基于细胞介电谱的特发性脊柱侧弯预后预测细胞检测方案

以下实验的总体目标是通过细胞介电谱技术，检测外周血单个核细胞（PBMC）对G蛋白偶联受体（GPCR）激活的反应性，从而根据患者的功能分组来预测特发性脊柱侧凸的预后。该目标通过在植物血凝素（PHA）存在下培养PBMC以扩增细胞数量来实现。细胞扩增在试管中完成，并保持倾斜状态。

第二步，用骨桥蛋白（OSTEOPONTIN 或 OPN）处理细胞，以增强或抑制 GI 蛋白的活性。根据治疗后的患者情况，将细胞悬液转移至微孔板中。接着，用 GI 或 GS GPCR 激动剂刺激细胞，以测定由此产生的阻抗变化。

该结果提供了所有孔的动态反应，随后基于阻抗变化对整合反应进行定量。该技术的意义远不止于简单的诊断。因此，我们首次能够在早期检测出有发展为脊柱侧弯风险的症状前患者，现在通过明确哪些人将发展为脊柱侧弯以及其所处的阶段，我们可以为其提供新的治疗方法。

与现有的X射线照射等方法相比，该技术的主要优势在于无需测量covid且无健康风险，即可预测骨病性脊柱侧弯的预后。最新进展是，该技术现在将由我们的研究助理Nita Franco操作，解冻外周血单个核细胞的冻存 aliquot，置于37摄氏度水浴中。使用无菌移液器将细胞悬液转移至含有15毫升完全培养基的50毫升离心管中，并进行离心。

细胞吸走上清液，然后用1毫升PHA培养基轻轻重悬细胞沉淀，并用相同的培养基补足体积至20毫升，松开管盖以允许空气进入。将试管置于37摄氏度的二氧化碳培养箱中过夜培养，使静止期淋巴细胞转化为快速增殖的淋巴母细胞。

完全拧紧管盖，通过离心沉淀细胞。用吸液法去除上清液。在1 mL完全培养基中轻轻悬浮细胞沉淀。

用相同的培养基补足体积至20毫升，松开管盖，过夜培养以扩增细胞数量。用10毫升RPMI 1640培养基洗涤两次后，将细胞沉淀轻轻重悬于600微升RPMI 1640培养基中。使用自动细胞计数仪和细胞活力分析仪测定细胞浓度和细胞活力。

然后加入适量的 RPMI 1640 培养基，调整细胞浓度至每 20 微升含 1.5 × 10⁵ 个细胞。将 100 微升细胞悬液转移至两支无菌的 1.5 毫升离心管中。向其中一支试管中加入重组骨桥蛋白，使其终浓度为 0.5 微克/毫升。

向第二个管中加入等体积的PBS。使用设定为100微升的无菌移液器，通过吹打两次，轻轻混匀每种条件。接下来，向96孔板的每个孔中加入5微升RPMI 1640，将板在200 ×g下离心3分钟，以去除任何气泡，并将细胞从管转移至微孔板。

轻轻吹打混悬液1次，以确保细胞均匀悬浮。未处理细胞每孔接种40微升细胞悬液，四复孔；ROPN或PBS处理细胞每孔接种40微升，设两复孔。将细胞培养板置于超净台中静置5分钟，使细胞休息并均匀沉降至孔底。

为了优化OPN培养的效果，将细胞在37摄氏度的二氧化碳培养箱中培养18小时，随后将培养物在室温下平衡约30分钟。在此期间，准备1毫升含有100微摩尔浓度的生长抑素和异丙肾上腺素的RPMI 1640培养基。通过向相应的孔中加入20微升溶液，填充化合物板。

用可固化密封膜覆盖化合物板。将移液吸头和化合物板装入基于CDS的系统中。在基于CDS的仪器软件中为该板命名。

转到方案列表并选择适当的方案以启动该方案。点击开始。集成流体系统将同时向所有孔中加入化合物。

基于CDS的系统在化合物加入后自动收集15分钟内的数据，所有样品的细胞活力均具有可比性，其数值稳定在86%至96%的范围内。相比之下，细胞数量则表现出显著差异。在使用的32个样品中，有两个样品的细胞数量不足，因而未进行分类。本示例展示了根据GI与GI信号通路之间失衡程度进行的功能分类。

评估OPN在胃肠道刺激下的效应发现，患者353和371的反应增强。相反，在ROPN处理后，患者345和382的反应降低了超过50%，患者370的反应降低了不到50%。因此，根据我们的分类标准，可将患者353和371归为FG一型，患者345和382归为FG二型，患者370归为FG三型。

同时，对所有患者对胃肠道蛋白刺激的反应性进行筛查，并与对照组受试者进行比较。结果显示，所有患者的反应性均低于对照组受试者。被归类于相同功能组的患者表现出相似水平的最大反应程度。

在圣朱斯蒂娜医院专科门诊定期随访的大样本SC患者分类结果显示，三种功能组的分布情况相似。在中度病例中，功能组二占主导地位；在重度病例中亦以功能组二为主。观看本视频后，您将充分掌握如何利用细胞介电谱技术将患者分为两个或三个功能组。