Name: 微RNA原位杂交的福尔马林固定的肾组织 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-30T19:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 21 s
Description: 学习微RNA原位杂交技术用于福尔马林固定肾组织中microRNA的定位与定量检测。该方法通过地高辛标记探针和碱性磷酸酶显色反应，帮助研究人员可视化肾小管节段中的基因表达模式。

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本研究工作由美国国立卫生研究院基金项目 HL082798 和 HL111580 资助。

1. 肾脏组织切片
<ol>
	<li>使用 Microm HM 355 S 将经10%甲醛固定、石蜡包埋的肾脏组织切片切成5 mm厚的切片，并置于显微镜载玻片上。这些载玻片可在分析前储存数月。</li>
</ol>
2. 溶液配制
<ol>
	<li>在可高压灭菌的螺旋盖瓶中，用 1 L 去离子水（ddH2O）配制 1× PBS 溶液。另取一个瓶子加入 1 L 去离子水（ddH2O）。向每个瓶中加入 1 ml DEPC，盖紧后剧烈摇晃。室温下静置过夜，以灭活 RNase，随后进行高压灭菌。向 1 L 1× PBS 中加入 400 ml Tween-20，配制成 PBS-T 缓冲液。</li>
	<li>配制蛋白酶 K 缓冲液（含 50 mM Tris-HCl（pH 8.0）和 1 mM CaCl2，溶于经 DEPC 处理的水中）。</li>
	<li>用 PBS-T 配制 0.2% 甘氨酸溶液。</li>
</ol>
3. 组织制备
<ol>
	<li>制备大量杂交缓冲液（50–100 ml），其中包含50%甲酰胺、5× SSC、0.1% Tween、9.2 mM柠檬酸（用于调节pH至6）、50 µg/ml肝素和500 µg/ml酵母RNA，溶于DEPC处理的ddH2O中。分装为1 ml等份，于-80 ºC保存。</li>
	<li>用新鲜二甲苯洗涤组织3次，每次5分钟，以去除石蜡。</li>
	<li>将组织切片依次在ddH2O中不同浓度的乙醇（100%、75%、50%和25%）中孵育5分钟，进行梯度水化。</li>
	<li>加入足量DEPC溶液完全覆盖组织切片（约0.4–0.5 ml），处理1分钟。确保组织不干燥。</li>
	<li>用DEPC处理的PBS-T溶液漂洗切片两次，每次5分钟，并将含DEPC的废液收集后妥善处理。自此步骤起，所有试剂均应经DEPC处理，以消除RNase污染。</li>
	<li>预热蛋白酶K缓冲液，加入蛋白酶K至终浓度为10 μg/ml。用蛋白酶K溶液覆盖组织切片，在37 ºC孵育5分钟。</li>
	<li>迅速吸去蛋白酶K溶液，加入PBS-T中的0.2%甘氨酸溶液，孵育30秒。</li>
	<li>用DEPC处理的PBS-T溶液漂洗切片两次，每次30秒。</li>
	<li>用新鲜配制的4%多聚甲醛固定切片10分钟。</li>
</ol>
4. 杂交
<ol>
	<li>每个组织切片加入 50 µl 杂交缓冲液（50% 甲酰胺、5x SSC、0.1% Tween、9.2 mM 柠檬酸用于调节 pH 至 6、50 µg/ml 肝素、500 µg/ml 酵母 RNA），并用略大于组织切片的无 RNA 酶 HybriSlip 覆盖。</li>
	<li>将切片置于湿度控制的杂交炉中，在针对 3’ 地高辛标记探针确定的杂交温度下预杂交 2 小时（通常为探针 DNA 熔解温度 Tm 减去 21 °C，即&#160;miR-382 探针为 54 °C，其 DNA Tm = 75 °C），使用浸有 50% 甲酰胺/50% 5x SSC 的组织实验擦拭巾保持杂交室湿润。</li>
	<li>用杂交缓冲液将 miRNA 探针、阳性对照（U6，小核 RNA）和阴性对照（随机序列）稀释至 40 nM（每张切片需 75 µl 缓冲液）。</li>
	<li>将探针与杂交缓冲液混合物在 65 ºC 加热 5 分钟。</li>
	<li>从杂交炉中取出载玻片，移除盖玻片及预杂交残留的多余杂交缓冲液。</li>
	<li>每张组织切片直接加入 75 µl 含探针的缓冲液，覆盖组织区域；使用大小刚好能覆盖组织切片的 HybriSlip 覆盖。</li>
	<li>保持载玻片架水平，放回杂交炉中，在步骤 4.2 确定的温度下过夜孵育（约 16 小时）。</li>
</ol>
5. 严谨性洗涤
<ol>
	<li>加入 200 µl 预热至杂交温度的 2x SSC 缓冲液，置于盖玻片的一侧边缘下方，以帮助盖玻片从组织上脱落。通过倾斜载玻片移除盖玻片。</li>
	<li>在杂交温度下，用 200 µl 含 50% 甲酰胺和 50% 2x SSC 的溶液洗涤载玻片，每次 30 分钟，共洗涤 3 次。</li>
	<li>在室温下，于低速旋转摇床上用 PBS-T 溶液冲洗载玻片，每次 5 分钟，共冲洗 5 次。</li>
</ol>
6. 检测
<ol>
	<li>将载玻片置于封闭缓冲液（含2%山羊或马血清、2 mg/ml BSA的PBS-T）中，在室温下于低速旋转摇床上孵育1小时。</li>
	<li>用封闭缓冲液按1:100稀释抗DIG-AP Fab片段，每张组织切片加入100 µl，并用略大于切片面积的HybriSlip覆盖。</li>
	<li>在湿润密闭容器中，4 °C条件下孵育抗体过夜（约16小时）。</li>
	<li>在PBS-T中于低速旋转摇床上清洗载玻片，每次5分钟，共洗7次。</li>
	<li>在AP缓冲液（100 mM TrisHCl pH 9.5，50 mM MgCl2，100 mM NaCl，0.1% Tween 20）中清洗载玻片3次，每次5分钟。</li>
	<li>向AP缓冲液中加入NBT/BCIP溶液（200 µl/10 ml缓冲液）。</li>
	<li>每张载玻片加入400–500 ml稀释后的NBT/BCIP溶液，完全覆盖所有组织切片，在避光、水平、湿润密闭容器中显色4–5小时。</li>
</ol>
7. 装片
<ol>
	<li>将切片依次放入浓度递增的乙醇（25%、50%、75%、100%）中脱水，每种浓度各5分钟。</li>
	<li>将切片置于二甲苯中孵育5次，以清除残留物。</li>
	<li>用Permount封片介质封片，并在室温下干燥过夜。</li>
</ol>

<ol><li>Nagalakshmi, V. K., Ren, Q., Pugh, M. M., Valerius, M. T., McMahon, A. P., Yu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dicer+regulates+thedevelopment+of+nephrogenic+and+ureteric+compartments+in+the+mammalian+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">Dicer regulates thedevelopment of nephrogenic and ureteric compartments in the mammalian kidney.</a> Kidney Int. 79 (3), 317-330 (2011).</li>
<li>Ho, J., Pandey, P., Schatton, T., Sims-Lucas, S., Khalid, M., Frank, M. H., Hartwig, S., Kreidberg, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pro-apoptotic+protein+Bim+is+a+MicroRNA+target+in+kidney+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Neph%22%5BJournal%5D)">The pro-apoptotic protein Bim is a MicroRNA target in kidney progenitors.</a> J. Am. Soc. Neph. 22 (6), 1053-1063 (2011).</li>
<li>Tian, Z., Greene, A. S., Pietrusz, J. L., Matus, I. R., Liang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-target+pairs+in+the+rat+kidney+identified+by+microRNA+microarray%2C+proteomic%2C+and+bioinformaticanalysis%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-target pairs in the rat kidney identified by microRNA microarray, proteomic, and bioinformaticanalysis.</a> Genome Res. 18 (3), 404-411 (2008).</li>
<li>Mladinov, D., Liu, Y., Mattson, D. L., Liang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+contribute+to+the+maintenance+of+cell-type-specific+physiological+characteristics%3A+miR-192+targets+Na%2B%2FK%2B-ATPase+%CE%B21%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs contribute to the maintenance of cell-type-specific physiological characteristics: miR-192 targets Na+/K+-ATPase β1.</a> Nucleic Acids Res. 41 (2), 1273-1283 (2013).</li>
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<li>Wang, B., Herman-Edelstein, M., Koh, P., Burns, W., Jandeleit-Dahm, K., Watson, A., Saleem, M., Goodall, G. J., Twigg, S. M., Cooper, M. E., Kantharidis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E-cadherin+expression+is+regulated+by+miR-192%2F215+by+a+mechanism+that+is+independent+of+the+profibrotic+effects+of+transforming+growth+factor-%CE%B2%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">E-cadherin expression is regulated by miR-192/215 by a mechanism that is independent of the profibrotic effects of transforming growth factor-β.</a> Diabetes. 59 (7), 1794-1802 (2010).</li>
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<li>Gottardo, F., Liu, C. G., Ferracin, M., Calin, G. A., Fassan, M., Bassi, P., Sevignani, C., Byrne, D., Negrini, M., Pagano, F., Gomella, L. G., Croce, C. M., Baffa, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-RNA+profiling+in+kidney+and+bladder+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Urol.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Micro-RNA profiling in kidney and bladder cancers.</a> Urol. Oncol. 25 (5), 387-392 (2007).</li>
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<li>Xu, X., Kriegel, A. J., Liu, Y., Usa, K., Mladinov, D., Liu, H., Fang, Y., Ding, X., Liang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+ischemic+preconditioning+contributes+to+renal+protection+by+upregulation+of+miR-21%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">Delayed ischemic preconditioning contributes to renal protection by upregulation of miR-21.</a> Kidney Int. 82 (11), 1167-1175 (2012).</li>
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<li>Kloosterman, W. P., Wienholds, E., de Bruijn, E., Kauppinen, S., Plasterk, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+detection+of+miRNAs+in+animal+embryos+using+LNA-moidified+oligonucleotide+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">In situ detection of miRNAs in animal embryos using LNA-moidified oligonucleotide probes.</a> Nat. Methods. 3 (1), 27-29 (2006).</li>
<li>Nelson, P. T., Baldwin, D. A., Kloosterman, W. P., Kauppinen, S., Plasterk, R. H., Mourelatos, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAKE+and+LNA-ISH+reveal+microRNA+expression+and+localization+in+archival+human+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">RAKE and LNA-ISH reveal microRNA expression and localization in archival human brain tissue.</a> RNA. 12 (2), 187-191 (2006).</li>
<li>Obernosterer, G., Martinez, J., Alenius, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Locked+nucleic+acid-based+in+situ+detection+of+microRNAs+in+mouse+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">Locked nucleic acid-based in situ detection of microRNAs in mouse tissue sections.</a> Nat. Protocols. 2 (6), 1508-1514 (2007).</li>
<li>Kriegel, A. J., Liu, Y., Cohen, B., Usa, K., Liu, Y., Liang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MiR-382+targeting+of+kallikrein+5+contributes+to+renal+inner+medullary+interstitial+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Genomics%22%5BJournal%5D)">MiR-382 targeting of kallikrein 5 contributes to renal inner medullary interstitial fibrosis.</a> Physiol. Genomics. 44 (4), 259-267 (2012).</li>
</ol>

无任何披露内容。

本文的目的是描述一种在福尔马林固定的肾脏组织中效果良好的miRNA原位杂交（in situ hybridization）实验方案。在优化该方案的过程中，已识别出多个导致染色伪影的重要来源。仔细注意这些关键点有助于避免染色伪影，并提高原位杂交实验成功的可能性。
在长时间孵育过程中，组织切片干燥是导致染色假象最可避免的原因之一。一旦发生干燥，干燥区域在NBT/BCIP显色过程中会呈现非常深的染色（图1）。在整个实验流程中，必须确保所有孵育步骤期间组织切片始终完全被液体覆盖，并且载玻片始终保持完全水平。此外，在杂交步骤和抗体孵育等长时间孵育过程中，应使用HybriSlip覆盖组织切片，以帮助防止液体蒸发。若观察到组织切片出现部分或完全干燥，则样品很难获得理想的染色结果，从而无法对这些样品中的miRNA表达进行准确解读。
在蛋白酶K消化和多聚甲醛处理步骤中，液体覆盖同样至关重要。该消化步骤的目的是允许miRNA探针进入细胞。如果在短暂孵育期间组织未能完全被液体覆盖，则未暴露于酶消化的...

microRNA 是一类小的非编码 RNA（约 22 个核苷酸长），在细胞内源性产生。它们通常通过翻译抑制或 mRNA 降解来抑制蛋白质表达。miRNA 与 mRNA 靶标结合时互补性不完全，因此单个 miRNA 可能抑制多个靶标。
了解哪些细胞类型和结构表达miRNA，是理解miRNA表达改变如何影响细胞和组织表型机制的重要部分。虽然miRNA测序、qPCR和Northern blotting等方法可用于检测整体组织中的miRNA，但这些方法无法确定miRNA具体来源于组织内的哪一类特定细胞。在使用这些方法前对细胞和结构组分进行分离非常困难，且实现有效分离所需的条件可能导致基因表达改变或RNA降解。microRNA原位杂交是一种用于可视化miRNA在组织中定位及其表达水平的技术。该技术在由异质性结构组成的组织（如肾脏）中尤为有价值。
MicroRNAs 已被证实对肾脏发育具有调控作用2,3 生理学4微小RNA表达改变也已被证实参与肾脏病理过程，例如纤维化5-10糖尿病肾病7，肾细胞癌11,12，以及急性肾损伤13在我们的研究中，我们发现优化微小RNA 原位 肾组织的原位杂交对于确定miRNA在健康和疾病状态下的确切结构定位具有重要价值14确定不同microRNA在肾小管及细胞中的表达至关重要，因为其对靶基因的调控可能依赖于细胞功能。在疾病状态下，明确miRNA表达改变如何影响功能也具有重要意义。
本方法旨在基于Kloosterman等15、其他研究者16,17以及Exiqon1所建立的原位杂交（ISH）技术，并针对福尔马林固定肾脏组织进行优化。我们已成功应用该方法，在单侧输尿管梗阻模型中鉴定出肾脏微小RNA（miR-382）表达存在明显的区域差异18。该技术也可适用于其他组织，但需进一步优化。

<table><tbody><tr><td>多聚甲醛</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Gibco</td><td>70011044</td><td></td></tr><tr><td>焦碳酸二乙酯</td><td>Sigma</td><td>D5758</td><td></td></tr><tr><td>吐温-20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>二甲苯</td><td>Sigma</td><td>534056</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Ultra Pure</td><td>200CSPTP</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Life Technologies</td><td>15506-017</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>C2536</td><td></td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>J.T. Baker</td><td>4059-00</td><td></td></tr><tr><td>柠檬酸</td><td>Sigma</td><td>C2404</td><td></td></tr><tr><td>甲酰胺</td><td>Sigma</td><td>F9037</td><td></td></tr><tr><td>20x SSC 缓冲液</td><td>Life Technologies</td><td>15557-044</td><td></td></tr><tr><td>肝素</td><td>SAGENT</td><td>25021-400-30</td><td></td></tr><tr><td>酵母 RNA</td><td>Life Technologies</td><td>AM7118</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>M8266-1004</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>J.T. Baker</td><td>4058-01</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶 K</td><td>Fermentas</td><td>EO0491</td><td></td></tr><tr><td>3&amp;rsquo; DIG- miRNA 探针</td><td>Exiqon</td><td>miR dependent-05</td><td></td></tr><tr><td>3&amp;rsquo; DIG- 随机 miR 探针</td><td>Exiqon</td><td>99004-05</td><td></td></tr><tr><td>3&amp;rsquo; DIG- U6 miR 探针</td><td>Exiqon</td><td>99002-05</td><td></td></tr><tr><td>抗地高辛抗体 Fab 片段</td><td>Roche</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>NBT/BCIP</td><td>Roche</td><td>11681451001</td><td></td></tr><tr><td>Permount 封片剂</td><td>Fisher</td><td>SP15-500</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>Fisher</td><td>根据组织大小适配</td><td></td></tr><tr><td>Microtom HM 355 S 切片机</td><td>Thermo Scientific</td><td>23-900-672</td><td></td></tr><tr><td>载片式杂交孵育箱</td><td>Boekel</td><td>241000</td><td></td></tr><tr><td>铝制托盘组件</td><td>Boekel</td><td>C2403973</td><td></td></tr><tr><td>不锈钢架插入件</td><td>Boekel</td><td>C2403754</td><td></td></tr></tbody></table>

microrna 原位 福尔马林固定肾脏组织的杂交检测

MicroRNA In situ Hybridization for Formalin Fixed Kidney Tissues

本文介绍了一种通过地高辛标记的 microRNA 探针进行原位杂交，从而在肾脏组织中实现 miRNA 比色检测的方法。in situ 杂交最初由 Kloosterman 及其同事建立，广泛适用于 Exiqon miRNA 探针1，本文对该方法进行了改进，以克服在肾脏组织中进行 miRNA 分析时固有的技术难题，包括组织结构识别困难以及探针和抗体残留难以彻底去除等问题。采用相对较薄（5 mm 厚）的组织切片，可在保留细胞内强探针信号的同时，实现肾脏结构的清晰可视化。此外，优化了探针浓度和孵育条件，以在背景信号和非特异性信号较低的情况下，有效显示 microRNA 的表达水平。本文详细描述了该优化后的实验流程，涵盖从组织采集与制备到最终载玻片封片的全部步骤。本方案的基本组分可根据需要调整，适用于其他组织及细胞培养模型的研究。

在杂交、孵育或洗涤步骤中，组织切片中发生干燥的区域通常会在NBT/BCIP显色过程中出现更深的染色。图1显示了一张肾组织切片的部分区域，其中HybriSlip从组织边缘滑脱，导致该区域部分脱水。尽管在后续步骤中进行了再水化和覆盖，脱水区域的信号仍人为增强。
控制NBT-BCIP显色时间的重要性如图2A和图2B所示。显色时间超过4-5小时会导致在肾组织中，scrambled-miR对照探针出现明显的非特异性着色（图2A）。对于高丰度靶标（如U6小核RNA对照）的探针检测，孵育时间超过4-5小时并不能改善信号强度（图2B）。
在图3中展示了本研究所述原位杂交（ISH）方法在肾组织中检测miRNA的适用性，该图改编自Kriegel 等18的研究。在该研究中，我们发现与假手术动物相比，单侧输尿管...

本文描述了一种 原位 适用于福尔马林固定肾组织切片中microRNA表达比色检测的杂交实验方案优化

MicroRNA 原位 福尔马林固定肾脏组织的杂交检测

本文介绍了一种通过地高辛标记的 microRNA 原位杂交技术对肾脏中 miRNA 进行比色检测的方法。

以下实验的总体目标是定位并定量肾脏组织中的微小RNA（micro RNA）表达。该目标首先通过将地高辛标记的探针与肾脏组织中特定的微小RNA进行杂交来实现。第二步，将带有碱性磷酸酶偶联的地高辛抗体与组织孵育。接下来，向组织中加入N-B-T-B-C-I-P底物，以通过杂交位点处显色生成蓝色产物来显示microRNA的定位。实验结果可揭示microRNA在肾脏区域及肾单位节段中的表达位置，其依据为microRNA互补探针的杂交情况。该实验采用经福尔马林固定、石蜡包埋的肾脏切片，切片厚度为5微米，并附着于显微镜载玻片上。为准备用于分析的肾脏切片，首先使用新鲜二甲苯分三次洗涤，每次五分钟，以去除组织中的石蜡。将组织切片依次浸入双蒸水中不同浓度的乙醇溶液中，每种浓度孵育五分钟，以重新水化组织切片。接着，向载玻片上加入足量的达希尔（dathyl）、过碳酸盐（percarbonate）或去西（desy），完全覆盖组织切片，处理一分钟。注意确保组织切片不干燥。移除脱蜡剂，并用经过脱蜡剂处理的 PBST 缓冲液冲洗载玻片两次，每次五分钟。确保收集含有脱蜡剂的废液，以便妥善处理。从此时起，所有试剂均应经过去RNase处理。为去除RNA，将蛋白酶K加入预热的蛋白酶K缓冲液中，使其终浓度为每毫升10微克。用蛋白酶K溶液覆盖组织切片，并在37摄氏度下孵育5分钟。迅速移除蛋白酶K溶液，加入含0.2%甘氨酸的PBST溶液，孵育30秒。用 PBST 冲洗载玻片，每次 30 秒，共冲洗两次。最后，用新鲜配制的 4% 多聚甲醛固定组织切片 10 分钟。开始此操作步骤时，每个组织切片上加入 50 微升杂交缓冲液，并覆盖略大于组织切片的无 RNase 杂交盖片。将载玻片放入加湿的杂交盒中，加湿方法为使用浸泡于 50% 甲酰胺、50% 5×SSC 溶液的实验室擦拭纸。将加湿后的杂交盒置于已预热至杂交温度的烘箱中，对组织切片进行两小时的预杂交。该杂交温度根据 3' 地高辛标记探针的特性确定，通常为探针的 DNA 解链温度（Tm）减去 21 摄氏度。例如，由于3 82探针的熔解温度（TM）为75摄氏度，其杂交温度为54摄氏度。将微小RNA探针、阳性对照和阴性对照分别用杂交缓冲液稀释至40纳摩尔进行制备。阳性对照为U六小核RNA，阴性对照为随机序列。将探针和对照在 65 摄氏度下加热五分钟。从杂交炉中取出载玻片。移除预杂交体系中的杂交盖片和过量的杂交缓冲液。将75微升含有探针的缓冲液直接加到每个组织切片上。用杂交盖片覆盖，盖片大小应恰好能够覆盖组织切片。保持载玻片架水平。将载玻片放回杂交炉中，在适当温度下继续孵育，过夜约16小时。杂交完成后，从杂交炉中取出载玻片。加入 200 微升预热至杂交温度的 2×SSC 缓冲液，从盖玻片的一侧边缘下方注入，以帮助将盖玻片从组织上分离。通过倾斜载玻片移除盖玻片。移除盖玻片后，在 200 微升含 50% 甲酰胺的 2×SSC 缓冲液中，于确定的杂交温度下洗涤载玻片，共洗涤三次，每次 30 分钟。在室温下，将载玻片置于水平摇床上以低速轻轻振荡，用 PBST 每次冲洗 5 分钟，共冲洗 5 次。先将载玻片在封闭缓冲液中于水平摇床低速振荡孵育 1 小时，开始此步骤。1 小时后，向每个组织切片中加入 100 µL 抗地高辛碱性磷酸酶 FAB 片段，并用盖片覆盖。切取足以覆盖组织区域的大小。将切片置于湿盒中，4摄氏度孵育过夜或次日孵育约16小时。在室温下，用PBST在低速旋转摇床上清洗切片，每次5分钟，共洗涤7次。接下来，用AP缓冲液洗涤载玻片，每次5分钟，共洗涤三次。通过将200微升N-B-T-B-C-I-P溶液加入10毫升AP缓冲液中，配制N-B-T-B-C-I-P显色液。向每张载玻片加入400至500微升稀释后的N-B-T-B-C-I-P溶液，以完全覆盖所有组织切片。在比色检测完成后，于室温下在避光湿盒中孵育四至五小时。随后将切片经梯度乙醇溶液脱水，每次五分钟；再通过五次二甲苯浸润，每次五分钟，以透明切片。最后，用Permount封片剂封片，并过夜干燥。确保组织切片不干燥对于该原位杂交实验方案的成功至关重要。本图左侧显示了肾组织切片的一部分，其中盖玻片从组织边缘滑脱，导致该区域部分脱水。尽管在后续步骤中进行了再水化并覆盖保护，但与始终被盖玻片覆盖的区域相比，脱水区域的信号出现人为增强。校准条在此图像中代表 100 微米。接下来的图示说明了优化 N-B-T-B-C-I-P 显色时间的重要性。图 A 显示，显色时间超过四到五小时会导致明显的非特异性着色，以及在整个肾脏组织中出现杂乱的微小 RNA 对照探针信号。图B显示，当肾脏组织中高丰度靶标（如U6小核RNA对照）被检测时，孵育时间超过四到五小时并不会进一步增强信号。这些数据改编自先前的研究，证实了该原位杂交方法适用于肾组织中微小RNA的检测。图A展示了通过原位杂交法获得的miR-382在小鼠肾组织切片中表达的代表性图像，这些小鼠分别接受了单侧输尿管梗阻（UUO）或假手术处理，并分别使用抗-miR-382或乱序对照（antis. scrambled）进行干预。与假手术加乱序对照组相比，UUO加乱序对照组中染色更深，表明UUO诱导了miR-382表达的增加。这种增加被抗ME 3 82处理所阻断。B图显示假手术加抗乱序处理小鼠的mere 3 82表达，以平均积分光密度的百分比表示。根据观察到的像素强度测定，UUO可显著增加外髓和内髓中mere 3 82的表达，而抗ME 3 82可阻断该效应。这种增加可通过 micro RNA 原位杂交进行可视化和测量。这些结果与未在此处展示的 Q PCR R 结果一致，表明使用 INI 两种杂交方法检测甲醛固定肾脏中 mere 3 82 的表达具有足够的灵敏度，可提供与基于 qPCR R 的表达分析相一致的可量化结果。此外，C 两种杂交技术能够测量肾脏内 micro RNA 表达的显著区域性差异。

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生物学

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MicroRNA 原位福尔马林固定肾脏组织的杂交检测

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