具体的感觉神经元的人群离子通道的表达研究鉴定

该程序的总体目标是通过逆行染料标记来识别传入神经元，并使用膜片钳电生理学和免疫化学研究这些神经元中的离子通道。这是通过首先将 DAI 注射到靶组织中以标记支配传入神经元来实现的。第二步是从背根神经节中分离传入神经元。

接下来，对标记的神经元进行膜片钳以记录门控离子通道，最后一步是使用免疫化学识别标记神经元中表达的离子通道。最终，使用膜片、钳和免疫化学的组合，我们能够识别传入神经元中离子通道的表达模式和功能特性。与其他现有方法相比，这种方法的主要优点是它是一种非侵入性方法，我们使用的 DAI I 以其被神经元末梢快速吸收而闻名。

神经元之间缺乏转移，我们注射的神经元内缺乏长期滞留。演示该程序的是我和我们实验室染料注射的研究技术员 Stephanie。首先，使用电动剃须刀剃掉麻醉大鼠两条腿上小腿区域的毛发。

接下来，用 200 微升 1.5% Dai 溶液填充一个 CC 无菌注射器。将针头平行于每块胃肌的长轴缓慢插入，并在从肌肉中拔出针头之前将 100 微升 dai 注入肌肉。向后拉注射器柱塞，确保染料不再从尖端流出。

等待 10 秒，然后从肌肉中拔出针头。染料分布需要 4 到 5 天才能为解剖做好准备。将装有 10 毫升 HBSS 的烧杯、一个 35 毫米培养皿和一个 100 毫米培养皿放在冰上。

接下来，称取 7 毫克胶原酶、1 毫克 DNA 和 10 毫克胰蛋白酶预热，将振荡水浴加热至 37 摄氏度，并在浴中加热含有 10 毫升 EBSS 的 15 毫升离心管。在解剖前对大鼠实施安乐死后，迅速切开动物背部的皮肤。然后去除沿脊柱的结缔组织和肌肉组织，以获得更好的暴露效果。

随后，切除脊柱的腰部。接下来，将分离的椎柱放入 100 毫米培养皿中。使用无菌牧场移液器涂抹冷冻的 HBSS 溶液，以保持制剂湿润和寒冷。

从脊柱两侧切开肌肉。进行背椎板切除术，使用咬合器或剪刀轻轻去除骨头并闭合包含背根神经节的凹槽。反复。在此过程中应用冰冷的 HBSS。

在显微镜下，通过切割周围神经和中枢神经来分离 DRG，留下 1 到 2 毫米的神经以方便处理神经节。然后将分离的 DRG 放入含有冰冷的 HBSS 缓冲液的 35 毫米培养皿中。重复这些程序，直到所有 L 4 和 L 5 DRG 都被分离出来。

使用微型剪刀和镊子去除多余的神经和血管。切开 DRG 以更好地暴露于酶，但不要将 DRG 鞘入鞘以进行 DRG 神经元解离。将酶添加到温热的 EBSS 培养基中，然后涡旋溶解并过滤灭菌。

接下来，将所有 DRG 放入带有无菌牧场管头的酶溶液中。之后，用 95% 氧气和 5% CO2 将培养瓶鼓泡 60 秒，然后盖紧培养瓶盖上。然后将培养瓶在 37 摄氏度振荡水浴中以 240 RPM 的速度孵育 60 分钟。

在孵化结束时大力。在无菌条件下摇动培养瓶 50 次以解离 DRG。向培养瓶中加入 5 ml MEM plus 以停止酶活性。

将培养瓶内容物转移至无菌 15 mL 离心管中，以 16 倍 G 离心 6 分钟。然后，去除并丢弃上清液。用移液管轻轻向样品中加入 5 毫升 MEM plus。

为了打破沉淀重复离心步骤，取出并丢弃上清液，加入 500 微升 MEM，并用移液管上的 1 毫升移液器吸头轻轻研磨，以制备细胞悬液。之后，将涂有聚赖氨酸的玻璃盖玻片放入一个空的、无菌的 35 毫米培养皿中。然后将一滴细胞悬液添加到盖玻片的中心。

重复此过程，直到细胞溶液耗尽。将 35 毫米培养皿放入 37 摄氏度和 5%CO2 的培养箱中 1 小时，让神经元在一小时后粘附在盖玻片唇上。在每个培养皿中额外加入 2 毫升培养基，并将其放回培养箱中进行膜片钳记录。

首先，使用具有落射荧光的显微镜鉴定染料标记的 DRG 神经元。接下来，用内部溶液填充玻璃电极。轻轻拍打以去除任何残留的气泡。

然后将电极放入电极支架中。使用微型机械手将电极降低到电池上。一旦电极接触到电解池，通过抽吸管轻轻抽吸，直到形成紧密密封。

然后将膜电压钳制在所需的保持电位。通过施加更强的吸力获得全细胞膜片钳配置。要去除电极尖端的膜贴，一旦建立了全细胞膜片钳配置，就开始记录。

在此过程中，用 4% 对位甲醛将神经元固定在盖玻片上一小时。然后用 2% 吐温 20 的 PBS 溶液渗透神经元 10 分钟。接下来，将细胞在封闭溶液中孵育 1 小时。

将测试细胞在封闭溶液和一抗中孵育过夜。将对照组神经元在没有任何一抗的封闭溶液中孵育过夜。第二天，用 PBS 缓冲液洗涤盖玻片 3 次，每次 5 分钟，然后用 1%吐温 20 洗涤两次，每次 5 分钟，以去除未结合的一抗。

然后将检测和对照盖玻片与适当的荧光标记二抗孵育 30 分钟，该二抗与一抗结合以实现可视化。之后，用 PB S3 清洗盖玻片，每次 5 分钟，以去除多余的二抗。接下来，使用安装介质将盖玻片安装在干净的载玻片上。

然后将透明指甲油涂抹在盖玻片的边缘以将其固定到位。干燥后，使用荧光显微镜随附的软件观察神经元并捕获图像。这是 Dai 注射到胃肌中并从肌肉逆行运输到 DRG 的表现。

此处标记了 L 4 和 L 5 DRG。传入神经元显示在明场图像中，该荧光图像显示了一种染料标记的肌肉传入神经元。该直方图显示了感觉神经元的 DII 荧光强度。

大峰来自未标记的神经元，并拟合高斯方程以确定平均强度和标准偏差。垂直虚线表示 DAI 标记的阈值。直方图包含来自 1047 个神经元的数据，其中 167 个神经元用 dai 标记。

这是一个具有代表性的肌肉传入神经元，膜电压控制良好。左侧显示负 20、-10 和 0 毫伏时的钠电流，右侧显示电流电压关系。在尝试此程序时，重要的是要记住快速但轻柔地解剖出 DRG，并在 ice code hbss 上反复保持制剂湿润。

在此程序之后，可以标记和识别其他传出神经元，以了解它们在生理学中的作用。