Name: 相互作用的研究金黄色葡萄球菌 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: 了解金黄色葡萄球菌分泌的酚溶性调节蛋白对人类中性粒细胞的影响。本研究利用流式细胞术和荧光显微镜技术，分析中性粒细胞在PSM刺激下的活化反应，为免疫学研究提供重要方法。

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RN 部分获得了欧洲共同体第七框架计划下玛丽·居里欧洲重返资助项目（ERG）的资助，项目编号 268324。

1. 通过密度梯度离心法从人血液中分离中性粒细胞
<ol>
 <li>采集5管9 ml肝素抗凝的静脉血。</li>
 <li>制备双层Ficoll密度梯度（每5管血液需制备4个梯度），步骤如下：在50 ml离心管中加入12 ml密度为1.119 g/ml的Ficoll溶液，然后小心地在其上方叠加10 ml密度为1.077 g/ml的Ficoll溶液。</li>
 <li>用等体积的PBS稀释血液。</li>
 <li>将稀释后的血液小心地铺在双层Ficoll梯度上，每层梯度加20–25 ml。</li>
 <li>在22 °C条件下，以396 × g离心20分钟，使用水平转子，不启用刹车。</li>
 <li>配制含0.05%人血清白蛋白的冷RPMI培养基（RPMI-HSA）。同时准备9 ml无菌去离子H2O。将RPMI-HSA和H2O均预冷于冰上。</li>
 <li>使用真空泵吸除含有血浆（黄色）和PBMC的上层Ficoll层，以及下层白色Ficoll层（使用无菌吸头连接移液器操作）。</li>
 <li>用小型塑料移液管收集中性粒细胞（PMNs）至50 ml离心管中（每2个梯度的PMN组分收集至1管），并立即置于冰上。</li>
 <li>加入冷RPMI-HSA至终体积50 ml，于4 °C以249 × g离心10分钟。</li>
 <li>使用真空泵吸除上清液，轻轻涡旋沉淀（含红细胞和PMNs）。</li>
 <li>加入9 ml无菌去离子H2O并启动计时器。精确30秒后，立即加入1 ml 10倍浓度的PBS以终止高渗休克。注意：30秒时间极为关键。</li>
 <li>加入冷RPMI-HSA至终体积50 ml，于4 °C以249 × g离心10分钟。</li>
 <li>使用真空泵吸除上清液，将PMN沉淀用确定体积（1–2 ml）的RPMI-HSA重悬并收集至1个离心管中。</li>
 <li>测定细胞数量，并调整细胞浓度至1×107 个细胞/ml。根据供体不同，每9 ml血液可分离获得的PMN产量通常介于5×106 至3×107 个之间。</li>
</ol>
2. 人中性粒细胞钙离子动员的流式细胞术检测
<ol>
 <li>加载细胞（5 × 106 细胞/ml）与2 μM Fluo-3-AM在RPMI-HSA中混合，于室温下缓慢振荡孵育20分钟（例如使用摇床），避光操作。</li>
 <li>同时，准备一系列稀释液（例如 刺激物在最终浓度的10倍浓度下使用（3倍稀释）。本方案中使用PSMα3；但任何作用于中性粒细胞的GPCR刺激物均适用。</li>
 <li>在 RPMI-HSA 中配制 10 倍浓度的受体抑制剂。当抑制剂作用于刺激物时（例如 HDL 与 PSMα3）将25 μl刺激物与等体积的抑制剂在室温下预孵育10分钟。</li>
 <li>加入 10 ml RPMI-HSA 洗涤细胞，室温下以 249 × g 离心。将细胞重悬至 5 × 106 cells/ml</li>
 <li>实验前，将细胞稀释至2x106 细胞/ml 的 RPMI-HSA 中，并向每支流式管中加入 200 μl 细胞悬液。稀释后的中性粒细胞非常脆弱，在此浓度下放置过久会导致自发激活；剧烈振荡或移液操作同样会引发激活。</li>
 <li>将管子连接到流式细胞仪，等待3秒后开始采集。经过固定时间后（例如 8秒后，取下管子，迅速向样品中加入50 μl刺激物。立即将管子重新装回样品架并继续采集数据。</li>
 <li>从最低浓度开始，以最高浓度结束刺激。每次运行后，使用 RPMI-HSA 定期清洗流式细胞仪针头。</li>
 <li>使用流式细胞术分析软件分析数据。比较刺激物添加前后的平均荧光信号，并利用适当的阳性和阴性对照，计算每种测定稀释度下的激活强度。</li>
</ol>
或者，当抑制剂作用于受体时，可先将细胞与抑制剂预孵育。
3. 中性粒细胞吞噬后细菌GFP表达的荧光显微镜分析
<ol>
 <li>在肉汤培养基中过夜培养含有目标报告基因构建体的S. aureus菌株（如需维持报告质粒，则加入抗生素）。本实验中使用含有PSMα-GFP报告基因构建体的MW2菌株10，在50 ml塑料管中加入5 ml LB培养基进行培养。</li>
 <li>为清除过夜表达产生的全部GFP，将培养物稀释至OD660为0.01，培养至OD660达到0.1。再将该培养物按1:30比例重新稀释，监测其生长直至OD660达到0.1。通过离心收集细菌，并用DPBS洗涤一次。用原体积1/10的缓冲液重悬，使菌液OD660达到1.0，约相当于5.108 CFU/ml。</li>
 <li>在1.5 ml微量离心管中，将细菌（1.107/ml）与新鲜分离的中性粒细胞（PMNs，1.106/ml）按10:1比例混合于RPMI-HSA中，并加入混合人血清至终浓度10%。在37 °C条件下于摇床上振荡10分钟，以诱导吞噬作用。将载有细菌的PMNs稀释至5.105 PMNs/ml，取250 μl加入8孔腔室载玻片的一个孔中。</li>
 <li>在显微镜下观察含有细菌的PMNs。建议使用配备40X/0.85 NA物镜的倒置显微镜，并置于黑暗环境培养舱内，以维持稳定的37 °C环境。通过相机每隔5–10分钟在明场和GFP荧光通道中对多个预设位置采集图像，以实时追踪GFP的表达情况。</li>
</ol>

<ol><li>Rigby, K. M., DeLeo, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+in+innate+host+defense+against+Staphylococcus+aureus+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Immunopathol%22%5BJournal%5D)">Neutrophils in innate host defense against Staphylococcus aureus infections.</a> Semin. Immunopathol. 34, 237-259 (2012).</li>
<li>Voyich, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+Mechanisms+Used+by+Staphylococcus+aureus+to+Avoid+Destruction+by+Human+Neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Insights into Mechanisms Used by Staphylococcus aureus to Avoid Destruction by Human Neutrophils.</a> The Journal of Immunology. 175, 3907-3919 (2005).</li>
<li>Kobayashi, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+neutrophil+destruction+following+phagocytosis+of+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Innate+Immun%22%5BJournal%5D)">Rapid neutrophil destruction following phagocytosis of Staphylococcus aureus.</a> J. Innate Immun. 2, 560-575 (2010).</li>
<li>DeLeo, F. R., Otto, M., Kreiswirth, B. N., Chambers, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Community-associated+meticillin-resistant+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Community-associated meticillin-resistant Staphylococcus aureus.</a> The Lancet. 375, 1557(2010).</li>
<li>David, M. Z., Daum, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Community-Associated+Methicillin-Resistant+Staphylococcus+aureus%3A+Epidemiology+and+Clinical+Consequences+of+an+Emerging+Epidemic%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Community-Associated Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus: Epidemiology and Clinical Consequences of an Emerging Epidemic.</a> Clinical Microbiology Reviews. 23, 616-687 (2010).</li>
<li>Kretschmer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Formyl+Peptide+Receptor+2+Senses+Highly+Pathogenic+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">Human Formyl Peptide Receptor 2 Senses Highly Pathogenic Staphylococcus aureus.</a> Cell Host & Microbe. 7, 463(2010).</li>
<li>Prat, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+homolog+of+formyl+peptide+receptor-like+1+%28FPRL1%29+inhibitor+from+Staphylococcus+aureus+%28FPRL1+inhibitory+protein%29+that+inhibits+FPRL1+and+FPR%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">A homolog of formyl peptide receptor-like 1 (FPRL1) inhibitor from Staphylococcus aureus (FPRL1 inhibitory protein) that inhibits FPRL1 and FPR.</a> J. Immunol. 183, 6569-6578 (2009).</li>
<li>Prat, C., Bestebroer, J., de Haas, C. J. C., van Strijp, J. A. G., van Kessel, K. P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+New+Staphylococcal+Anti-Inflammatory+Protein+That+Antagonizes+the+Formyl+Peptide+Receptor-Like+1%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">A New Staphylococcal Anti-Inflammatory Protein That Antagonizes the Formyl Peptide Receptor-Like 1.</a> The Journal of Immunology. 177, 8017-8026 (2006).</li>
<li>de Haas, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotaxis+inhibitory+protein+of+Staphylococcus+aureus%2C+a+bacterial+antiinflammatory+agent%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chemotaxis inhibitory protein of Staphylococcus aureus, a bacterial antiinflammatory agent.</a> The Journal of Experimental Medicine. 199, 687-695 (2004).</li>
<li>Surewaard, B. G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactivation+of+Staphylococcal+Phenol+Soluble+Modulins+by+Serum+Lipoprotein+Particles%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Inactivation of Staphylococcal Phenol Soluble Modulins by Serum Lipoprotein Particles.</a> PLoS Pathog. 8, e1002606(2012).</li>
<li>Kubica, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Potential+New+Pathway+for+Staphylococcus+aureus+Dissemination%3A+The+Silent+Survival+of+S.+aureus+Phagocytosed+by+Human+Monocyte-Derived+Macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A Potential New Pathway for Staphylococcus aureus Dissemination: The Silent Survival of S. aureus Phagocytosed by Human Monocyte-Derived Macrophages.</a> PLoS ONE. 3, e1409(2008).</li>
<li>Surewaard, B. G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcal+alpha-phenol+soluble+modulins+contribute+to+neutrophil+lysis+after+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Staphylococcal alpha-phenol soluble modulins contribute to neutrophil lysis after phagocytosis.</a> Cellular Microbiology. , In Press (2013).</li>
<li>Queck, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAIII-Independent+Target+Gene+Control+by+the+agr+Quorum-Sensing+System%3A+Insight+into+the+Evolution+of+Virulence+Regulation+in+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">RNAIII-Independent Target Gene Control by the agr Quorum-Sensing System: Insight into the Evolution of Virulence Regulation in Staphylococcus aureus.</a> Molecular Cell. 32, 150(2008).</li>
<li>Baban, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescent+Bacterial+Imaging+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Bioluminescent Bacterial Imaging In Vivo.</a> J. Vis. Exp. (69), e4318(2012).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

在本文所述方法中，某些步骤非常关键。我们将在此强调这些步骤。
通过密度梯度离心法分离中性粒细胞时，重要的是在离心过程中及离心结束后均不得扰动各层。使用塑料移液管吸取中性粒细胞时，注意在细胞层内不要挤压吸球，以免液体排出扰动各层。此外，在渗透休克及离心步骤后，应肉眼检查中性粒细胞沉淀。如果沉淀仍呈红色，说明红细胞裂解不够充分，需再重复一次裂解步骤。若此情况频繁发生，可将去离子 H2O 的孵育时间延长最多五秒，以实现更彻底的红细胞裂解。
对于钙动员方法而言，使用新鲜分离的中性粒细胞至关重要。通常，冷藏保存时间过长的细胞反应会减弱。这些细胞可能已经发生激活，导致所添加刺激物的作用效果降低，或者已经死亡而完全不产生反应。中性粒细胞出现明显聚集是细胞不再新鲜的标志，应予以弃用。
在显微镜实验设置中，有几个关键因素需要注意。为了能够观察到细菌内部绿色荧光蛋白（GFP）的增加，必须通过多次稀释步骤并在目标基因表达水平极低或完全不表达的条件下进行培养，从而将原...

中性粒细胞（PMNs）是专职的吞噬细胞，在先天免疫应答中对抗病原体发挥关键作用 金黄色葡萄球菌 1宿主与微生物之间持续的斗争导致了双方的军备竞赛。近年来，社区相关性（CA）耐甲氧西林 S. aureus 已出现一些似乎能高效逃避中性粒细胞杀伤的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA） 2,3CA-MRSA 过度产生酚可溶性调节蛋白（PSMs）与更高毒力相关 4,5人类中性粒细胞可通过FPR2识别这些PSM，从而激活该G蛋白偶联受体 6。其中一个最早发生的事件是细胞内钙（Ca2+钙2+ 作为多种中性粒细胞效应功能（包括脱颗粒和吞噬作用）的第二信使 7。因此 Ca2+ 是评估PSMs激活中性粒细胞功能活性的非常敏感的指标。为研究PSMs对中性粒细胞的作用，需分离新鲜的中性粒细胞，并加载一种在钙离子动员时可产生荧光的染料。通过流式细胞术实验，可检测这种快速的钙离子动员过程。利用该方法，能够研究毒性物质及其他组分对中性粒细胞的直接作用，并确定其发挥活性的最低浓度。对我们而言，该方法是研究多种由微生物产生的蛋白质对中性粒细胞影响的有力工具。 S. aureus 参与免疫逃逸的蛋白，例如FPR2抑制蛋白（FLIPr） 8, FLIPr样 7和趋化抑制蛋白 金黄色葡萄球菌 (CHIPS) 9所有这些蛋白质均通过结合识别激动剂的受体，抑制中性粒细胞中的钙动员。
最近，我们的研究团队已报道，PSM 可被血清脂蛋白在功能上抑制10。这些脂蛋白在血液和人体组织中大量存在，表明 PSM 主要在细胞内环境中发挥其功能。钙动员实验的建立使我们能够精确测量血清脂蛋白对 PSM 激活中性粒细胞的影响，极低浓度血清即可产生显著抑制作用，证实了这一点。
由于PSM在血清中会受到功能抑制，我们推测PSM可能作为细胞内毒素发挥重要作用。因此，我们试图明确PSM在被吞噬后的功能。为了研究PSM在细胞内空间的表达情况，我们构建了将psmα操纵子启动子与GFP融合的报告系统。当这些S. aureus报告菌株被中性粒细胞吞噬后，可通过荧光显微镜观察到其表达被诱导10。显然，该技术可用于研究S. aureus或其他病原体在被吞噬后大量基因的表达情况。由于S. aureus在细胞内生态位中存活对于逃逸先天免疫系统至关重要11 10 12，因此研究在此生态位中被激活的基因功能，对于理解其致病机制具有重要意义。

<table><tbody><tr><td>Fluo-3, AM</td><td>Molecular Probes / Life Technologies</td><td>F-1241</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5442-03</td><td>密度 1.077 g/ml</td></tr><tr><td>Histopaque</td><td>Sigma</td><td>11191</td><td>密度 1.119 g/ml</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>52400-025</td><td>含 25 mM HEPES 和 L-谷氨酰胺</td></tr><tr><td>Leica TCS SP5 显微镜</td><td>Leica Microsystems, 荷兰</td><td>TCS SP5</td><td>物镜：HCX PL APO 40x/0.85 </td></tr><tr><td>FACSCalibur</td><td>BD Biosciences</td><td>FACSCalibur</td><td>测量过程中必须能够取出并重新放回试管</td></tr></tbody></table>

研究相互作用 金黄色葡萄球菌 通过流式细胞术和延时显微镜检测中性粒细胞

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

我们介绍了研究金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）产生和分泌的酚溶性调节蛋白（PSMs）及其他毒素对中性粒细胞作用的方法。为了研究PSMs对中性粒细胞的影响，我们通过密度梯度离心法分离新鲜的中性粒细胞。这些中性粒细胞被加载一种在钙离子动员时可产生荧光的染料。PSMs激活中性粒细胞后，会引发细胞内游离钙离子浓度迅速而短暂的升高。在流式细胞术实验中，可通过检测预先加载的染料荧光信号来监测游离Ca2+浓度升高所引发的快速钙动员过程。利用该方法，我们可以确定激活中性粒细胞所需的PSM浓度，并评估特异性或广谱性抑制剂对中性粒细胞激活的影响。	
	为了研究 PSM 在细胞内空间的表达情况，我们构建了 PSMα 操纵子启动子与 GFP 的报告融合体。当这些 S. aureus 报告菌株被中性粒细胞吞噬后，可通过荧光显微镜观察到其表达的诱导。

用于评估人中性粒细胞钙动员的流式细胞术检测
将中性粒细胞与一系列浓度的合成PSMα3共同孵育，通过钙流测定发现其可迅速激活中性粒细胞，表现为FL-1信号增强。图1显示，合成PSMα3预先与0.01%、0.1%或1%人血清孵育后，诱导钙流的能力显著受到抑制。
利用荧光显微镜分析中性粒细胞吞噬后细菌中GFP的表达
含有PSMα-GFP报告构建体的细菌在被吞噬后1至2小时开始发出绿色荧光10，表明PSMα启动子已启动表达。中性粒细胞外的细菌不产生荧光，或仅在胞外细菌形成致密的微菌落后才出现荧光信号（图2）。这些数据表明，当细菌被中性粒细胞（PMNs）吞噬后，PSMα的表达迅速被激活。
<img alt="钙离子动员图；血清浓度与 PSMα3 的关系；数据分析；生物学研究。...

我们介绍了利用流式细胞术和荧光显微镜研究金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）分泌的PSMs及其他毒素对中性粒细胞影响的方法。

我们介绍了研究金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）产生和分泌的酚溶性调节蛋白（phenol soluble modulins, PSMs）及其他毒素对中性粒细胞作用的方法。

以下实验的总体目标是研究葡萄球菌酚溶性调节蛋白（PSMs）对人中性粒细胞的作用。首先从人血液中分离中性粒细胞，用于后续的体外分析。接着，将中性粒细胞负载荧光染料后，与一系列浓度的 PSMs 混合，同时设置加入或不加入抑制剂的组别；或者让中性粒细胞吞噬含有 PSMα 启动子驱动的绿色荧光蛋白（GFP）报告基因构建体的金黄色葡萄球菌。最终，可通过流式细胞术检测PSM刺激对中性粒细胞的活化情况，并通过荧光显微镜分析被吞噬细菌的GFP表达。利用该方法，可研究金黄色葡萄球菌、苯基、大豆、莫林斯或中性粒细胞的作用效应。当然，该方法可应用于许多其他细胞类型、刺激物和拮抗剂。我们在讨论如何观察PSMs在中性粒细胞内作用时，首次提出了该方法中显微镜部分的设想。利用细菌GFP表达载体结合时间推移显微技术，使我们能够精确实现这一目标。采集五管肝素抗凝的静脉血后，将12毫升密度为1.119克/毫升的Ficoll溶液倒入50毫升离心管中，然后小心地覆盖10毫升密度为1.077克/毫升的Ficoll溶液。接着，用等体积的PBS稀释血液，并将20至25毫升血液小心地分层加到每管双层Ficoll密度梯度上。以396 × g离心20分钟，温度为22 °C，离心过程中不得中断。然后使用装有无菌移液器吸头的真空泵吸除上层黄色血浆和PBMC层，接着吸除第三层白色物质。现在用小型塑料移液器将每根试管中的多形核中性粒细胞（PMN）组分转移至新的50毫升离心管中。向每支试管中加入新配制的预冷PMI，该PMI中添加了人血清白蛋白或RPMI-HSA，使总体积达到50毫升。然后离心细胞，用真空泵吸除上清液，并轻轻涡旋含有红细胞和PMN的沉淀物。接着，向细胞中加入9毫升无菌去离子水，并启动计时器。精确加入30秒。加入1毫升10倍浓缩的PBS以终止高渗休克。然后用50毫升冷的R-P-M-I-H-S-A溶液清洗细胞。吸除上清液后，向每个因红细胞裂解而呈白色的腭部加入一毫升 R-P-M-I-H-S-A。然后用移液器吹打重悬细胞，并将所有沉淀合并至一个离心管中。现在对细胞进行计数，并将浓度调整为每毫升一乘以十的七次方个细胞。现在，用含有2 µM flu oh 3:00 AM的RPMI-HSA溶液，以每毫升5 × 10⁶个细胞的密度重悬细胞。用铝箔包裹试管以避光。接下来，在室温下振荡孵育细胞20分钟。同时，将刺激物配制成最终浓度10倍的三倍系列稀释液。然后，在室温下将30微升刺激物与等体积新配制的10倍浓缩抑制剂或缓冲液预孵育10分钟。接着，用10毫升R-P-M-I-H-S-A洗涤细胞，并将细胞重悬于新鲜R-P-M-I-H-S-A中，浓度为每毫升5×10⁶个细胞。流式分析前，将细胞用RPMI-HSA稀释至每毫升含2 × 10⁶个细胞，每管流式管中加入200 µL细胞悬液。注意避免通过振荡或移液操作激活细胞，小心地将第一管上机进行流式细胞仪检测。等待三秒后开始采集，固定时间（例如八秒）后取出试管，迅速向样本中加入50 µL最低浓度的刺激物。立即重新加载样品管并继续采集。完成一个稀释系列后，在测量下一个系列前，使用新鲜的RPMI-HSA清洗流式细胞仪进样针。运行完最后一个样品后，使用流式细胞术分析软件分析细菌GFP表达数据。在中性粒细胞吞噬作用实验后，将含有目标报告构建体的 S. ous 菌株在肉汤培养基中过夜培养。通过将细胞稀释至 OD600 为 0.01，去除过夜培养期间表达的任何 GFP。继续培养至 OD600 达到 0.1。将细胞按 1:30 比例稀释，随后监测其生长，直至培养物的 OD600 再次达到 0.1。然后通过离心收集细菌。用DPBS重悬细胞并洗涤一次，再重新悬浮培养物。加入原始体积的1至10倍，使OD600达到1.0，或大约每毫升5×10⁸ CFU。现在将细菌与新分离的PNS按10:1的比例在RPMI-HSA中混合。然后向细胞溶液中加入混合人血清，使其终体积占总体积的1/10。将细胞混合物在37摄氏度下振荡10分钟以刺激吞噬作用。然后将载有细菌的PMN稀释至每毫升5 × 10⁵个细胞，并将250微升细胞悬液转移至八孔腔室盖玻片的每个孔中。最后，在配备40倍物镜并置于黑暗环境室中的倒置显微镜下对细胞进行成像，每隔5至10分钟在腔室盖玻片的不同位置采集明场和GFP通道的图像，以实时追踪细菌GFP的表达。用一系列浓度的合成PSMα3与中性粒细胞共孵育，可通过钙流测定观察到细胞呈剂量依赖性的快速活化。将PSM alpha three肽预先与0.01%、0.1%或1%人血清孵育，显著抑制了该刺激物诱导钙反应的能力。在1%血清条件下，这种抑制呈剂量依赖性，且在这些PSM alpha three浓度下几乎看不到任何激活现象。在这些图像中，显示了两个含有被吞噬细菌的中性粒细胞，这些细菌携带 PSM alpha GFP 报告基因构建体。细菌在被吞噬约一小时后开始发出荧光，表明 PSM Alpha 启动子驱动了 GFP 的表达。位于中性粒细胞外的细菌不产生荧光，说明只有当细菌被吞噬后，PSM alpha 的表达才会迅速启动。进行此操作时，重要的是要始终使用新鲜的中性粒细胞以获得最佳结果。观看本视频后，希望您已充分了解如何通过流式细胞术检测钙流，以及如何利用荧光显微镜检测细菌基因在真核细胞内的表达。

studying-interactions-staphylococcus-aureus-with-neutrophils-flow

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

相互作用的研究<em&gt;金黄色葡萄球菌</em与中性粒细胞通过流式细胞仪和时间推移显微镜

本文首先描述了一种从人脐静脉中分离内皮细胞的实验步骤，然后展示了如何利用这些细胞在流动条件下研究中性粒细胞的跨内皮迁移。通过使用由具有玻璃光学特性的聚合物制成的低体积流动腔室，还可实现对稀有细胞群体的活细胞荧光成像。...

人脐静脉内皮细胞的分离及其在流动条件下中性粒细胞跨内皮迁移研究中的应用

来源： Barbero, A. M., 等荧光检测法在研究中的应用 结核分枝杆菌 与免疫受体SLAMF1的相互作用。 J. Vis. Exp.

使用流式细胞术分析巨噬细胞受体与致病菌的相互作用

一种用于研究中性粒细胞与生物膜相互作用的体外实验方法

该视频展示了一种研究基质细胞对白细胞募集影响的方法。在平行板流动腔模型中，促炎性细胞因子诱导内皮细胞表达黏附受体，从而促进中性粒细胞的募集和迁移。基质细胞与内皮细胞之间的相互作用会减弱中性粒细胞向内皮细胞的募集。...

基质细胞对白细胞募集影响的体外流动研究

白细胞通过细胞旁路或跨细胞途径穿过内皮单层。我们建立了一种简单的方法，用于在生理流动条件下追踪内源性连接蛋白VE-cadherin和PECAM-1在白细胞跨内皮迁移过程中的分布，以区分这两种迁移途径。...

生理流动条件下中性粒细胞跨内皮迁移过程中内皮细胞间连接的实时成像

炎症内皮从血流中募集白细胞的能力受到间充质基质细胞的调控。我们描述了两种 体外...

分析基质细胞对流动中白细胞募集的影响

本研究描述了在定义的流动条件下，通过剪切应力作用于分化的人原代内皮细胞表面产生的血管性血友病因子串，对肺炎球菌黏附进行显微监测的方法。通过应用差异免疫染色程序，该方案可进一步扩展至对特定细胞结构的详细可视化及细菌的定量分析。...

肺炎链球菌在持续流动条件下感染原代人内皮细胞

该活细菌细胞成像方案可实现随时间推移在单细胞水平上可视化多种细菌物种之间的相互作用。通过延时成像，可观察每种细菌在单培养或共培养条件下的行为，从而研究多物种细菌群落中的种间相互作用，包括单个细胞的运动性和存活能力。...

单细胞水平细菌种间相互作用的动力学可视化

本实验方案描述了中性粒细胞与生物膜相互作用的研究方法。 金黄色葡萄球菌 生物膜形成 体外 并与外周血来源的人中性粒细胞共孵育。通过显微镜检测中性粒细胞在生物膜内的定位，并定量其中性粒细胞的氧化爆发反应。...

标准化 体外 可视化和定量分析人中性粒细胞相互作用的实验方法 金黄色葡萄球菌 生物膜

本方案描述了一种利用成像流式细胞术定量测定微生物自聚集的方法。...

利用成像流式细胞术研究微生物自聚集

在本论文中，我们提供了一套全面的实验方案，用于评估铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的抗生素存活能力，通过将质粒转化至铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）和金黄色葡萄球菌（S.

延时落射荧光显微成像 铜绿假单胞菌 和 Staphylococcus aureus 异质性表型

了解金黄色葡萄球菌分泌的酚溶性调节蛋白对人类中性粒细胞的影响。本研究利用流式细胞术和荧光显微镜技术，分析中性粒细胞在PSM刺激下的活化反应，为免疫学研究提供重要方法。

研究相互作用金黄色葡萄球菌通过流式细胞术和延时显微镜检测中性粒细胞

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研究相互作用 金黄色葡萄球菌 通过流式细胞术和延时显微镜检测中性粒细胞

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