鉴定特定感觉神经元群体以研究其表达的离子通道

本实验的总体目标是通过逆行染料标记法鉴定传入神经元，并利用膜片钳电生理技术和免疫化学方法研究这些神经元中的离子通道。首先向靶组织注射DAI以标记支配该组织的传入神经元，第二步是从背根神经节中分离传入神经元。

接下来，对已标记的神经元进行膜片钳记录，以检测门控离子通道；最后一步是利用免疫化学方法鉴定标记神经元中表达的离子通道。最终，通过结合膜片钳和免疫化学技术，我们能够确定传入神经元中离子通道的表达模式及其功能特性。该方法相较于其他现有方法的主要优势在于其非侵入性，且我们所使用的DAI（DAI I）以其被神经末梢快速摄取的特性而著称。

神经元之间缺乏示踪剂传递，且在我们注射的神经元内长期保留。本次染料注射操作将由我本人和本实验室的研究技术员Stephanie进行演示。首先，使用电动剃须刀剃除麻醉大鼠双侧小腿区域的毛发。

接下来，用一个1毫升的无菌注射器吸取200微升1.5% Dai溶液。将针头沿每块腓肠肌长轴方向平行缓慢插入，然后在将针头从肌肉中拔出前，向肌肉内注射100微升Dai溶液。回抽注射器活塞，确认染料不再从针尖流出。

等待10秒，然后将针头从肌肉中抽出。染料分布需要4到5天时间，以便进行后续解剖。将装有10毫升HBSS的烧杯、一个35毫米的培养皿和一个100毫米的培养皿置于冰上。

接下来，称取7毫克胶原酶、1毫克DNA酶和10毫克胰蛋白酶预热液，将摇动水浴锅预热至37摄氏度，并将含有10毫升EBSS的15毫升离心管置于水浴中预热。在处死大鼠并进行解剖前，迅速切开动物背部的皮肤，随后去除脊柱周围的结缔组织和肌肉组织，以获得更好的暴露视野。

随后，取下脊柱的腰段部分。接着，将分离出的脊柱置于100毫米的培养皿中。使用无菌巴斯德移液管加入冰冷的HBSS溶液，以保持组织湿润和低温状态。

从脊柱两侧切开肌肉。使用咬骨钳或剪刀轻柔地去除骨骼，进行背部椎板切除术，并封闭包含背根神经节的凹陷处。重复操作。此过程中反复应用冰冻的HBSS。

在显微镜下，通过切断周围神经和中枢神经来分离背根神经节（DRG），保留一到两毫米的神经以方便操作神经节。然后将分离的DRG放入含有冰上预冷的HBSS缓冲液的35毫米培养皿中。重复上述步骤，直至所有L4和L5节段的DRG均被分离。

使用显微剪刀和镊子去除多余的神经和血管。切开背根神经节（DRG）以更好地暴露酶，但进行DRG神经元分离时不要剥离DRG的被膜。将酶加入预热的EBSS培养基中，混匀溶解后涡旋振荡，并过滤除菌。

接下来，使用无菌的移液管头将所有DRG放入酶解液中。随后，用95%氧气和5%CO2对烧瓶鼓泡60秒，然后 tightly 封紧瓶盖。接着，将烧瓶置于37°C摇动水浴中，以240 RPM孵育60分钟。

孵育结束后，在无菌条件下剧烈振荡烧瓶50次，以解离背根神经节。向烧瓶中加入5毫升含血清的MEM培养基，以终止酶活性。

将烧瓶中的内容物转移至无菌的15毫升离心管中，在16 × g条件下离心6分钟。随后，移除并弃去上清液。向样品中加入5毫升含血清的MEM培养基，用移液器轻轻吹打混匀。

为重悬细胞沉淀，重复离心步骤，移除并弃去上清液，加入500 µL含血清的MEM培养基，使用1 mL移液枪头轻轻吹打，制成单细胞悬液。随后，将一片多聚赖氨酸包被的玻璃盖玻片放入一个无菌的35 mm空培养皿中。然后，取一滴细胞悬液滴加于盖玻片中央。

重复此步骤直至细胞悬液用完。将35毫米培养皿放入37摄氏度、5%CO2的培养箱中孵育1小时，使神经元在1小时后贴附于盖玻片边缘。每皿再加入2毫升培养基，然后放回培养箱，进行膜片钳记录。

首先，使用带有落射荧光的显微镜识别标记了DRG神经元的染料。接着，用内液填充玻璃电极。轻轻敲击以去除任何被困住的气泡。

然后将电极放入电极架中。使用显微操作器将电极缓慢下降至细胞处。当电极接触到细胞后，通过吸管施加轻柔的负压，直至形成紧密的封接。

然后将膜电位钳制在所需的保持电位。通过施加更强的负压获得全细胞膜片钳构型。一旦建立全细胞膜片钳构型，立即开始记录，以去除电极尖端处的膜片。

在此步骤中，使用4%多聚甲醛将盖玻片上的神经元固定1小时。然后用含2%吐温20的PBS溶液对神经元进行10分钟的透化处理。接着，将细胞在封闭液中孵育1小时。

将检测细胞在封闭液中加入一抗，4℃孵育过夜。对照组神经元仅在封闭液中孵育过夜，不加任何一抗。次日，用PBS缓冲液洗涤盖玻片，每次5分钟，共洗3次，随后用含1% Tween 20的PBS洗涤2次，每次5分钟，以去除未结合的一抗。

然后将实验组和对照组的盖玻片与相应的荧光标记二抗在室温下孵育30分钟，使二抗与一抗结合，从而实现目标蛋白的可视化。随后用PBS洗涤盖玻片3次，每次5分钟，以去除未结合的二抗。接着，使用封片剂将盖玻片封固在洁净的载玻片上。

然后在盖玻片边缘涂抹透明指甲油以固定其位置。待干燥后，使用荧光显微镜配套软件观察神经元并采集图像。此图为向腓肠肌注射Dai后，示踪剂从肌肉向背根神经节逆行运输的示意图。

此处标注了L4和L5背根神经节（DRG）。传入神经元在明场图像中显示，而这张荧光图像展示了一个染料标记的肌肉传入神经元。该直方图显示了感觉神经元的DII荧光强度。

较大的峰来自未标记的神经元，通过高斯方程拟合以确定平均强度和标准差。虚线垂直线表示 DAI 标记的阈值。该直方图包含来自 1047 个神经元的数据，其中 167 个被 dai 标记。

这是一个具有良好的膜电位控制的代表性肌肉传入神经元。左侧显示了在负20、负10和0毫伏时的钠电流，右侧显示了电流-电压关系曲线。在进行该操作时，需注意迅速而轻柔地分离背根神经节（DRGs），并反复用冰冻的HBSS溶液保持标本湿润。

通过该操作流程，可对其他传出神经元进行标记和鉴定，以明确其在生理学中的作用。