Name: 微RNA原位杂交的福尔马林固定的肾组织 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-30T19:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 21 s
Description: 学习微RNA原位杂交技术用于福尔马林固定肾组织中microRNA的定位与定量检测。该方法通过地高辛标记探针和碱性磷酸酶显色反应，帮助研究人员可视化肾小管节段中的基因表达模式。

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本研究工作由美国国立卫生研究院基金项目 HL082798 和 HL111580 资助。

1. 肾脏组织切片
<ol>
	<li>使用 Microm HM 355 S 将经10%甲醛固定、石蜡包埋的肾脏组织切片切成5 mm厚的切片，并置于显微镜载玻片上。这些载玻片可在分析前储存数月。</li>
</ol>
2. 溶液配制
<ol>
	<li>在可高压灭菌的螺旋盖瓶中，用 1 L 去离子水（ddH2O）配制 1× PBS 溶液。另取一个瓶子加入 1 L 去离子水（ddH2O）。向每个瓶中加入 1 ml DEPC，盖紧后剧烈摇晃。室温下静置过夜，以灭活 RNase，随后进行高压灭菌。向 1 L 1× PBS 中加入 400 ml Tween-20，配制成 PBS-T 缓冲液。</li>
	<li>配制蛋白酶 K 缓冲液（含 50 mM Tris-HCl（pH 8.0）和 1 mM CaCl2，溶于经 DEPC 处理的水中）。</li>
	<li>用 PBS-T 配制 0.2% 甘氨酸溶液。</li>
</ol>
3. 组织制备
<ol>
	<li>制备大量杂交缓冲液（50–100 ml），其中包含50%甲酰胺、5× SSC、0.1% Tween、9.2 mM柠檬酸（用于调节pH至6）、50 µg/ml肝素和500 µg/ml酵母RNA，溶于DEPC处理的ddH2O中。分装为1 ml等份，于-80 ºC保存。</li>
	<li>用新鲜二甲苯洗涤组织3次，每次5分钟，以去除石蜡。</li>
	<li>将组织切片依次在ddH2O中不同浓度的乙醇（100%、75%、50%和25%）中孵育5分钟，进行梯度水化。</li>
	<li>加入足量DEPC溶液完全覆盖组织切片（约0.4–0.5 ml），处理1分钟。确保组织不干燥。</li>
	<li>用DEPC处理的PBS-T溶液漂洗切片两次，每次5分钟，并将含DEPC的废液收集后妥善处理。自此步骤起，所有试剂均应经DEPC处理，以消除RNase污染。</li>
	<li>预热蛋白酶K缓冲液，加入蛋白酶K至终浓度为10 μg/ml。用蛋白酶K溶液覆盖组织切片，在37 ºC孵育5分钟。</li>
	<li>迅速吸去蛋白酶K溶液，加入PBS-T中的0.2%甘氨酸溶液，孵育30秒。</li>
	<li>用DEPC处理的PBS-T溶液漂洗切片两次，每次30秒。</li>
	<li>用新鲜配制的4%多聚甲醛固定切片10分钟。</li>
</ol>
4. 杂交
<ol>
	<li>每个组织切片加入 50 µl 杂交缓冲液（50% 甲酰胺、5x SSC、0.1% Tween、9.2 mM 柠檬酸用于调节 pH 至 6、50 µg/ml 肝素、500 µg/ml 酵母 RNA），并用略大于组织切片的无 RNA 酶 HybriSlip 覆盖。</li>
	<li>将切片置于湿度控制的杂交炉中，在针对 3’ 地高辛标记探针确定的杂交温度下预杂交 2 小时（通常为探针 DNA 熔解温度 Tm 减去 21 °C，即&#160;miR-382 探针为 54 °C，其 DNA Tm = 75 °C），使用浸有 50% 甲酰胺/50% 5x SSC 的组织实验擦拭巾保持杂交室湿润。</li>
	<li>用杂交缓冲液将 miRNA 探针、阳性对照（U6，小核 RNA）和阴性对照（随机序列）稀释至 40 nM（每张切片需 75 µl 缓冲液）。</li>
	<li>将探针与杂交缓冲液混合物在 65 ºC 加热 5 分钟。</li>
	<li>从杂交炉中取出载玻片，移除盖玻片及预杂交残留的多余杂交缓冲液。</li>
	<li>每张组织切片直接加入 75 µl 含探针的缓冲液，覆盖组织区域；使用大小刚好能覆盖组织切片的 HybriSlip 覆盖。</li>
	<li>保持载玻片架水平，放回杂交炉中，在步骤 4.2 确定的温度下过夜孵育（约 16 小时）。</li>
</ol>
5. 严谨性洗涤
<ol>
	<li>加入 200 µl 预热至杂交温度的 2x SSC 缓冲液，置于盖玻片的一侧边缘下方，以帮助盖玻片从组织上脱落。通过倾斜载玻片移除盖玻片。</li>
	<li>在杂交温度下，用 200 µl 含 50% 甲酰胺和 50% 2x SSC 的溶液洗涤载玻片，每次 30 分钟，共洗涤 3 次。</li>
	<li>在室温下，于低速旋转摇床上用 PBS-T 溶液冲洗载玻片，每次 5 分钟，共冲洗 5 次。</li>
</ol>
6. 检测
<ol>
	<li>将载玻片置于封闭缓冲液（含2%山羊或马血清、2 mg/ml BSA的PBS-T）中，在室温下于低速旋转摇床上孵育1小时。</li>
	<li>用封闭缓冲液按1:100稀释抗DIG-AP Fab片段，每张组织切片加入100 µl，并用略大于切片面积的HybriSlip覆盖。</li>
	<li>在湿润密闭容器中，4 °C条件下孵育抗体过夜（约16小时）。</li>
	<li>在PBS-T中于低速旋转摇床上清洗载玻片，每次5分钟，共洗7次。</li>
	<li>在AP缓冲液（100 mM TrisHCl pH 9.5，50 mM MgCl2，100 mM NaCl，0.1% Tween 20）中清洗载玻片3次，每次5分钟。</li>
	<li>向AP缓冲液中加入NBT/BCIP溶液（200 µl/10 ml缓冲液）。</li>
	<li>每张载玻片加入400–500 ml稀释后的NBT/BCIP溶液，完全覆盖所有组织切片，在避光、水平、湿润密闭容器中显色4–5小时。</li>
</ol>
7. 装片
<ol>
	<li>将切片依次放入浓度递增的乙醇（25%、50%、75%、100%）中脱水，每种浓度各5分钟。</li>
	<li>将切片置于二甲苯中孵育5次，以清除残留物。</li>
	<li>用Permount封片介质封片，并在室温下干燥过夜。</li>
</ol>

<ol><li>Nagalakshmi, V. K., Ren, Q., Pugh, M. M., Valerius, M. T., McMahon, A. P., Yu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dicer+regulates+thedevelopment+of+nephrogenic+and+ureteric+compartments+in+the+mammalian+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">Dicer regulates thedevelopment of nephrogenic and ureteric compartments in the mammalian kidney.</a> Kidney Int. 79 (3), 317-330 (2011).</li>
<li>Ho, J., Pandey, P., Schatton, T., Sims-Lucas, S., Khalid, M., Frank, M. H., Hartwig, S., Kreidberg, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pro-apoptotic+protein+Bim+is+a+MicroRNA+target+in+kidney+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Neph%22%5BJournal%5D)">The pro-apoptotic protein Bim is a MicroRNA target in kidney progenitors.</a> J. Am. Soc. Neph. 22 (6), 1053-1063 (2011).</li>
<li>Tian, Z., Greene, A. S., Pietrusz, J. L., Matus, I. R., Liang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-target+pairs+in+the+rat+kidney+identified+by+microRNA+microarray%2C+proteomic%2C+and+bioinformaticanalysis%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-target pairs in the rat kidney identified by microRNA microarray, proteomic, and bioinformaticanalysis.</a> Genome Res. 18 (3), 404-411 (2008).</li>
<li>Mladinov, D., Liu, Y., Mattson, D. L., Liang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+contribute+to+the+maintenance+of+cell-type-specific+physiological+characteristics%3A+miR-192+targets+Na%2B%2FK%2B-ATPase+%CE%B21%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs contribute to the maintenance of cell-type-specific physiological characteristics: miR-192 targets Na+/K+-ATPase β1.</a> Nucleic Acids Res. 41 (2), 1273-1283 (2013).</li>
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<li>Kato, M., Zhang, J., Wang, M., Lanting, L., Yuan, H., Rossi, J. J., Natarajan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-192+in+diabetic+kidney+glomeruliand+its+function+in+TGF-b-induced+collagen+expression+via+inhibition+of+E-box+repressors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-192 in diabetic kidney glomeruliand its function in TGF-b-induced collagen expression via inhibition of E-box repressors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (4), 3432-3437 (2007).</li>
<li>Krupa, A., Jenkins, R., Luo, D. D., Lewis, A., Phillips, A., Fraser, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+microRNA-192+promotes+fibrogenesis+in+diabetic+nephropathy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Neph%22%5BJournal%5D)">Loss of microRNA-192 promotes fibrogenesis in diabetic nephropathy.</a> J. Am. Soc. Neph. 21 (3), 438-447 (2010).</li>
<li>Wang, B., Herman-Edelstein, M., Koh, P., Burns, W., Jandeleit-Dahm, K., Watson, A., Saleem, M., Goodall, G. J., Twigg, S. M., Cooper, M. E., Kantharidis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E-cadherin+expression+is+regulated+by+miR-192%2F215+by+a+mechanism+that+is+independent+of+the+profibrotic+effects+of+transforming+growth+factor-%CE%B2%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">E-cadherin expression is regulated by miR-192/215 by a mechanism that is independent of the profibrotic effects of transforming growth factor-β.</a> Diabetes. 59 (7), 1794-1802 (2010).</li>
<li>Kato, M., Arce, L., Wang, M., Putta, S., Lanting, L., Natarajan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microRNA+circuit+mediates+transforming+growth+factor-%CE%B21+autoregulation+in+renal+glomerular+mesangial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">A microRNA circuit mediates transforming growth factor-β1 autoregulation in renal glomerular mesangial cells.</a> Kidney Int. 80 (4), 358-368 (2011).</li>
<li>Gottardo, F., Liu, C. G., Ferracin, M., Calin, G. A., Fassan, M., Bassi, P., Sevignani, C., Byrne, D., Negrini, M., Pagano, F., Gomella, L. G., Croce, C. M., Baffa, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-RNA+profiling+in+kidney+and+bladder+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Urol.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Micro-RNA profiling in kidney and bladder cancers.</a> Urol. Oncol. 25 (5), 387-392 (2007).</li>
<li>Juan, D., Alexe, G., Antes, T., Liu, H., Madabhushi, A., Delisi, C., Ganesan, S., Bhanot, G., Liou, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+microRNA+panel+for+clear-cell+kidney+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Urol%22%5BJournal%5D)">Identification of a microRNA panel for clear-cell kidney cancer.</a> Urol. 75 (4), 835-841 (2010).</li>
<li>Xu, X., Kriegel, A. J., Liu, Y., Usa, K., Mladinov, D., Liu, H., Fang, Y., Ding, X., Liang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+ischemic+preconditioning+contributes+to+renal+protection+by+upregulation+of+miR-21%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">Delayed ischemic preconditioning contributes to renal protection by upregulation of miR-21.</a> Kidney Int. 82 (11), 1167-1175 (2012).</li>
<li>Kriegel, A. J., Mladinov, D., Liang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+study+of+microRNAs+and+its+application+in+kidney+disease+and+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Translational study of microRNAs and its application in kidney disease and hypertension.</a> 122 (10), 439-447 (2012).</li>
<li>Kloosterman, W. P., Wienholds, E., de Bruijn, E., Kauppinen, S., Plasterk, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+detection+of+miRNAs+in+animal+embryos+using+LNA-moidified+oligonucleotide+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">In situ detection of miRNAs in animal embryos using LNA-moidified oligonucleotide probes.</a> Nat. Methods. 3 (1), 27-29 (2006).</li>
<li>Nelson, P. T., Baldwin, D. A., Kloosterman, W. P., Kauppinen, S., Plasterk, R. H., Mourelatos, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAKE+and+LNA-ISH+reveal+microRNA+expression+and+localization+in+archival+human+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">RAKE and LNA-ISH reveal microRNA expression and localization in archival human brain tissue.</a> RNA. 12 (2), 187-191 (2006).</li>
<li>Obernosterer, G., Martinez, J., Alenius, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Locked+nucleic+acid-based+in+situ+detection+of+microRNAs+in+mouse+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">Locked nucleic acid-based in situ detection of microRNAs in mouse tissue sections.</a> Nat. Protocols. 2 (6), 1508-1514 (2007).</li>
<li>Kriegel, A. J., Liu, Y., Cohen, B., Usa, K., Liu, Y., Liang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MiR-382+targeting+of+kallikrein+5+contributes+to+renal+inner+medullary+interstitial+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Genomics%22%5BJournal%5D)">MiR-382 targeting of kallikrein 5 contributes to renal inner medullary interstitial fibrosis.</a> Physiol. Genomics. 44 (4), 259-267 (2012).</li>
</ol>

无任何披露内容。

本文的目的是描述一种在福尔马林固定的肾脏组织中效果良好的miRNA原位杂交（in situ hybridization）实验方案。在优化该方案的过程中，已识别出多个导致染色伪影的重要来源。仔细注意这些关键点有助于避免染色伪影，并提高原位杂交实验成功的可能性。
在长时间孵育过程中，组织切片干燥是导致染色假象最可避免的原因之一。一旦发生干燥，干燥区域在NBT/BCIP显色过程中会呈现非常深的染色（图1）。在整个实验流程中，必须确保所有孵育步骤期间组织切片始终完全被液体覆盖，并且载玻片始终保持完全水平。此外，在杂交步骤和抗体孵育等长时间孵育过程中，应使用HybriSlip覆盖组织切片，以帮助防止液体蒸发。若观察到组织切片出现部分或完全干燥，则样品很难获得理想的染色结果，从而无法对这些样品中的miRNA表达进行准确解读。
在蛋白酶K消化和多聚甲醛处理步骤中，液体覆盖同样至关重要。该消化步骤的目的是允许miRNA探针进入细胞。如果在短暂孵育期间组织未能完全被液体覆盖，则未暴露于酶消化的...

microRNA 是一类小的非编码 RNA（约 22 个核苷酸长），在细胞内源性产生。它们通常通过翻译抑制或 mRNA 降解来抑制蛋白质表达。miRNA 与 mRNA 靶标结合时互补性不完全，因此单个 miRNA 可能抑制多个靶标。
了解哪些细胞类型和结构表达miRNA，是理解miRNA表达改变如何影响细胞和组织表型机制的重要部分。虽然miRNA测序、qPCR和Northern blotting等方法可用于检测整体组织中的miRNA，但这些方法无法确定miRNA具体来源于组织内的哪一类特定细胞。在使用这些方法前对细胞和结构组分进行分离非常困难，且实现有效分离所需的条件可能导致基因表达改变或RNA降解。microRNA原位杂交是一种用于可视化miRNA在组织中定位及其表达水平的技术。该技术在由异质性结构组成的组织（如肾脏）中尤为有价值。
MicroRNAs 已被证实对肾脏发育具有调控作用2,3 生理学4微小RNA表达改变也已被证实参与肾脏病理过程，例如纤维化5-10糖尿病肾病7，肾细胞癌11,12，以及急性肾损伤13在我们的研究中，我们发现优化微小RNA 原位 肾组织的原位杂交对于确定miRNA在健康和疾病状态下的确切结构定位具有重要价值14确定不同microRNA在肾小管及细胞中的表达至关重要，因为其对靶基因的调控可能依赖于细胞功能。在疾病状态下，明确miRNA表达改变如何影响功能也具有重要意义。
本方法旨在基于Kloosterman等15、其他研究者16,17以及Exiqon1所建立的原位杂交（ISH）技术，并针对福尔马林固定肾脏组织进行优化。我们已成功应用该方法，在单侧输尿管梗阻模型中鉴定出肾脏微小RNA（miR-382）表达存在明显的区域差异18。该技术也可适用于其他组织，但需进一步优化。

<table><tbody><tr><td>多聚甲醛</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Gibco</td><td>70011044</td><td></td></tr><tr><td>焦碳酸二乙酯</td><td>Sigma</td><td>D5758</td><td></td></tr><tr><td>吐温-20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>二甲苯</td><td>Sigma</td><td>534056</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Ultra Pure</td><td>200CSPTP</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Life Technologies</td><td>15506-017</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>C2536</td><td></td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>J.T. Baker</td><td>4059-00</td><td></td></tr><tr><td>柠檬酸</td><td>Sigma</td><td>C2404</td><td></td></tr><tr><td>甲酰胺</td><td>Sigma</td><td>F9037</td><td></td></tr><tr><td>20x SSC 缓冲液</td><td>Life Technologies</td><td>15557-044</td><td></td></tr><tr><td>肝素</td><td>SAGENT</td><td>25021-400-30</td><td></td></tr><tr><td>酵母 RNA</td><td>Life Technologies</td><td>AM7118</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>M8266-1004</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>J.T. Baker</td><td>4058-01</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶 K</td><td>Fermentas</td><td>EO0491</td><td></td></tr><tr><td>3&amp;rsquo; DIG- miRNA 探针</td><td>Exiqon</td><td>miR dependent-05</td><td></td></tr><tr><td>3&amp;rsquo; DIG- 随机 miR 探针</td><td>Exiqon</td><td>99004-05</td><td></td></tr><tr><td>3&amp;rsquo; DIG- U6 miR 探针</td><td>Exiqon</td><td>99002-05</td><td></td></tr><tr><td>抗地高辛抗体 Fab 片段</td><td>Roche</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>NBT/BCIP</td><td>Roche</td><td>11681451001</td><td></td></tr><tr><td>Permount 封片剂</td><td>Fisher</td><td>SP15-500</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>Fisher</td><td>根据组织大小适配</td><td></td></tr><tr><td>Microtom HM 355 S 切片机</td><td>Thermo Scientific</td><td>23-900-672</td><td></td></tr><tr><td>载片式杂交孵育箱</td><td>Boekel</td><td>241000</td><td></td></tr><tr><td>铝制托盘组件</td><td>Boekel</td><td>C2403973</td><td></td></tr><tr><td>不锈钢架插入件</td><td>Boekel</td><td>C2403754</td><td></td></tr></tbody></table>

microrna 原位 福尔马林固定肾脏组织的杂交检测

MicroRNA In situ Hybridization for Formalin Fixed Kidney Tissues

本文介绍了一种通过地高辛标记的 microRNA 探针进行原位杂交，从而在肾脏组织中实现 miRNA 比色检测的方法。in situ 杂交最初由 Kloosterman 及其同事建立，广泛适用于 Exiqon miRNA 探针1，本文对该方法进行了改进，以克服在肾脏组织中进行 miRNA 分析时固有的技术难题，包括组织结构识别困难以及探针和抗体残留难以彻底去除等问题。采用相对较薄（5 mm 厚）的组织切片，可在保留细胞内强探针信号的同时，实现肾脏结构的清晰可视化。此外，优化了探针浓度和孵育条件，以在背景信号和非特异性信号较低的情况下，有效显示 microRNA 的表达水平。本文详细描述了该优化后的实验流程，涵盖从组织采集与制备到最终载玻片封片的全部步骤。本方案的基本组分可根据需要调整，适用于其他组织及细胞培养模型的研究。

在杂交、孵育或洗涤步骤中，组织切片中发生干燥的区域通常会在NBT/BCIP显色过程中出现更深的染色。图1显示了一张肾组织切片的部分区域，其中HybriSlip从组织边缘滑脱，导致该区域部分脱水。尽管在后续步骤中进行了再水化和覆盖，脱水区域的信号仍人为增强。
控制NBT-BCIP显色时间的重要性如图2A和图2B所示。显色时间超过4-5小时会导致在肾组织中，scrambled-miR对照探针出现明显的非特异性着色（图2A）。对于高丰度靶标（如U6小核RNA对照）的探针检测，孵育时间超过4-5小时并不能改善信号强度（图2B）。
在图3中展示了本研究所述原位杂交（ISH）方法在肾组织中检测miRNA的适用性，该图改编自Kriegel 等18的研究。在该研究中，我们发现与假手术动物相比，单侧输尿管...

本文描述了一种 原位 适用于福尔马林固定肾组织切片中microRNA表达比色检测的杂交实验方案优化

MicroRNA 原位 福尔马林固定肾脏组织的杂交检测

本文介绍了一种通过地高辛标记的 microRNA 原位杂交技术对肾脏中 miRNA 进行比色检测的方法。

以下实验的总体目标是定位并定量肾脏组织中的微小RNA（micro RNA）表达。该目标首先通过将地高辛标记的探针与肾脏组织中特定的微小RNA进行杂交来实现。第二步，将带有碱性磷酸酶偶联的地高辛抗体与组织孵育。接下来，向组织中加入N-B-T-B-C-I-P底物，以通过杂交位点处显色生成蓝色产物来显示microRNA的定位。实验结果可揭示microRNA在肾脏区域及肾单位节段中的表达位置，其依据为microRNA互补探针的杂交情况。该实验采用经福尔马林固定、石蜡包埋的肾脏切片，切片厚度为5微米，并附着于显微镜载玻片上。为准备用于分析的肾脏切片，首先使用新鲜二甲苯分三次洗涤，每次五分钟，以去除组织中的石蜡。将组织切片依次浸入双蒸水中不同浓度的乙醇溶液中，每种浓度孵育五分钟，以重新水化组织切片。接着，向载玻片上加入足量的达希尔（dathyl）、过碳酸盐（percarbonate）或去西（desy），完全覆盖组织切片，处理一分钟。注意确保组织切片不干燥。移除脱蜡剂，并用经过脱蜡剂处理的 PBST 缓冲液冲洗载玻片两次，每次五分钟。确保收集含有脱蜡剂的废液，以便妥善处理。从此时起，所有试剂均应经过去RNase处理。为去除RNA，将蛋白酶K加入预热的蛋白酶K缓冲液中，使其终浓度为每毫升10微克。用蛋白酶K溶液覆盖组织切片，并在37摄氏度下孵育5分钟。迅速移除蛋白酶K溶液，加入含0.2%甘氨酸的PBST溶液，孵育30秒。用 PBST 冲洗载玻片，每次 30 秒，共冲洗两次。最后，用新鲜配制的 4% 多聚甲醛固定组织切片 10 分钟。开始此操作步骤时，每个组织切片上加入 50 微升杂交缓冲液，并覆盖略大于组织切片的无 RNase 杂交盖片。将载玻片放入加湿的杂交盒中，加湿方法为使用浸泡于 50% 甲酰胺、50% 5×SSC 溶液的实验室擦拭纸。将加湿后的杂交盒置于已预热至杂交温度的烘箱中，对组织切片进行两小时的预杂交。该杂交温度根据 3' 地高辛标记探针的特性确定，通常为探针的 DNA 解链温度（Tm）减去 21 摄氏度。例如，由于3 82探针的熔解温度（TM）为75摄氏度，其杂交温度为54摄氏度。将微小RNA探针、阳性对照和阴性对照分别用杂交缓冲液稀释至40纳摩尔进行制备。阳性对照为U六小核RNA，阴性对照为随机序列。将探针和对照在 65 摄氏度下加热五分钟。从杂交炉中取出载玻片。移除预杂交体系中的杂交盖片和过量的杂交缓冲液。将75微升含有探针的缓冲液直接加到每个组织切片上。用杂交盖片覆盖，盖片大小应恰好能够覆盖组织切片。保持载玻片架水平。将载玻片放回杂交炉中，在适当温度下继续孵育，过夜约16小时。杂交完成后，从杂交炉中取出载玻片。加入 200 微升预热至杂交温度的 2×SSC 缓冲液，从盖玻片的一侧边缘下方注入，以帮助将盖玻片从组织上分离。通过倾斜载玻片移除盖玻片。移除盖

microrna-in-situ-hybridization-for-formalin-fixed-kidney-tissues

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

微RNA<em&gt;原位</em&gt;杂交的福尔马林固定的肾组织

整体封片 原位 E8.5 至 E11.5 小鼠胚胎的杂交

在此，我们描述一种高效的高通量方法 原位...

高通量 原位 用于表征小鼠胎儿下泌尿生殖道中mRNA表达模式的杂交方法

本文介绍一种简化的微小RNA（miRNA）表达分析方案，适用于存档的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）或新鲜冷冻的前列腺癌（PCa）临床组织样本，采用定量实时聚合酶链式反应（RT-PCR）进行检测。 原位...

前列腺癌临床组织中的miRNA表达分析

本文介绍了一种利用miRNA检测乳腺癌患者样本中miRNA表达水平的实验方案 原位...

利用miRNA对乳腺癌组织进行临床病理学分析 原位 杂交

micro-RNAs（miRNAs）是一类短小且高度同源的RNA序列，可作为信使RNA（mRNAs）的转录后调控因子。目前的miRNA检测方法在灵敏度和特异性方面存在差异。本文描述了一种结合了 原位...

利用小鼠心脏切片进行组织特异性miRNA表达谱分析 原位 杂交

我们描述了一种用于激光显微切割人肾亚节段（包括肾小球、近端小管、粗升支、集合管和间质）的实验方案。随后从获得的肾区室中提取RNA，并进行RNA测序，以确定各亚节段内转录组特征的变化。...

激光显微切割技术在揭示人类肾组织区域转录组学中的应用

本文介绍了一种利用实时定量反转录聚合酶链式反应检测急性肾损伤小鼠模型肾脏中微小RNA表达水平的实验方案。该方案重点针对缺血性肾损伤小鼠模型，并强调微小RNA样本的精细提取过程。...

一种用于缺血性肾损伤小鼠模型肾脏中 microRNA 定量检测的方法

我们描述了一种通过定量反转录聚合酶链式反应检测单侧输尿管梗阻（UUO）小鼠肾脏中microRNA表达水平的方法。该方案适用于研究UUO小鼠以及其他病理条件下小鼠肾脏microRNA的表达谱。...

小鼠单侧输尿管梗阻模型中microRNA表达的定量实时PCR分析

microRNA 参与了 IgA 肾病的发病机制。我们建立了一种可靠的方法，用于检测 IgA 肾病小鼠模型（HIGA 小鼠）肾脏中 microRNA 的表达水平。这一新方法将有助于验证 miRNA 在 IgA...

免疫球蛋白A肾病小鼠肾脏中微小RNA表达的检测

在此，我们将外源性人工合成的miRNA模拟物递送至肾脏 通过 在多种肾脏疾病小鼠模型中，通过尾静脉注射非病毒载体和聚乙烯亚胺纳米颗粒，导致肾脏中靶向miRNA显著过表达，从而抑制了多种小鼠模型中肾脏疾病的进展。...

利用聚乙烯亚胺纳米颗粒在多种肾病小鼠模型中向肾脏递送外源性人工合成的miRNA模拟物

本方案描述了一种串联免疫荧光杂交检测法，利用甲醛固定石蜡包埋组织同时检测并定量 microRNA...

通过锁核酸进行微小RNA的扩增与识别 原位 杂交作为一种新型检测与定量方法

学习微RNA原位杂交技术用于福尔马林固定肾组织中microRNA的定位与定量检测。该方法通过地高辛标记探针和碱性磷酸酶显色反应，帮助研究人员可视化肾小管节段中的基因表达模式。

MicroRNA 原位福尔马林固定肾脏组织的杂交检测

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MicroRNA 原位 福尔马林固定肾脏组织的杂交检测

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