Name: 技术树内组织学习节肢动物和微生物群落 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 30 s
Description: 学习制作韧皮部三明治技术，用于观察栖息于树木韧皮层的节肢动物、螨虫、线虫和真菌等生物。该方法为森林生态系统中生物相互作用的研究和教育提供了有效工具。

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感谢 Eli Jensen、Stefano Padilla 和 Kasey Yturralde 提供的帮助，以及 Karen London 和匿名审稿人对稿件的评审。感谢 Jake Baker 和 Karla Torres 提供的视频资料。本研究由北亚利桑那大学林业学院和北亚利桑那大学技术与研究倡议基金（TRIF）向 R.W.H. 提供资助。

1. 筛管的选择与树木组织的去除
<ol>
	<li>选择具有特定特征的树木。采集松树（i.e.，Pinus 属树木）的韧皮部，因为它们具有数毫米厚的明显韧皮层。18,27 找到下部枝条较少的树木后，检查其是否存在昆虫侵害和/或病原体等其他缺陷。或者，在韧皮部夹层中可使用云杉等其他针叶树的韧皮部。9 其他树种如硬木也可能适用于韧皮部的剥离。 
	注意：树冠较大的针叶树通常具有最厚的韧皮组织。为最大限度获取韧皮部，最好选择树干（主干）上无缺陷且枝条较少的树木。自修剪型松树品种效果最佳。韧皮部通常在生长季节最厚，且树干较高处的韧皮部比靠近地面处更厚。秋季或冬季时，韧皮部有时难以从树木上剥离。</li>
	<li>砍倒树木或使用近期砍伐的原木以获取韧皮组织。选择倒树方向时，应尽量减少对目标树木及周围邻近树木的损伤。砍除主干上的枝条，以便在剥离韧皮部时更容易接触树皮材料。</li>
	<li>树木砍倒（放倒；倒在地上）后，立即使用锋利的刮刀从主干上刮除树皮（图1A）。刮除一定面积的树皮，直至暴露韧皮层。 
	注意：韧皮层通常颜色较浅（例如，呈乳白色）且湿润，而外层树皮则较干燥、颜色较深（图1B）。需特别注意不要刮伤韧皮部。刮除树皮的面积取决于所需韧皮部样本的大小。</li>
	<li>去除树皮后，使用锋利的刀具切割出韧皮部样本的轮廓。确保刀具切割至木质部（图2A）。</li>
	<li>为剥离韧皮部，从韧皮部样本的一角开始，用手指小心地将其向后剥离。可使用刀具辅助从木质部上刮下韧皮部。持续拉剥，直至整块韧皮部完全分离。 
	注意：韧皮部通常在夏季最容易从树木上剥离。若韧皮部极难剥离，可使用 spatula 形工具辅助操作。</li>
	<li>立即将韧皮部样本放入无菌袋中。为获得最佳效果，可对袋子进行真空密封（图2B）；若使用 ziploc 袋，则需将袋内空气完全排出。此举可延长韧皮部的保存时间。可选地，可将多个韧皮部样本置于同一袋中。将韧皮部储存在密封袋中，温度略高于冰点（1 至 10°C），以保持其新鲜度。</li>
</ol>
2. 制作韧皮部三明治
<ol>
	<li>切割两块相同大小的透明丙烯酸、聚碳酸酯或类似的透明硬质材料（例如，略大于韧皮部组织的玻璃片（图 2C）。将亚克力板的边缘打磨圆滑，以防止尖角撕裂Parafilm密封膜。本方案使用厚度为1/8英寸的透明亚克力板。 
	注意：切割片段的大小取决于目标生物体的需求以及研究的持续时间。例如，一对树皮甲虫使用4 dm2 为期一个月的韧皮部观测，但仅需1 dm2 如果研究在数天内进行。</li>
	<li>在一块丙烯酸材料上钻孔，以便研究生物进入。孔的大小和数量取决于实验目的。图 2D).</li>
	<li>在将韧皮部置于亚克力片之间之前，对亚克力表面进行消毒（连同 &#62; 70% 乙醇）或，若使用新的丙烯酸材料，则去除保护膜。</li>
	<li>将新鲜的韧皮部组织置于两块无菌丙烯酸板之间。根据需要，将带有孔洞的丙烯酸板朝向韧皮部的内侧或外侧。通常情况下，应使韧皮部的外侧（即原本带有树皮的一侧）朝向入口孔。</li>
</ol>
3. 封闭韧皮部夹心结构
<ol>
	<li>为在韧皮部夹心结构周围形成临时密封，使用宽2英寸的Parafilm膜条带包裹韧皮部夹心的边缘（图2C）。也可使用聚偏二氯乙烯薄膜包裹边缘进行密封。6 随后，在夹心结构两侧各放置一个夹具，将亚克力板压紧至韧皮部。确保整个表面均被夹紧，以防止亚克力板与韧皮部之间产生空隙（图2C）。若夹紧不当，样本可能在亚克力板与韧皮部之间发生移动。</li>
	<li>为形成半永久性密封，可在韧皮部周围添加非粘接性环氧树脂或凡士林。确保密封材料完全包围韧皮部。随后使用夹具或带螺栓的螺丝（可能需要提前钻孔）将亚克力板紧密固定于韧皮部。此类夹心结构的有效期最长为一至两个月。</li>
	<li>根据研究生物的氧气需求，可在夹心结构的一侧或多侧添加空气过滤器。这将允许空气进入韧皮部夹心结构，同时减少韧皮部的水分流失。我们通常使用简单的活性炭过滤器，其还可降低真菌和细菌污染的风险。</li>
	<li>对于需要自由进出的研究样本，可将其中一块亚克力板替换为木材或其他类似材料，以便昆虫钻入。这一点对于钻木昆虫的观察尤为重要，因为它们在韧皮部层次完成幼虫阶段后，会进一步钻入木质部。</li>
	<li>为防止测试对象从入口逃逸，可在孔口上覆盖小型培养皿（或其他物体、胶带），以阻断逃逸路径。由于栖息于此类空间的生物通常适应低光照环境，可能需要将夹心结构置于暗室或暗箱中，或在其上方覆盖不透光材料以遮挡光线。</li>
</ol>
4. 观察韧皮部三明治中的生物体
<ol>
	<li>将研究样本引入韧皮部三明治的入口孔（图 2D）。在红光或调至低亮度的白光下，使用解剖显微镜观察样本（图 2E）。</li>
	<li>为记录样本在韧皮部三明治内的活动或生长情况，可将相机或摄像机连接至显微镜。将专用摄像机连接至显微镜目镜（图 2E &amp;#38; F）。对于螨类、线虫和伪蝎等体型极小的生物，应使用连接至显微镜的高清摄像机。</li>
	<li>为记录声音，可将麦克风插入韧皮部三明治的入口孔，或从其侧面插入。由于入口孔较小，应使用小型麦克风，例如驻极体电容麦克风。</li>
	<li>若需从韧皮部三明治的侧面或表面记录声音，可使用压电元件（图 3B）。播放声音时，可使用同一压电元件，或将触觉激励器（激振器）连接至亚克力板顶部或底部的表面。</li>
</ol>

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</ol>

未声明利益冲突

韧皮部分层夹心法可用于引入并观察栖息于韧皮部组织中的节肢动物、微生物及其他小型生物1,7,8,9,17,18。该技术已促成多项新发现，加深了人们对树木韧皮部内生物的行为、生活史特征、发育过程及相互作用的理解1,5,10。本文所述的夹心法方案融合了以往多种设计的优点，可提供一种经济实用、仅需少量设备和材料即可轻松构建的夹心装置。玻璃、丙烯酸或聚碳酸酯片材可重复使用，唯一消耗性材料仅为帕拉菲尔膜（Parafilm）和韧皮部组织。
尽管本方案中的所有步骤都很重要，但某些步骤必须严格遵守，以确保最大程度的成功。首先，应选择树干部分无枝或少枝的树木。枝条过多的树木难以刮皮，且在去除韧皮部时需绕开每个枝条，导致获得的可用韧皮部片段较少。其次，必须尽量减少韧皮部暴露在空气中的时间。我们会在取下每一片韧皮部后立即放入袋中。当取下三至六片后，立即将其转移至真空密封袋；在野外工作中，我们使用电源逆变器连接车辆电池为封口机供电。最后，在执行本方案时对丙烯酸部件进行消毒并保持整体清洁，可减少“三明治”结构中的真菌生长，这一点对于长期观察尤为重要。
如上所述，筛管夹心装置存在一定的局限性。由于筛管层较薄，只能引入通常栖息于筛管中的小型生物。较大的昆虫，例如钻木甲虫（i.e., Buprestid, Cerambycid 物种），可被引入并观察其生命周期的早期阶段，但该观察时间通常仅限于两到三周；此后幼虫需要进入木质部木材中进行化蛹。相比之下，对于树皮甲虫，尤其是Ips属的种类，可观察到完整的生命周期，包括交配、卵孵化、取食、化蛹以及羽化为成虫。此时，夹心装置的可用性通常因干燥和真菌生长而终止。28 此外，该装置无法让昆虫自由且自然地定殖或离开筛管夹心结构。27
我们的方案在所用韧皮部的大小、形状和类型方面具有灵活性。短期研究所需的韧皮部材料较少，三明治结构的尺寸可相应调整。多种针叶树种已被用作韧皮部三明治中的韧皮部供体例如， 北美黑松12，花旗松2，云杉29，火炬松27，长叶松27）。三明治结构中的材料也可进行调整；例如，可使用玻璃板代替丙烯酸板，以及使用环氧树脂或胶带代替Parafilm。
该实验方案中最困难的部分是韧皮部的去除过程。相邻树木的韧皮部去除难度可能存在差异。当某棵树的韧皮部较难去除时，耐心尤为关键。在此类情况下，应仔细地将刀片插入坚硬的木质部与疏松的韧皮部之间进行分离。这一过程的操作感受与给树木“剥皮”完全相似。
掌握基本的夹心技术后，可对实验方案进行调整以满足特定需求。例如，通过优化去除韧皮部所需的技术，可以移除并使用更大的组织片段来制作更大的夹心结构。此外，还可对方案进行修改以适配特定仪器，例如，增加用于监测化学物质释放的孔洞（图 3A），或用于记录和播放声音的装置（图 3B）。也可进行改造，以实现对韧皮部及其共生生物的半永久性保存，或对可后续释放的生物进行临时观察。

针叶树的韧皮部和树皮组织中栖息着成千上万种生物。韧皮部取食（phloeophagy），即取食树皮内层韧皮组织的行为，通常与树皮甲虫、钻木昆虫以及多种生活在树木内部的无脊椎动物和微生物类群相关。23 树皮甲虫（鞘翅目：象甲科）除成虫短暂离开以寻找新的寄主树木外，其整个发育和生活周期均在韧皮部内完成。31 由于树皮甲虫对树木具有显著的经济影响，因此已被广泛研究18,19，但针对其在树木组织内部行为的直接观察仍十分有限。4 此外，树皮甲虫挖掘形成的坑道会成为众多物种的栖息环境。11 大量真菌30、细菌3、螨类10,21、线虫16,19以及其他捕食性和寄生性节肢动物22,24均生活在韧皮部组织中。本文所提供的技术可用于直接观察通常栖息于皮下环境中的树皮甲虫、螨类和钻木昆虫。通过对该实验方案进行轻微调整，也可用于研究真菌和细菌。
利用“韧皮部三明治”技术，可对树木组织内的树皮甲虫及其相关生物进行研究。该技术最早可追溯至1933年的文献记载，当时用于观察花斑冷杉甲虫（Dendroctonus pseudotsugae）的幼虫龄期。2 随着不同材料的出现，韧皮部三明治经历了多种改进形式。最初，该装置由一片韧皮部夹在两片玻璃板之间，并用橡皮筋压紧固定。2 此后，研究人员在制作三明治时陆续采用了夹具、胶带、胶水、塑料及其他材料。13,14,15,17,26,28 本文所述的实验方案在以往设计基础上进行了优化。例如，过去通常从三明治侧面将试验物种引入玻璃或塑料板之间的缝隙，这种设计限制了虫道扩展的方向。而在顶板上设置进入孔，可使试验物种更自由地启动自然虫道的构建。本方案的另一优势在于结构简化，仅需少量工具即可轻松制作。韧皮部三明治的使用使得对取食行为、繁殖、发育以及生物间相互作用的直接观察成为可能，而这些在以往难以实现。1,5,22 该方法也是K-12教育及科学课程与展示活动中的优秀教学工具。
在制备韧皮部三明治的过程中，存在一些细微之处，这些细节难以从文献中解读或未在论文中报道。我们认为，一种可视化（即， 需要一段视频来描述韧皮部三明治的制作过程，这将对研究取食韧皮部生物的科研人员和教育工作者具有重要价值。本实验方案提供了一种简单且经济的方法，用于观察栖息于韧皮部组织中的节肢动物、微生物及其他生物。

<table><tbody><tr><td>抽拉刀片</td><td>Big Horn Brand&amp;nbsp;</td><td>20265</td><td>11&amp;rdquo; 刀片</td></tr><tr><td>去鳞刀</td><td>American Angler</td><td>30530</td><td>9&amp;rdquo; 刀片</td></tr><tr><td>聚碳酸酯</td><td>Nexan</td><td>GE-33</td><td>厚度 0.093 英寸</td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>Fisher Scientific</td><td>S37441</td><td>宽 2&amp;rdquo;</td></tr><tr><td>夹具</td><td>Pony Jaw Opening</td><td>3201-HT-K</td><td>4&amp;rdquo; × 1&amp;rdquo;</td></tr><tr><td>真空封口机&amp;nbsp;及封口袋</td><td>FoodSaver</td><td>V2840; FSFSBF0742-015</td><td>卷装 VacLoc 真空&amp;nbsp;袋</td></tr></tbody></table>

研究树木组织内节肢动物与微生物群落的技术

Technique for Studying Arthropod and Microbial Communities within Tree Tissues

松树的韧皮部组织是成千上万种生物的栖息地。节肢动物和微生物利用韧皮部和形成层组织进行求偶、产卵、育幼、取食，或躲避树外的天敌及恶劣环境条件。由于这些生物位于树皮之下，其在韧皮部栖息环境中的活动难以直接观察。我们提供一种技术，用于保存完整的韧皮部组织，并将其制备成适用于无脊椎动物和微生物实验的样品。该装置被称为“韧皮部三明治”，可实现节肢动物、微生物及其他生物的引入与观察。该技术促进了人们对生活在树木韧皮部中生物的取食行为、生活史特征、繁殖、发育及种间相互作用的深入理解。该技术的优势包括使用低成本材料、三明治尺寸可调、可通过钻孔反复打开或引入多种生物，以及能够保持韧皮部结构的完整性与活性。韧皮部三明治是一种优秀的科学探究教学工具，适用于中小学（K-12）科学课程以及大学科研实验室。

上述方案可使研究人员观察到生活在树皮下隐蔽环境中的生物。为了说明该技术的应用，我们介绍一项来自本实验室的代表性研究，该研究采用了此技术12。在本实验中，利用韧皮部三明治法观察声学处理对树皮甲虫繁殖力、掘道距离及存活率的影响（图2E和2F）。由于使用了韧皮部三明治，得以直接观察甲虫行为，并揭示了若干有趣的发现。首先，我们通过每24小时用记号笔在丙烯酸板上标记甲虫位置，记录其每日掘道距离。该过程揭示了不同声音处理之间的显著差异，而这些差异若无韧皮部三明治则无法被察觉。其次，我们观察到特定声音处理下产卵量减少。韧皮部三明治的可移动特性使得可在解剖显微镜下进行卵的观察，而不会干扰甲虫活动。在这些观察过程中，我们使用连接至显微镜的高清摄像机记录了甲虫产卵行为。其他值得注意的观察结果包括配偶间的杀戮行为以及特定声学处理引发的飞行启动行为。韧皮部三明治检测法对研究树皮甲虫对声学处理的响应至关重要。这些发现若在树皮下环境中无法实现观察，因而对于开发应对树皮甲虫暴发的管理策略具有重要价值。
<img alt="传统木工工具；木雕过程；使用刨刀去除树皮；森林环境。" src="/files/ftp_upload/50793/50793fig1highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. A) 去除树木树皮所需的工具。项目1和2为刨刀，用于刮除树皮。项目3（短斧）和4（拉锯）可用于清除刮削区域附近的树枝。B) 使用刨刀去除树皮的过程。注意红褐色树皮下方韧皮部的浅色部分。
<img alt="A：树皮剥离机在原木上工作；B：包装好的植物样品；C：实验框架中的植物；D：植物上的昆虫；E：科研人员使用显微镜观察植物样品；F：显示植物显微结果的屏幕。" src="/files/ftp_upload/50793/50793fig2highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. A) 树皮被刮除后韧皮部的暴露情况。 B) 新鲜韧皮部样品保存于真空密封袋中。 C) 用夹子将亚克力板固定在一起形成的韧皮部夹心结构，边缘包裹Parafilm以防止韧皮部污染和干燥。 D) 钻孔进入亚克力板附近的树皮甲虫。 E) 使用显微镜观察韧皮部夹心结构。 F) 显示韧皮部夹心结构内树皮甲虫活动的视频画面。
<img alt="树木年代学样品制备的双面板设置，展示夹紧和钻孔芯分析。" src="/files/ftp_upload/50793/50793fig3highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 3"> 
图 3. A) 通过韧皮部三明治法从甲虫中采集信息素。空气正被抽过含有Super-Q吸附剂的管道。B) 利用压电式换能器（图中央）对韧皮部三明治内的山地松甲虫进行声音录制与播放。

我们提供一种保存完整树木韧皮部并对其进行观察前处理的技术。我们构建了一种称为“韧皮部三明治”的装置，可用于引入并观察栖息于韧皮部组织中的节肢动物、微生物及其他生物体。

松树的韧皮部组织是成千上万种生物的栖息地。节肢动物和微生物利用韧皮部和形成层组织进行求偶、产卵、育幼……

本实验的总体目标是构建一种称为AOL三明治的装置，该装置可用于引入并观察栖息于凋落物中的节肢动物、微生物及其他生物。所提供的实验方案经过适当微调后，已成为研究人员和教育工作者研究树皮甲虫、螨类、线虫和真菌的有效工具。首先，需确定一棵合适的树木。然后去除树皮以暴露 F flom 层。一旦取下 flom 层，就将其带回实验室，或置于两片有机玻璃之间。密封并紧密夹紧后，即可引入实验生物体。在研究中，松树具有一种独特的流体层，其厚度可达数毫米。所研究的生物体将决定需要使用哪种F流物种。我们目前位于美国亚利桑那州北部的一片黄松林中。我们正在寻找一棵理想的树，其体型适中，树冠较大，且下部枝条较少。这里我们找到了一棵合适的树。这些特征很可能使树脂流较厚且更容易采集，因为在采集树脂时，必须围绕每个枝条进行切割。以下是我们用于采伐树木的设备示例。请注意，伐树作业具有危险性，必须由具备适当安全防护装备的有经验人员进行操作。待树木安全倒地后，方可开始清除树枝。然后将原木切成便于处理的段块，通常每段长约六到八英尺，具体长度取决于树木的直径。现在开始去除树皮。以下是用于完成此操作的工具示例。在此过程中，John Ice 至关重要，需小心地刮除树皮，直至露出白色或浅黄褐色的痕迹，或可见到表示形成层的线条。切记不要损伤这一层，因为这会大大降低其后续的可用性。当树干的某一部分已充分去皮后，使用刀具切下形成层的完整片状物。必要时，在切割下侧的同时小心向上提起这一层。请注意，某些树种比其他树种更容易去除脱落的部分。耐心是关键。处理较难处理的树木时，夏季通常是清理掉落物较为容易的季节。收集到五到七片样本后，我们将它们转移到带入野外的真空密封袋中。最好将这些袋子存放在略高于冰点的环境中。现在我们已完成本方案的野外部分，返回实验室来制作三明治。以下是制作三明治所需的材料。底部放置了各种有机玻璃板和配对组件。使用封口膜密封边缘，并用夹子夹紧，以确保有机玻璃与流道之间无缝隙。将有机玻璃片切割并钻孔后，用浓度为90%或更高的乙醇进行灭菌，然后开始构建“三明治”结构：取出一片新的流道材料并进行尺寸比对。应选择适合尺寸的有机玻璃板。也可使用玻璃替代有机玻璃。还可制作不同大小的夹心装置，以适应不同生物体及试验时长的需求。例如，一对树皮甲虫可能在一个月内利用一块四平方米的倒木，但如果研究仅持续数天，则只需一块一平方米的倒木。请注意，您也可以通过改变有机玻璃板上入口点的数量，同时引入多个生物个体。这种方法有助于观察不同物种之间的竞争或捕食行为。现在使用两英寸的对二氯苯来密封边缘。也可使用其他材料进行密封，例如非-G型环氧胶或凡士林。接下来，在边缘周围放置足够数量的夹具，以将有机玻璃紧密固定在流动层上。现在我们准备介绍研究用生物体。在我们的实验室中，我们经常使用所提供的方案来观察树皮甲虫及其相关生物。该方案为我们提供了绝佳的机会，以观察诸如每日掘进长度和产卵量等多种现象。我们还可以提取化学释放物、火花甲虫、产物并进行后续分析，或者启动处理并观察其响应。此处，一只树皮甲虫正试图逃离声学处理区域。我们还观察到螨类、线虫以及昆虫捕食者在使用该方案时的行为。观看本视频后，您应能够构建一个流动式三明治装置，并根据您的特定研究需求进行修改。除了作为一种有效的研究工具外，该实验方法还非常适合从小学到大学各个阶段学生的教学与探索性学习。

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