将高传输率的染色体外阵列整合到秀丽隐杆线虫基因组中的快速方案
December 9th, 2013
该方案描述了一种快速且低材料消耗的程序，用于使用紫外线 （UV） 照射将转基因染色体外阵列整合到秀丽隐杆线虫基因组中。此外，该方案特别适用于以高速率传输染色体外阵列的转基因系。
该程序的总体目标是使用紫外线照射将转基因额外染色体阵列整合到 serratus elegance 基因组中。首先，选择具有最高透射率的转基因系，理想情况下大于 80%，然后紫外线照射选定的转基因 L 四只幼虫，从每个选定的 F1 板中挑选出荧光转基因 F 中的四只动物。下一个筛选，F 两个板用于 100% 荧光转基因。
F 三个蠕虫。最终挑选 F 三代的荧光动物可以显示转基因的 100% 遗传。这种实验方法非常适合以高速率传输额外染色体阵列的转基因系。
演示该程序的是我们实验室的技术人员 Stephanie Belman。从 500 个包含线虫生长的大培养皿开始。培养基：用 0.3 毫升饱和 isia 大肠杆菌填充每个板。
OP 50 培养物。评估每个转基因品系要整合的转基因品系的传播率。在荧光立体镜培养下，将 10 个荧光重力成虫挑选到 10 个单独的培养板上。
蠕虫培养箱中的动物设置为允许遗传背景繁殖的温度。每天监测后代以评估共注射标志物的表达，并且可以最好地使用荧光渗透镜观察。通过确定荧光后代的百分比来评估后代的传播率。
对于转基因整合，请选择传播率最高的转基因品系。获得在 L 4 幼虫阶段同步的转基因动物种群。为了整合，将 30 个荧光 GRA 成体挑选到 5 个培养板上。
蠕虫在 15 摄氏度下产卵 3 到 4 小时后，用板检查是否存在至少 30 个卵，然后从板中清除成虫，在蠕虫培养箱中培养动物，直到后代达到 L 4 幼虫阶段。将含有 15 至 20 只荧光转基因 L 4 只动物的每块板放入 UV 交联剂中，取下盖子，照射蠕虫进行回收。将辐照的蠕虫在 15 摄氏度下孵育过夜。
检查我们手中活着的动物数量。大约 80% 到 90% 的存活率适用于高效照射。在 15 至 25 摄氏度下培养受照动物，直到后代达到发育阶段，从而可以观察共注射标志物的表达。
将单个荧光 F1 动物转移到单独的培养板上。将这些 F1 板保持在 15 至 25 摄氏度，直到后代达到观察荧光 F 两种动物的适当阶段，具体取决于所使用的辅助标记。在这个特殊情况下，我们观察到蠕虫作为成虫丢弃所有 F1 板，显示一个，没有后代，表明 F1 动物不育或死亡，或者两个没有，或只有少数荧光 F 2 动物表明 F1 动物没有以预期的速率传递转基因。
从每个选定的 F1 板中挑选出 4 只荧光转基因 F 2 只动物。当使用荧光转基因时，选择 F 两个具有高荧光水平的蠕虫，因为这可能表明这些动物是整合阵列的纯合子。请注意，在挑选 F 两只动物时，关键不要随身携带鸡蛋或幼虫，以避免下一步出现假阴性。
培养 F 2 动物后，筛选 F 2 板的 100% 荧光转基因 F 3 蠕虫。筛选非常迅速，因为存在单个非荧光蠕虫表明应该扔掉板，从选定的板中挑选出 8 只荧光 F 3 只动物，以确认转基因的 100% 遗传。如果可能，保留几个独立的整合转基因菌株。
将转基因整合到两个不同的系中，以大致相同的频率传递额外的染色体阵列。使用标准方案和改进的方案，每条集成线所需的时间和所需的板数在改进的方案中得到优化。接下来，我们检验了这样一个假设，即在非整合品系中较高的转基因传播率使转基因更容易整合到基因组中。
使用最高传播系的改进方案，将一种特定的转基因整合到以不同速率传输的系中。仅从 90 只选定的 F1 动物中回收了 3 个整合系，而对于以 50% 至 60% 传输的转基因系，从 110 只选定的 F1 动物中回收了 1 个整合系。按照此程序，可以执行不同的方法来回答其他问题，例如确定基因表达、模式和调控、蛋白质定位和蛋白质过表达或亚细胞标志物的开发。
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概述
本协议描述了一种快速且低材料消耗的程序，用于将转基因染色体外阵列整合到秀丽隐杆线虫基因组中，方法为使用紫外线（UV）照射。该方法特别适用于以高率传递染色体外阵列的转基因系。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 遗传学
- 转基因学
背景
- 转基因生物对于研究基因功能至关重要。
- 染色体外阵列可以促进基因表达。
- 紫外线照射是一种用于整合遗传物质的方法。
- 高传递率对于成功的实验至关重要。
研究目的
- 开发一种将转基因阵列整合到秀丽隐杆线虫中的协议。
- 提高转基因传递的效率。
- 为研究人员提供一种低材料消耗的方法。
使用的方法
- 选择具有高传递率的转基因系（理想情况下大于80%）。
- 对选定的L4幼虫进行紫外线照射。
- 筛选F2板上的荧光转基因蠕虫。
- 通过选择荧光F3代动物确认遗传。
主要结果
- 成功将转基因阵列整合到基因组中。
- 观察到高率的转基因遗传。
- 协议显示出高效率和低材料使用。
- 荧光筛选使转基因系的识别变得容易。
结论
- 该协议有效用于创建稳定的转基因系。
- 紫外线照射是一种可行的遗传整合方法。
- 这种方法可以适用于各种转基因应用。
常见问题
Executive Industry Relevance
This protocol enables rapid generation of stable transgenic C. elegans lines with 100% transgene transmission, addressing a key bottleneck in target validation where mosaic expression and variable inheritance confound phenotypic screening. By improving integration efficiency in high-transmission strains, it supports mechanistic de-risking of gene function studies and accelerates lead identification pipelines requiring consistent transgene expression. The low material consumption and scalability make it suitable for enterprise-scale assay development and preclinical model generation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through stable, nonmosaic transgene expression in C. elegans.
- Operational Value: Reduces ambiguity in phenotypic screening by eliminating variable transgene transmission rates.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by providing reliable readouts for gene expression pattern and regulation studies.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces validated biological systems with uniform transgene inheritance for downstream compound evaluation.
- Operational Value: Standardizes assay readiness through 100% fluorescent F3 progeny screening, ensuring reproducibility.
- Scalability: Enables rapid generation of multiple independent integrated lines from a single UV irradiation step.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports disease-relevant system development by enabling subcellular marker creation and protein localization studies.
- Preclinical Model: Facilitates risk-adjusted advancement decisions through consistent overexpression models.
- Mechanistic De-risking: Clarifies pathway validation by eliminating transgene transmission variability as a confounding factor.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical validation, specifically enabling reliable transgene-dependent assays.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification via stable transgene integration in high-transmission lines.
- Screening: Delivers assay-ready systems with quantitative fluorescent outputs for compound screening campaigns.
- Analytics: Provides binary readout (100% fluorescent F3) for go/no-go decisions on transgene integration success.
- Translational Research: Connects to biomarker development through subcellular marker generation and protein localization studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for generating multiple independent transgenic strains per target.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through elimination of mosaic expression and variable transmission.
- Operational Value: Standardization and scalability via low-material UV irradiation and rapid F3 screening.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions and capital efficiency by reducing failed transgenic line generation.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization through reliable transgene transmission metrics for advancement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in C. elegans handling, fluorescent screening, and UV irradiation safety protocols.
- Depends on access to UV crosslinker and fluorescent stereoscope for co-injection marker visualization.
- Necessitates cross-team standardization on transmission rate thresholds (>80%) for line selection.
- Involves adaptation considerations for different co-injection markers and transgene expression patterns.
- Practical limitation: Integration efficiency remains strain-dependent, requiring prescreening for high-transmission lines.
