热诱导抗原修复：一种在成年海马神经发生过程中检测与鉴定前体细胞类型的高效方法

本实验的总体目标是对海马脑组织进行抗原修复，以更清晰地观察产生新生神经元的前体细胞类型。该过程首先从经灌注的小鼠脑组织中取出海马，切取薄的冠状切片，并将这些切片贴附于专为牢固黏附组织而设计的载玻片上。第二步是将载有组织的载玻片与抗原修复液共同煮沸，并留出足够时间使其充分冷却。

接下来，用一抗对组织进行过夜孵育染色。第二天的最后一步是进行二抗染色，孵育时间至少为两小时。最终，通过延时成像或共聚焦显微镜观察海马组织在成体神经发生过程中不同发育阶段的各种前体性别细胞类型。

您好，我叫Hun Jo，是博士后，隶属于梅奥诊所Ian John博士实验室的成员。John实验室的主要研究方向是探究神经发生过程在神经及精神疾病中的作用。我们的最终目标是将这些知识成功转化为治疗应用。接下来将演示抗原修复操作流程的是Quam Hui，以及来自我们实验室的John。

与现有的免疫组织化学方法相比，本技术的主要优势在于能够有效可视化成年海马神经发生过程中的不同类型细胞。这些细胞类型包括难以检测的前体神经干细胞，而利用我们的抗原修复方法可实现高效标记和可视化。该方法将有助于深入理解成年海马神经发生过程中新生神经元的发育及其调控机制。

对于精神疾病及其药物治疗研究感兴趣的研究者，我们的抗原修复方法将有助于探讨该疾病发病机制中神经元发育的作用。开始实验时，将灌注小鼠的脑组织置于含有4%多聚甲醛的10毫升锥形管中，在4摄氏度下固定过夜，即至少12至24小时，但不超过36小时，以完成充分固定。过夜固定后，去除PFA，将脑组织保留在锥形管中。

接着，用30%蔗糖冲洗脑组织以去除残留的PFA，并弃去蔗糖溶液。然后再次向离心管中加入30%蔗糖，于4°C保存，直至脑组织沉至管底。随后，在切片机上将海马体切成40 µm的脑切片。

将组织切片保存在抗冻液中，直至准备进行免疫组织化学实验。然后将切片贴附到专为牢固黏附组织而设计的显微镜载玻片上。切片贴附后，让载玻片干燥约10分钟。

若将载玻片斜靠在纸巾上的垂直表面，可加快干燥速度，以确保彻底去除先前的化学物质。载玻片干燥后，用PBS洗涤3次，每次5分钟。然后再次使其干燥。

在此步骤中，根据随附文稿中的描述配制用于组织煮沸的溶液。接着，在标准微波炉的标准设置下将溶液煮沸五分钟。煮沸完成后，小心地将容器从微波炉中取出。

随后，将干燥的载玻片转移至溶液中。确保含有海马组织切片的一侧完全浸入溶液。如果可能，将载玻片倾斜靠在容器壁上，并将其他载玻片围绕其放置。

然后在标准设置下，将混合物与载玻片一起在微波炉中煮沸七分钟。在此期间，准备两个冰桶，各装入半桶冰。煮沸完成后，将容器从微波炉中取出，并放入其中一个冰桶中。

将另一个桶中剩余的冰全部倒入容器周围，并完全覆盖容器。之后，静置一小时。一小时后，从容器中取出载玻片。

用 TBST 缓冲液洗涤三次，每次五分钟。接下来，将切片在避光条件下干燥五到十分钟，或直至切片完全干燥。在此期间，准备含有去离子水的容器，用于过夜一抗孵育。

切片干燥后，使用疏水性画笔在组织切片周围画出轮廓。该轮廓可作为屏障，防止抗体混合液溢出。随后在 T-B-S-T-T 中配制一抗混合液。

将干燥的载玻片放置于染色盒的载物台上。缓慢加入500微升一抗溶液，确保完全覆盖载玻片表面。随后盖上染色盒以避光，室温孵育过夜。次日，用TBST缓冲液洗涤载玻片，每次5分钟，共洗涤三次。

之后，在避光条件下干燥。现在用T-B-S-T-T缓冲液配制二抗混合液，然后将干燥的载玻片放入染色盒中。

加入500微升二抗。二抗孵育完成后，缓慢覆盖染色盒，室温下避光孵育至少两小时。随后用TBST缓冲液洗涤切片三次，每次五分钟。切片避光干燥后，加入封片液。

小心地用盖玻片覆盖，以避免引入任何气泡。然后将载玻片避光保存至少两小时，再进行后续分析，或对染色组织进行延时成像或共聚焦分析。成年海马神经发生显示于齿状回颗粒下区。

一种被激活的、类似放射状胶质细胞的I型干细胞在分化、成熟并以复杂形态功能整合到神经环路中的过程中，会经历不同的阶段。每个阶段及其相应的细胞类型均可根据其特定标记物组合的表达情况进行识别。MCM2是一种增殖标记物，在所有有丝分裂的前体细胞类型中均有表达，而Nestin则在放射状和非放射状胶质样干细胞中表达。

当II型A类前体细胞分化时，巢式表达首先关闭。TBR2的表达在有丝分裂后前体细胞中增加，MCM2表达则丢失，而DCX和NEUN的表达决定了细胞向功能性神经元的迁移与成熟过程。这是一张具有代表性的共聚焦图像，显示紫色MCM2、绿色Nestin和红色DAPy染色结果。

方框中的放大图像显示了一种表达 nestin、MCM2 和 DAPI 的放射状胶质样前体细胞。此处为一张代表性共聚焦图像，显示蓝色为 MCM2，红色为 TBR2，绿色为 DCX，灰色为 DAPI。方框中的放大图像展示了 2 型 B 前体细胞类型的特征性染色，该细胞表达 MCM2、TBR2、DCX 和 DAPI。

在进行该操作时，需牢记以下三点：第一，使用灌注良好且固定充分、冠状面厚度合适的组织；第二，将组织平整地贴附于载玻片上，并在操作过程中避免任何损伤。

最后，第三步是留出足够的时间进行抗原修复过程中的煮沸及后续冷却。完成此步骤后，可进一步开展其他方法，如共聚焦组织重建和行为学实验，以探究新生神经元如何整合到海马神经回路中并参与认知功能等更多科学问题。观看本视频后，您应能够充分掌握如何对海马组织进行抗原修复，从而更有效地可视化在海马神经发生过程中产生新生神经元的各类前体细胞类型。