案，采用酚红线法采集人泪液样本，并结合基于液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）的工作流程，用于发现泪液脂质组学特征。该简单的甲基叔丁基醚（MTBE）/甲醇双相分离方法可实现快速泪液脂质提取，具有高回收率，适用于泪液生物标志物的发现。...

基于酚红棉线采样法用于生物标志物发现中非靶向泪液脂质组学研究

学习利用制备薄层色谱和MALDI-TOF质谱技术分离鉴定蝙蝠皮脂腺分泌物中的甘油三酯含量，分析脂质组成差异，揭示其在宿主病原体相互作用中作为化学信号的功能机制。该方法可应用于其他哺乳动物系统。

通过制备型薄层色谱与基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析蝙蝠皮肤脂质中的三酰甘油成分

探索更多视频