研究相互作用 金黄色葡萄球菌 通过流式细胞术和延时显微镜检测中性粒细胞

以下实验的总体目标是研究葡萄球菌酚溶性调节蛋白（PSMs）对人中性粒细胞的作用。首先从人血液中分离中性粒细胞，用于后续的体外分析。接着，将中性粒细胞负载荧光染料后，与一系列浓度的 PSMs 混合，同时设置加入或不加入抑制剂的组别；或者让中性粒细胞吞噬含有 PSMα 启动子驱动的绿色荧光蛋白（GFP）报告基因构建体的金黄色葡萄球菌（S. aureus）。

最终，可通过流式细胞术检测PSM刺激对中性粒细胞的活化情况，并通过荧光显微镜分析被吞噬细菌的GFP表达。利用该方法，可研究金黄色葡萄球菌、苯基、大豆、莫林斯或中性粒细胞的作用效应。

当然，该方法还可应用于许多其他细胞类型、刺激物和拮抗剂。我们在讨论如何观察PSM在中性粒细胞内作用时，首次提出了该方法中显微镜部分的设想。利用细菌GFP表达载体结合时间推移显微镜技术，使我们能够精确实现这一目标。

采集五管肝素抗凝的静脉血后，取12毫升密度为1.119克/毫升的菲可溶液（Ficoll solution），加入50毫升离心管中，然后小心地覆盖10毫升密度为1.077克/毫升的菲可溶液（Ficoll solution）。接着，用等体积的磷酸盐缓冲液（PBS）稀释血液，并将20至25毫升血液小心地分层加至每个双层菲可密度梯度上。以396 × g的离心力在22 °C下离心20分钟，注意避免破坏分层。

然后使用装有无菌移液管头的真空泵吸除上层黄色血浆和PBMC层，接着吸除第三层白色物质。现在用小型塑料移液管将每根试管中的多形核中性粒细胞（PMN）组分转移至新的50毫升试管中。

向每支试管中加入新配制的预冷PMI，该PMI中添加了人血清白蛋白或RPMI-HSA，使总体积达到50毫升。然后离心细胞，用真空泵吸除上清液，并轻轻涡旋含有红细胞和PMN的沉淀物。接着，向细胞中加入9毫升无菌去离子水，并启动计时器。

精确加入30秒。加入1毫升10倍浓缩的PBS以终止高渗休克。然后用50毫升冷R-P-M-I-H-S-A的总体积洗涤细胞。

去除上清液后，向每个因红细胞裂解而呈白色的腭片中加入一毫升 R-P-M-I-H-S-A。然后用移液器吹打重悬细胞，并将所有沉淀合并至一个离心管中。现在对细胞进行计数，并将浓度调整为每毫升一乘以十的七次方个细胞。

现在，用含有2 µM flu oh 3:00 AM的RPMI-HSA溶液，以每毫升5 × 10⁶个细胞的密度重悬细胞。用铝箔包裹试管以避光。接下来，在设定温度下振荡孵育细胞20分钟。

同时，将刺激物配制成最终浓度10倍的三倍系列稀释液。然后将30微升刺激物与等体积新配制的10倍浓缩抑制剂或缓冲液在室温下预孵育10分钟。接着，用10毫升R-P-M-I-H-S-A洗涤细胞，并将细胞重悬于新鲜R-P-M-I-H-S-A中，浓度为每毫升5×10⁶个细胞。

流式分析前，将细胞用RPMI-HSA稀释至每毫升含2 × 10⁶个细胞，每管流式管中加入200 µL细胞悬液。注意避免通过振荡或移液操作激活细胞，将第一管上机进行流式细胞仪检测。等待3秒后开始采集，经过固定时间（例如8秒）后取出试管，迅速向样本中加入50 µL最低浓度的刺激剂。

立即重新加载样品管并继续采集。完成一个稀释系列后，在测量新的系列前，使用新鲜的RPMI-HSA清洗流式细胞仪进样针。运行完最后一个样品后，使用流式细胞术分析软件分析细菌GFP表达数据。

在中性粒细胞吞噬作用后，将含有目标报告构建体的 S. ous 菌株在肉汤培养基中过夜培养，通过将细胞稀释至 OD600 为 0.01 来去除过夜培养期间表达的任何 GFP。将培养物继续培养至 OD600 达到 0.1。将细胞按 1:30 比例稀释，然后监测其生长，直至培养物再次达到 OD600 为 0.1。

然后通过离心收集细菌。用DPBS重悬细胞并洗涤一次，再重新悬浮培养物。

加入原始体积的1至10倍，使OD600达到1.0，或大约每毫升5×10⁸ CFU。现在将细菌与新分离的PNS按10:1的比例在RPMI-HSA中混合。然后向细胞溶液中加入混合人血清，使其终体积占总体积的1/10。

将细胞混合物在37摄氏度下振荡10分钟以刺激吞噬作用。然后将载有细菌的中性粒细胞稀释至每毫升5 × 10⁵个细胞，并将250微升细胞悬液转移至八孔腔室盖玻片的每个孔中。最后，在倒置显微镜下对细胞进行成像，显微镜配备40倍物镜并置于黑暗环境培养室中，每隔5至10分钟在盖玻片腔室的不同位置采集明场和GFP通道的图像，以实时追踪细菌GFP的表达。用一系列不同浓度的合成PSMα3处理中性粒细胞，可通过钙流测定观察到细胞呈剂量依赖性的快速活化。

将PSM alpha三肽与0.01%、0.1%或1%人血清预先孵育，显著抑制了该刺激物诱导钙反应的能力。在1%血清浓度下，这种抑制呈剂量依赖性，且在这些PSM alpha三肽浓度下几乎观察不到任何激活作用。

在这些图像中，显示了两个含有被吞噬细菌的中性粒细胞，这些细菌携带 PSM alpha GFP 报告基因构建体。细菌在被吞噬约一小时后开始发出荧光，表明 PSM Alpha 启动子驱动了 GFP 的表达。位于中性粒细胞外的细菌不产生荧光，说明只有在细菌被吞噬后，PSM alpha 的表达才迅速被激活。

进行此操作时，重要的是要始终使用新鲜的中性粒细胞以获得最佳结果。观看本视频后，希望您能够充分理解如何通过流式细胞术检测钙流，以及如何利用荧光显微镜检测真核细胞内细菌基因的表达。