Name: 性别分层神经元培养物研究缺血性细胞死亡途径 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-09T19:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: 了解性别分层海马神经元培养物的制备方法，用于研究缺血性细胞死亡途径中的性别特异性信号机制。该方法通过胚胎第18天分离雌雄神经元，揭示神经科学中的性别差异。

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部分研究工作由 Walter S. 和 Lucienne Driskill 基金会及 NIH R01NS058792 项目资助。

本方案中的所有操作均根据美国国立卫生研究院关于动物伦理治疗与护理的指南以及经批准的IACUC动物使用方案进行。
1. 至少在解剖前一天完成组织培养皿、培养基和解剖器械的准备工作
<ol>
	<li>配制 1 L 硼酸盐缓冲液：在双蒸水（H2O）中加入 3.1 g/L 硼酸和 4.75 g/L 四硼酸钠（Borax），调节 pH 至 8.4。过滤除菌后，4 °C 保存备用。</li>
	<li>将聚-D-赖氨酸（poly-D-lysine）稀释至 0.1 mg/ml。
	<ol>
		<li>在层流式细胞培养超净台内，将适量稀释后的聚-D-赖氨酸加入多孔细胞培养板的每孔中，确保充分覆盖各孔底部。如需要，可在加入聚-D-赖氨酸前，先将预先清洁并灭菌的玻璃盖玻片置于各孔底部。加入聚-D-赖氨酸后盖玻片可能漂浮，必要时可用无菌镊子将其压下。</li>
		<li>将培养板在 37 °C 培养箱中孵育过夜。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>配制 1 L 解剖缓冲液：在无钙、镁、丙酮酸钠和酚红的 1× Hanks 平衡盐溶液中加入 350 mg/L NaHCO3、2.38 g/L HEPES、1.44 g/L MgSO4 和 300 mg/L BSA，调节 pH 至 7.3。过滤除菌后，4 °C 保存备用。</li>
	<li>配制 500 ml 铺板培养基：在无酚红的 MEM 培养基中加入 10% 胎牛血清、青霉素和链霉素各 100 单位/ml，以及 2.5 mM 谷氨酰胺。过滤除菌后，4 °C 保存备用。未使用的培养基超过 1 个月后应丢弃。</li>
	<li>配制 500 ml 换液培养基：在无酚红的 Neurobasal 培养基中加入 2% B-27 补充剂、青霉素和链霉素各 100 单位/ml，以及 2.0 mM GlutaMAX&#160;（非谷氨酰胺）。过滤除菌后，4 °C 保存备用。未使用的换液培养基超过 1 个月后应丢弃。</li>
	<li>根据标准方法，按需配制 10 ml 100 mM CaCl2、500 mM EDTA 和 1 M&#160;NaOH 溶液。</li>
	<li>对手术/解剖器械进行高压灭菌，并在无菌条件下保存备用。本操作所需器械包括：两把尖端极细的锐利弯头镊、一把细尖弯镊、一把带齿弯镊、一把小型鼠齿镊、一把显微外科剪、一把细窄尖外科剪、一把中等尖头剪，以及一根钝头解剖探针。可根据个人习惯增配其他无菌器械。</li>
</ol>
2. 解剖当天组织培养皿、培养基、解剖器械及解剖区域的准备
<ol>
	<li>清洗多聚-D-赖氨酸包被的组织培养板。在超净台内，用真空泵或移液器吸除多聚-D-赖氨酸，向每孔加入去离子水，室温孵育约 5 分钟。吸除水后，更换为新鲜无菌去离子水。重复此洗涤步骤 3 次。
	<ol>
		<li>将培养板置于室温下完全晾干。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备解剖区域：用 70% 乙醇擦拭实验台面和解剖显微镜。
	<ol>
		<li>将一张大号 Kimwipe 浸透 70% 乙醇，铺开已灭菌的解剖器械，并用另一张 Kimwipe 覆盖。</li>
		<li>取一个较大的平底容器装满冰。标记并准备适量的 60 mm 培养皿，加入冰冷的解剖液。准备足够数量的培养皿，以便分别存放雄性和雌性动物的头部、脑组织及海马体（如适用）。</li>
		<li>将两个较大的 100 mm 培养皿中装入冰冷的解剖缓冲液。</li>
		<li>另留一个 100 mm 培养皿不加缓冲液（保持干燥）。</li>
		<li>设置生物危害废弃物收集区和动物组织收集区（解剖结束后按照机构规定妥善处理）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将 30 ml 铺板培养基置于 37 °C 水浴中预热。该温热溶液将在后续细胞分离步骤中使用。</li>
	<li>向 24 孔多聚-D-赖氨酸包被的组织培养板的每孔中加入 1 ml 铺板培养基。若使用更小规格的培养板，则相应减少体积。将盖好盖的培养板放入 37 °C、5% CO2 的培养箱中，使其在解剖过程中预热并达到 CO2 平衡。</li>
	<li>配制木瓜蛋白酶（papain）溶液。
	<ol>
		<li>标记两个 15 ml 无菌锥形离心管，分别标注为 &#34;male&#34; 和 &#34;female&#34;。</li>
		<li>向每管中加入以下成分：10 ml 解剖缓冲液、150 μl 100 mM CaCl2、10 μl 500 mM EDTA、10 μl 1 M NaOH，以及 150 U 木瓜蛋白酶。</li>
		<li>轻轻翻转混匀 3 次，然后置于 37 °C 水浴中预热。注意：不同批次的木瓜蛋白酶其每毫克活性单位不同，因此加入溶液的木瓜蛋白酶体积可能因批次而异。木瓜蛋白酶初始状态呈浑浊，随着完全溶解，溶液将逐渐变澄清。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. E18 胚胎的收获、性别鉴定与解剖
<ol>
	<li>用异氟烷或其他合适的麻醉剂麻醉怀孕雌鼠。在深度麻醉下通过断头或颈椎脱位处死小鼠。</li>
	<li>迅速操作，用70%乙醇清洁雌鼠腹部。如有需要，可在喷洒乙醇前先剃除腹部毛发，以降低污染风险。用鼠齿镊提起腹部皮肤，用中号尖头剪刀在腹部做一较大切口，切开皮肤和腹肌，暴露内脏器官。</li>
	<li>小心取出胚胎，将整个子宫角从腹腔中完整提起，注意尽量避免其接触任何外部组织（以防污染）。将含有胚胎的子宫角放入盛有冷解剖生理盐水的培养皿中，并置于冰上。</li>
	<li>小心地从子宫角和胚胎囊中取出每只仔鼠。由于仔鼠较为脆弱，建议先在每个胚胎之间的子宫组织上剪开，暴露胚胎囊，再用小号窄头剪刀的边缘在囊表面小心划开一道切口。随后可轻轻推动胚胎囊，使胚胎液和仔鼠通过开口滑出，避免损伤胚胎。
	<ol>
		<li>若胚胎囊上的切口过小，导致液体和仔鼠难以顺利滑出，则应小心扩大切口，直至仔鼠可几乎无阻力地滑出。</li>
		<li>切勿用力挤压胚胎囊以强行推出胚胎，以免损伤胚胎。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>取一只胚胎，将其头部取下并置于盛有冷解剖生理盐水的培养皿中，置于冰上。将胚胎躯体背侧朝下放置于干燥的100 mM培养皿中，在解剖显微镜下操作。一手持中号弯头镊，另一手持锯齿状弯镊，轻轻将仔鼠展平，将后肢向下并向腹侧推，前肢向下并向背侧推。</li>
	<li>如有必要，用剪刀剪除尾部；尾部容易卷曲至腹部上方，可能妨碍解剖操作。</li>
	<li>松开后肢，用镊子夹住脐带根部（即脐部）并轻轻提起。松开前肢，用另一只手持显微剪，在脐部上方做一小的倒置&#34;v&#34;形切口，使&#34;v&#34;的尖端朝向头侧。</li>
	<li>再次换回弯头镊。将镊子翻转，使尖端朝上并远离动物。用闭合的弯头镊圆钝边缘轻轻向下并向背侧推动胸廓，同时用另一把镊子向下并向腹侧牵拉，将仔鼠从腹侧向背侧展开。此展开动作将打开腹腔，暴露肠管、肝脏及其他内脏器官。</li>
	<li>用弯头镊非常轻柔地以反复扫动的方式将肠管和肝脏向头侧推移。此操作将逐步暴露肾脏、膀胱，以及最重要的内部性器官。
	<ol>
		<li>雄性仔鼠可通过双侧肾脏下方出现的条纹状睾丸进行识别。睾丸大小约为肾脏的⅓至½，有时会下移至膀胱上方。</li>
		<li>雌性仔鼠最易通过缺乏睾丸来识别，也可通过位于膀胱上方的小型子宫以及向上延伸至肾脏方向的输卵管进行识别。在解剖显微镜高倍镜下，卵巢可被识别为输卵管末端的小型深色器官，位于双侧肾脏下方，有时位于肾脏下方。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>确定性别后，弃去躯体，将头部放入相应标记的培养皿中（雄性或雌性）。将头部在解剖液中保持于冰上。</li>
	<li>重复步骤3.5–3.10，直至所有仔鼠完成性别鉴定。为获得最佳效果，每次解剖后应用Kimwipe擦拭培养皿，避免残留液体使仔鼠打滑，难以抓握。</li>
	<li>在所有胚胎完成性别鉴定且雄性和雌性头部已分开放置后，继续进行后续解剖操作，特别注意始终保持雄性和雌性来源的组织分离。</li>
	<li>将单个脑组织转移至盛有冷解剖缓冲液的100 mM培养皿中。在解剖显微镜下，用弯头镊刺穿胚胎眼部以固定样本。用显微手术剪在正中线做一浅表切口，从枕骨基部至鼻腔上方的头部顶端，沿正中线切开皮肤和颅骨。</li>
	<li>轻柔地向两侧推开皮肤和颅骨，用显微手术剪的底部或闭合的斜头镊从大脑前部向脑干方向小心刮取，轻柔取出脑组织。
	<ol>
		<li>用镊子小心将取出的脑组织转移至盛有冷解剖缓冲液的洁净、标记好的培养皿中。将培养皿置于冰上。</li>
		<li>重复此过程，直至所有脑组织均被采集。</li>
		<li>此步骤应获得两板分别盛放于解剖缓冲液中的完整脑组织，分别对应雄性和雌性组织。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在解剖显微镜下放置一洁净培养皿，并加入解剖缓冲液。加入的液体量应足以在整个海马体解剖过程中保持脑组织湿润；液体过多会导致脑组织漂浮，难以操作。如有需要，可预先在解剖皿底部涂一层无菌石蜡。石蜡可提供防滑操作表面，并保护精细解剖工具的尖端；在未涂层的皿底刮擦可能使工具边缘弯曲或变钝。</li>
	<li>将解剖显微镜调至高倍镜模式，并相应调整焦距。一次小心转移一个脑组织至解剖皿中。用超细头镊轻轻分离两侧大脑半球，并从脑干上夹下。</li>
	<li>非常小心地去除每个半球的脑膜。（脑膜为粉红色富含血管的膜状结构，是神经元培养中胶质细胞污染的常见来源。）
	<ol>
		<li>去除脑膜时，应轻柔地夹住、提起并牵拉膜组织，注意避免刺破下方的脑组织。</li>
		<li>将脑膜从脑组织上拉离，允许脑组织在镊子下轻微滚动，但保持其位置固定，以便完整剥离膜组织。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>此时可根据需要进一步解剖脑组织以获取目标区域。&#160;例如，从每个半球中分离海马体。将一个半球外侧朝下放置，观察较大的脑室腔，其形成覆盖海马体的瓣状结构。轻柔地将此瓣状结构向后剥离，直至可见新月形的海马体。海马体略为隆起，位于中脑与皮层之间。</li>
	<li>使用两对锋利的超细镊，一手固定大脑半球，另一手用显微剪将海马体从皮层和中脑上剪下。
	<ol>
		<li>将海马体放入正确标记的培养皿（雄性或雌性）中，皿内盛有解剖缓冲液并置于冰上。</li>
		<li>从剩余半球中分离海马体，并对每个脑组织重复此过程。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将海马体转移至相应标记的15 ml圆锥形离心管中。
	<ol>
		<li>用冷解剖缓冲液轻柔清洗两次。此步骤需非常小心使用真空抽吸。海马体体积小，易被真空吸走而无法找回。为避免此情况，应让组织充分沉降至管底，用移液器尽可能吸出液体，弃去废液，再加入新鲜、洁净的解剖缓冲液。</li>
		<li>重复步骤3.20.1。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 神经元解离
<ol>
	<li>将海马体转移至已做好适当标记并预热的木瓜蛋白酶溶液中，放入37 °C水浴中孵育8-10分钟，每隔2-3分钟轻轻颠倒离心管混匀一次。</li>
	<li>从水浴中取出木瓜蛋白酶混合液及组织，静置使组织沉降，然后用移液器小心吸除尽可能多的木瓜蛋白酶溶液，保留管底的组织。用铺板培养基洗涤组织3次&#160;。铺板培养基中的血清可终止木瓜蛋白酶的酶消化作用。若铺板培养基中未添加血清，则需使用胰蛋白酶抑制剂。</li>
	<li>去除铺板培养基。
	<ol>
		<li>加入2 ml&#160;新鲜的Neurobasal培养基，使用5 ml移液管以最低速度轻柔地吹打组织进行解离。</li>
		<li>通过轻柔吹打8次完成组织解离。注意避免在溶液中引入气泡。为获得最佳效果，应将溶液和组织吸入移液管后，将液体沿锥形管管壁缓慢释放，使组织沿管壁滑落回管底。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第8次吹打后，静置使组织沉降，收集上层浑浊的液体，此液体中含有已解离的细胞。
	<ol>
		<li>将浑浊液体转移至新的、已标记的离心管中。</li>
		<li>向未解离的组织中再加入2 ml培养基。</li>
		<li>再次吹打8次。</li>
		<li>收集浑浊液体。</li>
		<li>重复此过程3-5次。部分未解离组织可能仍然存在。虽然可继续吹打直至所有组织完全解离，但过度吹打会导致神经元活力下降，因此不推荐。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>根据需要向锥形管中添加额外培养基，以平衡雄性和雌性组织之间的体积和重量。将细胞在摆动桶离心机中以228 × g离心5分钟，小心吸除上清液。</li>
	<li>用2 ml新鲜铺板培养基轻柔重悬细胞，并通过细胞滤网过滤至洁净、已标记的50 ml锥形管中。</li>
	<li>取50 μl细胞悬液加入450 μl 0.4%台盼蓝溶液中。将细胞在台盼蓝中孵育2分钟，轻柔混匀后取10 μl加入血细胞计数板。计数时排除摄取台盼蓝染料的细胞；呈深蓝色的细胞为死亡或濒死细胞。</li>
</ol>
5. 铺板与培养物维持
<ol>
	<li>计算将细胞悬液加入组织培养板各孔所需的正确体积，以达到目标细胞密度。神经元培养对细胞密度非常敏感，除非与胶质细胞共培养或使用胶质细胞条件培养基喂养，否则在中等至高密度下培养效果最佳。本方案中，细胞接种密度为 150,000–200,000 个细胞/cm²2.</li>
	<li>从培养箱中取出预先加入铺板培养基的细胞培养板（见上述第2步准备）。
	<ol>
		<li>轻轻涡旋混匀50 ml离心管中的细胞悬液，然后用移液器将所需体积的细胞悬液（按上述步骤5.1计算）加入每孔的中央。</li>
		<li>重复操作，每次移液前需轻轻涡旋混匀细胞悬液，以确保各孔中细胞密度均一。细胞沉降迅速，若省略涡旋步骤，可能导致各孔间细胞密度不一致。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>待细胞加入各孔后，轻轻摇晃培养板以分散细胞，随后立即将培养板放回培养箱中。细胞培养至少24小时，期间避免扰动。</li>
	<li>至少 24 小时&#160;接种细胞后，将完全神经基础培养基预热至 37 °C。吸除每孔中的接种培养基，并替换为预热的喂养培养基。每次仅吸除并更换一个孔的培养基，以最大限度减少对神经元的应激，提高细胞存活率。</li>
	<li>神经元培养物应每4-7天换液一次，操作时小心移除一半培养基，并补充等体积的新鲜培养基。在该条件下，培养物可维持两周。在原代神经元培养过程中，部分细胞死亡属于正常现象。因此，随着培养时间的延长，细胞密度会逐渐降低。本方案中，细胞密度在第10天时约下降30%。 体外.</li>
</ol>

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作者无任何披露信息。&#160;

将雄性和雌性海马体分别进行分离、解离并单独培养的性别分层原代解离海马神经元培养体系，为研究神经元死亡中的性别特异性细胞信号传导提供了一种有效的工具。尽管神经科学家普遍使用原代神经元培养技术，但不同实验室的实验方案会因其特定的实验目标和研究兴趣而有所不同。许多研究人员选择将神经元与胶质细胞共培养，可以采用混合培养的方式，也可以将神经元接种在预先建立的星形胶质细胞层上并用玻璃盖玻片悬浮。据认为，星形胶质细胞可分泌有利于神经元在培养中存活的生长因子。然而，为了简化实验体系，本研究所描述的方案获得的神经元培养物基本不受胶质细胞影响（胶质细胞污染少于10%）。
不同实验室在获取海马体所用胚胎的年龄上也存在差异，同样，各实验室在采集脑部区域的选择上也不尽相同。本方案采用 E18 胚胎进行解剖。其他常用的胚胎年龄包括 E15-16。E18 胚胎比更年轻的胚胎体积更大，更容易判断性别并进行解剖操作。此外，E18 胚胎已经经历了第二次性类固醇激素的激增（约在 E16-17 时期），这一过程被认为可使雄性和雌性大脑发生男性化或女性化。由较年长胚胎制备的培养物中，对缺血反应的性别特异性差异可能更为显著，...

哺乳动物具有性二态性，雄性和雌性表现出不同的性状和特征。这种性别差异甚至延伸到大脑，并体现在神经元对损伤和疾病的易感性上（详见文献1-5）。例如，男性大脑对由中风或心脏骤停后复苏引起的缺血性神经元损伤更为敏感（详见文献6）。帕金森病（详见文献7）和精神分裂症（详见文献8）在人类男性中的发病率高于女性，而人类女性大脑则对阿尔茨海默病（详见文献9）以及抑郁症等情绪障碍（详见文献10）表现出更高的易感性。尽管在神经元损伤和疾病易感性方面存在明显的性别差异，但目前大多数治疗方案并未考虑性别因素，男女的治疗方法基本相同。如果能够充分认识并考虑这些性别差异，可能会取得更好的治疗效果。
在体 神经损伤和疾病的动物模型表现出与人类相似的性二型性，对于增进我们对性别差异及其如何影响神经元存活与功能的理解至关重要。例如，已有证据表明，雄性啮齿类动物比雌性更容易受到缺血性神经元损伤的影响。11-15这种差异被认为至少部分依赖于睾酮（主要的男性性类固醇激素）和雌激素（主要的女性性类固醇激素）的分子信号传导。通过对去势的雄性和雌性啮齿类动物的研究发现，睾酮及其代谢产物双氢睾酮（DHT）会加重脑缺血后的神经元损伤，而雌激素则减轻该损伤12-14,16-18然而，新生期和成年动物的脑缺血均存在性别差异19,20新生儿会经历雌激素或睾酮的激增 在子宫内 发育过程中存在，但在出生后至青春期前激素水平相对较低（综述见21因此，性激素的有无并不是影响神经元对损伤易感性的唯一决定因素。事实上，在发育过程中形成的性二态性可能导致细胞信号传导及对缺血反应的差异，即使在激素水平较低的情况下也是如此。
无论性别差异是依赖于性类固醇激素的存在，还是源于发育过程中建立的两性异形，随着研究的深入，越来越多的证据表明，大脑中男性与女性之间的细胞信号传导存在差异。在科罗拉多大学医学院Herson实验室，我们已鉴定出其中一种差异：我们发现，一种可通透钙、钠和钾离子的离子通道TRPM2（详见综述于22,23），在缺血性损伤后诱导神经元细胞死亡 体内 在雄性小鼠中而非雌性小鼠中24我们证明，在雄性小鼠中，TRPM2 的药理学抑制或基因敲低具有保护作用，但在雌性小鼠中则无此效应。 体内 脑中动脉闭塞（MCAO）卒中模型24.
尽管它们具有实用性， 体内 缺血性神经元损伤的动物模型有时可能因难以或无法特异性地靶向神经元进行研究，而在神经元死亡的分子机制研究中存在局限性。因此，本实验室采用原代分离培养的皮层或海马神经元 体外 以补充我们的 体内 工作。原代分离神经元培养是研究神经元损伤和疾病中细胞信号通路的有用工具。培养中的神经元可维持在严格控制的环境中，可选择性地加入或去除胶质细胞的影响。在无胶质细胞的情况下，培养中观察到的任何反应均来源于神经元本身。药理学试剂可直接施加于培养体系，无需考虑其通过血脑屏障的吸收问题，从而可特异性地抑制或激活特定信号转导通路中的成分。分子生物学技术可用于过表达或敲低各种目标蛋白，同时可在单细胞水平进行电生理记录，而这些操作在整体动物模型中是无法实现的 体内 模型系统
赫森实验室通过在制备原代分离神经元培养物前首先对所用胚胎进行性别鉴定，拓展了该培养方法的应用价值。按性别分层的雄性和雌性神经元培养结果显示，雄性神经元在经历氧糖剥夺后，其神经元细胞死亡的易感性明显高于雌性神经元25. 氧气和葡萄糖剥夺是一种被公认的方法 体外 神经缺血模型中，缺血会减少大脑的氧气和葡萄糖供应。此外，我们通过对分离的、按性别分层的神经元进行电生理实验表明，TRPM2在雄性神经元中被激活，而在雌性神经元中则未被激活24,26我们目前正在研究TRPM2活性的分子性别特异性调控因子24,26在此，我们分享并讨论建立按性别分层的原代胚胎离体海马神经元培养的实验方案，并展示采用该方法获得的代表性数据，结果表明DNA修复酶PARP-1以类似于TRPM2的性别特异性方式参与缺血性细胞死亡。PARP-1可被氧化应激引起的DNA断裂所激活（综述见27,28当DNA损伤较小时，PARP-1活性可增强细胞存活；但当损伤过大时，PARP-1活性升高会加剧细胞死亡。PARP-1产生聚腺苷二磷酸核糖（poly-(ADP)ribose），后者是TRPM2通道的已知激活剂。28-31，一些证据表明，在氧化应激条件下，PARP-1 在雄性而非雌性大脑中优先被激活32,33因此，我们推测PARP-1在雄性中激活TRPM2，但在雌性中不激活，从而在缺氧和缺糖条件下诱导神经元细胞死亡。

<table><tbody><tr><td>B27 补充剂</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>硼砂</td><td>Sigma</td><td>71997</td><td></td></tr><tr><td>硼酸</td><td>Sigma</td><td>B6768</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma</td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Invitrogen</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Invitrogen</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>谷氨酰胺</td><td>Invitrogen</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>HBSS，无钙、无镁、无酚红</td><td>Invitrogen</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>MEM，无谷氨酰胺、无酚红</td><td>Invitrogen</td><td>51200-038</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal，无谷氨酰胺、无酚红</td><td>Invitrogen</td><td>12348-017</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Invitrogen</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>多聚-D-赖氨酸，分子量 70,000-150,000</td><td>Sigma</td><td>P0899</td><td></td></tr><tr><td>0.4% 台盼蓝</td><td>Invitrogen</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>仪器设备</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5/45 斜头镊</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #7 &amp;ndash; 细弯镊</td><td>Fine Science Tools</td><td>11274-20</td><td></td></tr><tr><td>锯齿状镊（London 镊）</td><td>Fine Science Tools</td><td>11080-02</td><td></td></tr><tr><td>超细 Graefe 镊，1×2 齿</td><td>Fine Science Tools</td><td>11153-10</td><td></td></tr><tr><td>Moria 弹簧剪</td><td>Fine Science Tools</td><td>15396-00</td><td></td></tr><tr><td>中型手术剪</td><td>Roboz Surgical</td><td>RS-6812</td><td></td></tr><tr><td>超细显微解剖剪</td><td>Roboz Surgical</td><td>RS-5880</td><td></td></tr><tr><td>24 孔组织培养板</td><td>Fisher</td><td>87721</td><td></td></tr><tr><td>细胞滤器，40 &amp;micro;m 尼龙网</td><td>BD Biosciences</td><td>352340</td><td></td></tr></tbody></table>

用于研究缺血性细胞死亡通路的性别分层神经元培养

Sex Stratified Neuronal Cultures to Study Ischemic Cell Death Pathways

长期以来，人们观察到神经元对缺血性损伤和神经退行性疾病的易感性存在性别差异，但介导这些差异的信号机制仍不明确。原代分离的胚胎神经元培养为研究缺血或疾病导致细胞死亡过程中的神经元细胞信号通路提供了一个简化的实验模型；然而，目前研究中使用的大多数神经元培养物均为混合性别的细胞。研究人员可以在混合性别神经元培养模型中检测性类固醇激素处理对神经损伤和疾病的影响，但越来越多的证据表明，雌性大脑对雄激素、雌激素和孕酮的反应与雄性大脑不同。此外，新生雄性和雌性啮齿动物对缺血性损伤的反应也不同，雄性在脑缺血后遭受的损伤比雌性更严重。因此，混合性别的神经元培养可能会掩盖或混淆实验结果，导致重要信息被遗漏。基于此，科罗拉多大学医学院的Herson实验室常规制备来自海马和皮层的按性别分层的原代分离胚胎神经元培养物。在收获脑组织前对胚胎进行性别鉴定，并将雄性和雌性组织分别分离、接种和培养。利用该方法，Herson实验室已证明离子通道TRPM2在缺血性细胞死亡中具有雄性特异性作用。在本论文中，我们分享并讨论了对胚胎小鼠进行性别鉴定以及制备按性别分层的海马原代分离神经元培养物的实验方案。该方法可适用于制备按性别分层的皮层培养物，且胚胎性别鉴定方法也可与其他实验方案结合使用，适用于任何认为性别可能是结果重要决定因素的研究。

正确鉴定小鼠胚胎的性别是制备按性别分层的原代神经元培养物的关键步骤。为确保雄性和雌性海马体来自正确鉴定性别的幼鼠并分别培养，需按性别分离胚胎，并分别采集其皮层和海马组织。根据标准操作流程，从每只胚胎的采集组织中提取基因组DNA，并注意保持性别分离。使用针对雄性特异性基因SRY和通用标记肌源性生成素（Myog）的引物进行聚合酶链式反应（PCR）（图1）。SRY即Y染色体上的性别决定区，负责睾丸形成，常被用作性别鉴定的分子标记。我们观察到，Myog存在于所有检测的雄性和雌性脑组织中，而SRY基因仅存在于经性别鉴定为“雄性”的胚胎组织中，在鉴定为“雌性”的组织中则未检测到SRY基因。
使用PJ34对PARP1进行药理学抑制可对源自雄性胚胎的原代海马神经元培养物中的缺氧缺糖（OGD）损伤产生神经保护作用，但对源自雌性胚胎的培养物无保护作用（图2）。由PARP1基因敲除小鼠制备的雄性神经元培养物同样对OGD诱导的细胞死亡具有抵抗性。在野生型雄性神经元中，联合使用TRPM2通道抑制剂2-APB和PJ34并未进一步增强对OGD的...

原代分离的胚胎海马神经元培养物可用于研究神经元死亡过程中涉及的信号传导机制。在分离和解离海马组织之前对胚胎进行性别鉴定，可制备出分别来自雄性和雌性的培养物，从而使研究人员能够识别并研究性别特异性的细胞信号通路。

缺血性损伤和神经退行性疾病中神经元易损性的性别差异早已被观察到，但其信号转导机制……

本实验的总体目标是制备按性别分层的海马区原代解离神经元培养物。实验的第一步是在胚胎第18天对胚胎进行性别鉴定并解剖，以获得按性别分层的原代神经元培养物。下一步是从神经组织中制备相应的神经元。最后一步是在适当的密度下接种神经元，并进行培养以用于实验。最终，该方法结合其他实验方案，可用于任何认为性别可能是结果重要决定因素的研究。该方法有助于回答性别研究领域中的关键问题，例如雄性和雌性啮齿类动物对神经元缺血的反应是否存在差异。在多个必需的准备工作当中，有一些值得回顾，例如组织培养板的制备。将多聚赖氨酸稀释至0.1毫克/毫升。然后在超净工作台中，用稀释后的多聚赖氨酸充分覆盖多孔培养板各孔的底部，该多孔板为经组织培养处理的无菌板，于37摄氏度孵育过夜。第二步，务必用70%乙醇擦拭解剖区域、台面和显微镜。第三，用冰填充一个大的平底盘并贴上标签，同时准备足够数量的60毫米培养皿，内装冷解剖液，用于分别保存雄性和雌性头部的脑组织及海马体。此外，准备两个较大的100毫米培养皿，内装冷解剖缓冲液。第四，准备两支15毫升无菌离心管。将其中一个试管标记为雄性，另一个标记为雌性，并向每支试管中加入适当体积的解剖缓冲液。在收获E18胚胎时，需小心地将每只幼鼠从子宫角和胚胎囊中取出。由于幼鼠较为脆弱，应仔细剪开每个胚胎之间的子宫组织，以暴露胚胎囊。然后用小型细剪刀的边缘在囊表面非常小心地切开。随后可轻轻将胚胎液和胚胎经切口推出，避免损伤胚胎。解剖幼鼠时，使用弯头镊子，以反复扫动的动作轻柔地将肠道和肝脏向头侧推开。这将逐渐暴露肾脏的膀胱，以及最重要的内部性器官。在确定胎儿性别时，必须轻柔解剖，以免扰动极为脆弱的内部性器官。雄性幼崽可通过位于肾脏下方的条纹状睾丸来识别。睾丸的大小约为肾脏的三分之一到二分之一，有时会下移至紧靠膀胱上方。雌性个体最明显的特征是缺乏睾丸，此外还可通过位于膀胱上方的小型子宫以及向上延伸至肾脏的输卵管进行识别。在更高倍镜下，卵巢可辨认为位于输卵管末端的小型深色器官，紧邻肾脏下方，有时位于肾脏下方，以便采集脑组织。将颅骨分开后，轻轻将皮肤和颅骨拨开。然后使用显微外科剪刀的底部或闭合的弯头镊子，从端脑向脑干方向小心地轻轻刮取，极为轻柔地取出脑组织。使用镊子小心地将取出的脑组织转移至一个装有冷解剖缓冲液的洁净、已标记的培养皿中。将培养皿置于冰上。重复此操作，直至所有脑组织均被采集完毕。此步骤应得到两块置于解剖缓冲液中的完整脑组织切片，分别用于雄性和雌性组织。在解剖海马体之前，需极其小心地从每个半球上剥离软脑膜，该膜为富含血管的粉红色膜状结构。轻轻捏住、提起并拉起脑膜，注意不要刺破下方的脑组织。然后将脑膜从脑组织上剥离。大脑在镊子下可能会轻微滚动，但应保持在原位。随后可根据所要培养和研究的脑区，对小鼠脑组织进行解剖。将解剖好的脑组织放入正确标记的培养皿中，培养皿内应含有解剖缓

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Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

用于研究缺血性细胞死亡途径的性别分层神经元培养

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本视频展示了一种离体（ex vivo）诱导由细胞毒性 CD8+ T 细胞介导的脑细胞死亡的技术。在获取脑切片后，将活化的、靶向少突胶质细胞的 CD8+ T...

一种通过少突胶质细胞特异性CD8+ T细胞诱导神经元死亡的离体技术

双侧颈动脉阻断联合全身性低血压可在大鼠中诱导全脑缺血，导致海马区出现可重复的严重损伤。动物模型表现出可预测的脑损伤模式，恢复迅速，且死亡率相对较低。...

双血管阻断/低血压：大鼠全脑缺血模型

我们建立了一种脑切片模型，可用于研究兴奋性毒性介导的脑损伤所涉及的分子机制。 该技术可获得具有活性的成熟脑组织，在部分保留神经元回路、细胞间相互作用及突触后区室的同时，减少了实验所需的动物数量。...

脑微切片的兴奋性毒性刺激作为一种方法 体外 卒中模型

本研究介绍了一种从野生型新生小鼠中分离神经元的技术。该方法需要从新生小鼠中仔细解剖出脊髓，随后通过机械和酶解消化的方式将神经元从脊髓组织中分离出来。...

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本方案描述了一种从6-7日龄幼鼠中分离和培养原代小鼠大脑颗粒神经元（CGNs）的简单方法，可高效转导CGNs以进行功能缺失和功能获得研究，并利用同一培养模型模拟NMDA诱导的神经元兴奋性毒性、低钾诱导的细胞死亡、DNA损伤以及氧化应激。...

建立小鼠原代小脑颗粒神经元的神经元死亡与变性模型

本文介绍了一种制备成人人类脑组织游离式脑片培养的实验方案。该方案是广泛使用的膜插件脑片培养法的一种改进，操作简便且成本较低，适用于开展旨在揭示与年龄相关脑疾病中神经退行性变机制的短期检测实验。...

成人脑组织短期游离式脑片培养

器官型脑片培养是研究神经发育或变性/再生过程的有力工具。本文描述了一种在小鼠小脑脑片培养中模拟浦肯野细胞神经发育性死亡的实验方案。该方法可能有助于神经保护药物发现领域的研究。...

浦肯野细胞在离体小脑切片培养中的存活

本文介绍一种利用特定培养基的简单方法，可从胚胎皮层高效且可重复地建立富含神经元和星形胶质细胞的培养物，或神经元-胶质细胞共培养物。...

一种用于研究缺血过程中神经元-胶质细胞相互作用的细胞培养模型

研究神经元雪崩（即具有时空尺度不变性的活动爆发）的一种可靠方法，可反映大脑皮层中临界状态动力学特征。在培养的皮层浅层发育过程中，雪崩会自发出现，从而可在精确控制的条件下，利用平面集成多电极阵列（MEA）对神经活动进行长期测量。...

器官型培养中神经元雪崩的多电极阵列记录

了解性别分层海马神经元培养物的制备方法，用于研究缺血性细胞死亡途径中的性别特异性信号机制。该方法通过胚胎第18天分离雌雄神经元，揭示神经科学中的性别差异。

用于研究缺血性细胞死亡通路的性别分层神经元培养

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