一种将高传递率附加体阵列快速整合到 C. elegans 基因组的实验方案

本实验的总体目标是利用紫外照射将转基因染色体外阵列整合到秀丽隐杆线虫基因组中。首先，选择传递率最高的转基因品系，理想情况下应高于80%。随后，对所选的转基因L4幼虫进行紫外照射，从每个选定的F1培养皿中挑出四只具有荧光的转基因F2个体。接着，对F2培养皿进行筛选，获得100%具有荧光的转基因后代。

三只线虫。最终挑选F三代中的荧光动物，可显示出转基因100%的遗传率。该实验方法特别适用于能够以高频率传递额外染色体阵列的转基因品系。

本实验操作将由本实验室的技术员 Stephanie Belman 进行示范。取500个大型培养皿，其中含有线虫生长培养基，每个培养皿接种0.3毫升饱和的大肠杆菌（E. coli）菌液。

OP 50 培养。评估每条转基因品系的转基因整合传递率。在荧光体视显微镜下，挑选 10 只具有荧光的成年个体，分别转移到 10 个独立的培养板中进行培养。

将线虫置于适宜其遗传背景繁殖的温度条件下进行培养。每天观察后代，以评估共注射标记物在哪个发育阶段表达，并确定使用荧光显微镜观察的最佳时机。通过计算具有荧光的后代所占百分比，评估该标记物的遗传传递率。

对于转基因整合，选择具有最高传递率的转基因品系。获得一群在L4幼虫阶段同步化的转基因动物。进行整合时，挑选30只荧光阳性GRA成虫，转移到五个培养板中。

将线虫在15摄氏度条件下产卵3至4小时后，检查每个培养皿中是否至少有30枚卵，随后移除成虫，并将培养物置于线虫培养箱中继续培养，直至子代发育至L4幼虫阶段。取含有15至20只荧光转基因L4幼虫的每个培养皿，移除皿盖后放入紫外交联仪中，对线虫进行照射处理以诱导突变。将照射后的线虫在15摄氏度条件下过夜培养。

检查我们手中存活的动物数量。为达到高效的辐照效果，存活率应维持在约80%至90%。将经辐照的动物在15至25摄氏度下培养，直至其子代发育至可观察共注射标记表达的发育阶段。

将单个荧光F1代动物转移至独立的培养皿中。将这些F1代培养皿置于15至25摄氏度条件下培养，直至其子代发育至适合观察荧光F2代动物的阶段，具体阶段取决于所使用的共标记。在本实验中，我们观察成虫阶段的线虫，并丢弃所有仅产生一个或无子代（表明F1代动物不育或已死亡）或仅产生两个或极少数荧光F2代动物（表明F1代动物未以预期频率传递转基因）的F1代培养皿。

从每个选定的 F1 平板中挑取四只荧光转基因 F2 动物。使用荧光转基因时，应挑选荧光信号较强的 F2 蠕虫，因为这可能表明这些动物对整合的基因阵列呈纯合状态。请注意，在挑取 F2 动物时，关键是要避免带入卵或幼虫，以防止下一步出现假阴性结果。

在培养F二代动物后，对F二代培养板进行筛选，寻找100%呈现荧光的转基因F三代线虫。该筛选过程较为快速，因为只要发现单个非荧光线虫，即可弃置该培养板。从选定的培养板中单独挑取八只荧光线虫，以确认转基因的100%遗传率。如有可能，保留多个独立的整合型转基因品系。

对两个以大致相同频率传递染色体外阵列的不同品系进行了外源基因的整合。通过比较标准方案与改进方案，发现改进方案优化了每条整合品系所需的时间和培养板数量。接下来，我们验证了以下假设：在未整合品系中，较高的外源基因传递率有助于外源基因更易整合到基因组中。

利用改进后的方案，针对传递率不同的品系整合了一个特定的转基因，并筛选出传递率最高的品系。仅从90只筛选的F1代动物中即获得了三个整合品系，而传递率为50%至60%的转基因品系则从110只筛选的F1代动物中获得了一个整合品系。通过该流程，可进一步采用不同方法回答其他科学问题，例如确定基因表达水平、表达模式及调控机制、蛋白质定位与过表达，或开发亚细胞标记物。