隔离和幼稚的CD4 T细胞的Th17细胞分化

该程序的总体目标是区分 TH 17 细胞和幼稚 CD 4 阳性 T 淋巴细胞。这是通过首先从成年 C 57 black six 小鼠身上收集淋巴结和脾脏来实现的。在第二步中，研磨组织以获得单细胞悬液。

然后将 CD 4 阳性 CD 25 阴性 T 细胞分离并在 TH 17 诱导或活化对照条件下培养。最终，Q-P-C-R-E-I-S-A 和流式细胞术可用于评估 IL 17 A 的表达。因此，该方法可以深入了解 C 57 black 6 小鼠中 CD 4 T 淋巴细胞分化为 T 8 17 细胞的过程。

它也可以应用于其他小鼠模型。这种方法的演示至关重要，因为淋巴结非常小，使解剖步骤变得困难。在没有直接观察该方法的情况下，在添加细胞前至少四个小时，用 30 微升在无菌 PBS 中稀释的抗 CD 包被新的 96 孔 UBO 微量测试组织培养板的孔中，轻敲板的侧面以确保孔的均匀覆盖，然后在 4 小时后在 37 摄氏度下孵育板， 冷藏板，直到需要添加细胞。

确认颈椎脱位死亡后，用 70% 乙醇对成年 C 57 black six 小鼠的切口区域进行消毒。然后抓住尿道口前方的皮肤，从腹侧中线切开到下巴区域，注意不要打扰腹膜。接下来固定皮肤，以便进入淋巴结和脾脏进行切除。

现在去除胸肌后面小鼠腋窝附近发现的腋窝淋巴结，并将组织放入含有 5 毫升 AutoMax 跑步缓冲液的培养皿中。然后去除位于每个腋窝附近结缔组织中的肱淋巴结。接下来，去除在动物颈部发现的颈浅淋巴结，位于气管两侧，然后去除位于三条血管交界处髋部区域的腹股沟淋巴结。

要进入肠系膜淋巴结，首先通过腹膜内膜切开腹侧中线。肠系膜淋巴结位于小鼠肠系膜深处，通常呈 4 到 8 个淋巴结的串状，可能表现为一串珍珠。取出脾脏，将其从胰腺中拉出。

然后将其与淋巴结一起放入培养皿中以研磨器官。将淋巴结放在一张显微镜载玻片的磨砂面上，然后用第二张载玻片的磨砂面摩擦组织。要将研磨器官过滤成单细胞悬液，首先将一块大约 3 英寸 x 3 英寸的 40 微米尼龙材料折叠数次，然后将其放在 15 毫升离心管的顶部。

使用配备 21 号针头的 5 毫升注射器吸出细胞和缓冲液，然后将细胞溶液缓慢分配到折叠的尼龙中。注意避免用针刺穿材料。一旦获得单细胞悬液，溶液应看起来一致，没有可见的实体组织碎片。

将此溶液置于冰上。通过 AutoMax 分离将细胞分选至至少 80% CD 后，4 个 CD 阳性 25 个阴性细胞纯度。通过 trian 蓝色排除对细胞进行计数，然后在细胞培养基中将细胞悬液稀释至每毫升 6 个细胞的 1 倍 10 至 6 个细胞。

现在用 200 微升 PBS 冲洗抗 CD 三涂层板的所有孔。每个都将洗涤液丢弃到废物容器中。然后将 100 μL TH 17 诱导混合物或活化对照混合物一式三份加入适当的孔中。

最后，向每个孔中加入 100 μL 细胞，并将细胞孵育至少 72 小时或长达 5 天，以实现 Eli SA 和 QPCR 的 TH 17 细胞分化。孵育期后，将每个样品的一式三份混合到单独的 einor管中。离心细胞后，将上清液转移到单独的 einor 管中并储存在零下 20 摄氏度，以便稍后测量 ELI 产生的 IL 17 A。

A.To 制备 QPCR，去除上清液后重悬，将剩余的沉淀物放入 175 μL，RNA 裂解缓冲液中立即提取 RNA，或储存在零下 80 摄氏度，直到孵育期后准备开始程序。为了在 IL 17 之前准备细胞活化，将每个 TH 17 诱导或活化对照细胞的细胞内染色池一式三份放入 24 孔细胞培养板的各个孔中。向每个孔中加入 400 μL 细胞培养基。

要使总体积达到 1 毫升，然后向每个孔中加入 PMA 离子、霉素和费登 A，并在 37 摄氏度下孵育细胞 4 小时，以通过细胞内染色和流式细胞术检测 IL 17 A 的存在。首先，将细胞从 24 孔板的每个孔转移到单独的 eior 管中。然后旋转管子。

去除上清液，将细胞沉淀重悬于 200 μL 传真缓冲液中。将重悬的细胞转移到 96 孔流式细胞仪板中，在 200 微升传真缓冲液中洗涤沉淀后再次旋转细胞，将细胞重悬于 100 微升传真缓冲液中，并加入 100 微升细胞外抗体染色混合物。在室温下避光孵育 15 分钟。

洗涤细胞两次后，将沉淀在 100 微升 BD 细胞中孵育。在室温下将覆盖在铝箔纸中的细胞烫缓冲液固定 20 分钟。现在在 100 μL 的 1 X BD 渗透洗涤缓冲液中洗涤细胞两次，然后在室温下将细胞在 50 μL 覆盖在铝箔纸的细胞内抗体混合物中孵育 15 分钟。

再次洗涤细胞后，将细胞悬浮在 200 微升 BD 染色缓冲液中，然后将细胞转移到含有 200 微升染色缓冲液的流式细胞术管中。将试管储存在 4 摄氏度，直到它们准备好读取用于活细胞群上样品第一门的流式细胞分析。接下来，使用活细胞群对 CD 4 阳性 CD 8 阴性群体进行门控。

最后，从 CD 4 阳性 CD 8 阴性群体对 IL 17 A 阳性群体进行步态分化 TH 17 细胞，必须为普通的混合淋巴结和脾细胞富集为 CD 4 阳性 CD 25 阴性 T 细胞群。在该图中，显示了用抗 CD 4 和抗 CD 25 染色的未分级混合淋巴结细胞、SP 细胞和 AutoMax 分离的 TT 细胞组分。第一个散点图显示了未分级汇集淋巴结和脾细胞中存在的 CD 4 阳性、CD 25 阳性和 CD 4 阳性 CD 25 阴性淋巴细胞百分比的代表性概况。

分离程序还提供了一个富集的 CD、4 阳性 CD 25 阳性 treg 群体，可用于其他实验。在这个最终的散点图中，显示了 84%CD 4 阳性 CD 25 阴性 T 细胞群体的所需细胞富集。如图所示，这种富集的 CD 4 阳性 CD 25 阴性 T 细胞群有助于确保更成功的 TH 17 分化。

而 CD 4 阳性 CD 25 阴性 T 淋巴细胞与抗 CD 3 和抗 CD 28 孵育 5 天产生 CD 25 阳性 T 淋巴细胞，在 TH 17 诱导条件下孵育产生 CD 4 阳性 CD 25 阳性淋巴细胞的 IL 17 亚群。TH 17 分化状态可以通过定量 PCR 进一步评估，Elis A 此处来自富集 CD 4 阳性 CD 25 阴性 T 淋巴细胞在对照或 TH 17 诱导条件下孵育的数据显示 CD 4 阳性。在 TH 17 条件下孵育的 CD 25 阴性 T 淋巴细胞上调 IL 17 A，这可以通过 QPCR 和 ELI SA 确定。TH 17 特异性转录因子 ROAR γ T 也被 CD 上调，四个阳性 CD 25 阴性 T 细胞在 TH 17 诱导条件下孵育，可通过 QPCR 测量。

在参加此程序时，重要的是要记住在 TH 17 诱导条件下孵育细胞之前，要达到至少 80% CD 4 阳性 CD 25 阴性细胞纯度。看完这个视频，你应该对如何从C 57黑六只小鼠中解剖淋巴结和脾脏，如何在T 8 17或活化对照条件下孵育细胞，以及如何评估幼稚CD四T淋巴细胞向T 八17细胞南分化的情况有了很好的了解。