在厌氧环境中培养与维持 Clostridium difficile

本实验的总体目标是从粪便样本中分离艰难梭菌，通过培养艰难梭菌制备甘油保存菌种以实现长期储存，同时制备并计数芽孢储备，用于多种后续实验应用。该目标首先通过在选择性培养基上接种粪便样本以分离艰难梭菌来实现；第二步是在液体培养基中培养艰难梭菌，并使用甘油保存长期的艰难梭菌菌种。

接下来，从冷冻的甘油菌种中取出艰难梭菌，并在琼脂平板上划线接种。最后一步是按照这些方案制备艰难梭菌的芽孢储备菌种并进行计数。可通过在多种培养基上培养艰难梭菌以验证和确认其身份，并实现成功培养与保藏。

这些甘油菌株和培养物可进一步用于多种下游应用，包括动物实验和额外的分子生物学研究。与使用蜡烛罐等其他方法相比，使用乙烯基厌氧舱培养艰难梭菌的主要优势在于能够维持严格的厌氧环境，从而实现艰难梭菌稳定且可靠的生长。通常，初次接触这些技术的研究人员可能会因操作手套导致操作灵活性不足，以及实验前规划不充分而遇到问题。

以下操作将由我实验室的技术员 Jose Suarez 进行演示。本实验最初可在有氧条件下进行。首先，称量粪便样本。

这是从粪便样本中计数艰难梭菌所必需的步骤。然后将粪便样本重悬于1倍PBS中，并涡旋振荡以确保粪便样本充分重悬。接下来，用1倍PBS对重悬的粪便样本进行系列稀释，以便适当地分离或计数每克粪便中的菌落形成单位（CFU）。

在厌氧条件下进行该操作，以确保艰难梭菌的营养细胞不接触任何氧气。本实验所用的厌氧培养箱保持在37摄氏度。采用无菌技术操作。

将每种连续稀释液各取 100 微升（µL）涂布于 Toro 培养基、oxetane 培养基、cyclo Seine 培养基、果糖琼脂（fructose agar）或 T-C-C-F-A 平板。这些平板需在厌氧工作站中预先还原至少一至两小时，以确保去除残留氧气。用于分离菌落，以便准确定量或进行其他后续实验操作。

使用无菌接种环将接种的培养物均匀涂布在T-C-C-F-A平板表面。将平板在37摄氏度下厌氧培养48小时。48小时后，根据菌落扁平、不规则、呈磨砂玻璃样的特征鉴定艰难梭菌菌落，以确保营养态的艰难梭菌未因接触氧气而死亡。

用于分离下游应用所需菌落的平板必须始终保存在厌氧舱内。若需进行菌落计数，可将平板移出厌氧舱。需注意，一旦平板被移出舱外，艰难梭菌的营养细胞将暴露于氧气中并死亡。

即使将培养皿重新放回培养箱，这些艰难梭菌菌落也无法恢复生长。计数每个稀释度的艰难梭菌菌落，并计算每克粪便样本中的菌落形成单位（CFU）数量，用于培养并制备艰难梭菌的甘油菌种。使用无菌接种环挑取单个菌落，并在预还原的脑心浸出液培养基上进行划线接种。

使用酵母提取物或添加了0.03%半胱氨酸的BHIS琼脂平板，用新的无菌接种环对每个象限进行划线分离单个菌落。将平板置于37摄氏度下厌氧培养16至24小时。当BHIS琼脂平板上出现分离菌落时，挑取单个分离菌落，并将其悬浮于10毫升预先还原的BHIS液体培养基（添加0.03% L-半胱氨酸）中，过夜培养。

在37摄氏度厌氧条件下培养，直至培养物变浑浊。次日，取333微升50%甘油与666微升艰难梭菌培养物加入1.8毫升冻存管中。为制备分离菌株的15%甘油保存液，盖紧冻存管并混匀。

立即将菌种从厌氧培养箱中取出，并置于 -80 °C 超低温冰箱中长期保存。开始本操作时，从 -80 °C 超低温冰箱中取出艰难梭菌的冷冻甘油菌种。为防止融化。

立即将冻存的甘油菌种放入一个已预先置于负80摄氏度保存的冷却架中。使用无菌技术及无菌接种环，将装有冻存甘油菌种的冷却架带入厌氧培养箱内。取少量菌种接种于平板上，并在平板的一个象限内进行划线分离。

将平板旋转90度，使用新的无菌接种环在第二象限划线。重复此操作至第三和第四象限，以确保分离出单个菌落。立即从厌氧舱中取出冷冻甘油菌种，并放回负80摄氏度冰箱中。

将培养板在37摄氏度下厌氧培养过夜，以从艰难梭菌培养物中纯化孢子。将冷冻甘油菌种中的菌株接种至预还原的BHIS平板上。操作步骤见上一片段所示。

次日，在37摄氏度下厌氧培养过夜。将单个菌落重新划线接种至若干预先还原的70:30平板。在37摄氏度下厌氧培养24至48小时。

孢子形成后，将平板从厌氧舱中取出。用无菌接种环刮取平板上的孢子，并将其重悬于 10 毫升无菌的 1× PBS 中。弃去平板，在 3000 ×g 离心 15 分钟以收集细胞沉淀。

移去上清液，加入1毫升1×PBS重悬，以同样方式再次悬浮并离心收集沉淀。用PBS洗涤细胞两次，在4°C下孵育过夜，以促进次日对营养细胞和母细胞的裂解。随后在70°C孵育20分钟，以杀死任何残留的营养细胞。为测定每毫升菌落形成单位（CFU），将各孢子悬液在1×PBS中进行系列稀释，并接种至预还原的BHIS培养基（含0.1%吐温-80）平板上，37°C培养至少24小时后计数菌落。

孢子可在XPBS中于室温下短期保存，或在4摄氏度下长期保存。A. 此处可见在BHIS和哥伦比亚厌氧羊血琼脂培养基上培养的艰难梭菌（C. difficile）示例。

艰难梭菌（C. difficile）形成不规则的菌落，呈扁平状，具有磨砂玻璃样外观，该特征在两种培养基上均明显可见。图A显示了红霉素敏感的临床分离株艰难梭菌630 E在BHIS琼脂（一种富集型非选择性培养基）上37摄氏度培养24小时后的菌落形态。图B显示在哥伦比亚厌氧羊血琼脂上37摄氏度培养的菌落，在白光下观察时，其外观与在BHIS培养基上生长的菌落相似。

然而，使用这种培养基还可检测艰难梭菌在长波紫外光下表现出的绿色或柑橘样荧光，如图C所示。在完成该操作步骤后，还可采用其他方法，如液体培养基中的生长曲线测定、DNA和RNA分析、单菌落分离、PCR及其他适用于艰难梭菌的分子生物学技术，以及利用艰难梭菌芽孢开展动物实验，以回答更多分子生物学相关问题。观看本视频后，您应能够充分掌握如何在厌氧环境中分离、培养和维持艰难梭菌的营养细胞及芽孢。

请勿忘记，艰难梭菌是一种可引起胃肠道疾病的人畜共患病原体。针对艰难梭菌的实验必须在相应的生物安全二级条件下进行。