Name: 视交叉上核神经元的同步电生理记录和钙成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: 学习视交叉上核神经元的同步电生理记录和钙成像技术，使用膜片钳电极填充钙指示剂bis-fura-2，同时测量膜电位变化与细胞内钙浓度动态，该方法可深入研究突触激活对神经元活动的影响机制。

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本工作由美国国家普通医学科学研究所资助（资助号：GM096972）。

1. 下丘脑脑片的制备
<ol>
	<li>提前获得机构动物护理和使用委员会（IACUC）对涉及动物的任何操作的批准。此处描述的动物操作程序符合《2013年美国兽医协会动物安乐死指南》，并已事先获得俄勒冈健康与科学大学机构动物护理和使用委员会的批准。 &amp;#38; 科学大学动物照护与使用委员会（IACUC）。</li>
	<li>配制 500 ml 不含 MgCl₂ 的切片缓冲液2 和 CaCl2 (表1）。用95% O₂2 和5% CO2 室温下孵育，然后加入 MgCl₂2 和 CaCl2 持续通气的同时，用蔗糖将渗透压调节至300 mOsm。使用蒸气压渗透压计测定渗透压。</li>
	<li>制备1 L不含MgCl的记录液2 和 CaCl2 (表2）。用95% O₂2 和5% CO2 然后加入 MgCl₂2 和 CaCl2 继续通气的同时，用 NaOH（10 N）将 pH 调至 7.2–7.4，用蔗糖将渗透压调至 300 mOsm。HEPES 缓冲液的添加为可选步骤，用于进一步稳定 pH。</li>
	<li>切片和记录用溶液可在使用前于冰箱中保存数天。</li>
	<li>制备3%琼脂糖，倒入无菌培养皿中（6 mm深），冷藏。</li>
	<li>切取三块大小约为 6 mm × 6 mm × 6 mm 的琼脂糖凝胶块。</li>
	<li>用异氟烷深度麻醉一只4至8周龄的Sprague-Dawley大鼠。检测麻醉深度，当足垫受夹捏后无后肢回缩反射时，表明麻醉深度适当。确认麻醉适当后，通过快速断头法处死大鼠。&#160;</li>
	<li>迅速取出脑组织，注意先切断视神经，然后将其置于冰冻的、饱和5% CO₂的切片液中2 和 95% O₂2 静置冷却 2-3 分钟。</li>
	<li>修剪脑组织。将脑组织用镊子放置在置于冰上、盛有玻璃培养皿中的湿润（用切片液湿润）圆形滤纸上。</li>
	<li>冠状面切取脑组织，去除残留的小脑和脑干，然后切除前部皮层及两侧部分，保留包含下丘脑的脑组织块，注意保护含有视交叉上核（SCN）、视神经和视交叉的一侧。</li>
	<li>在冰冷但干燥的切片机切片室中，涂抹一层足够大的氰基丙烯酸盐胶水薄膜，以固定脑组织和琼脂糖块。</li>
	<li>将冰冷的脑组织块尾侧朝下转移到胶水上，使包含视交叉上核（SCN）的一侧朝向最先切割的方向，视神经位于该侧并形成一个 &#34;V&#34; 指向上方。</li>
	<li>将琼脂糖块放置于其余三侧。用持续通入5% CO₂的冰冻切片缓冲液填充切片室。2 和 95% O₂2氰基丙烯酸酯胶水遇湿气会固化，从而固定脑组织和琼脂糖块。</li>
	<li>切取冠状下丘脑切片（220-250 &#181;m厚）包含视交叉上核（SCN）的脑片。通常选择视交叉宽度约为2-4 mm的切片，此时视交叉呈白色条带状，SCN位于其背侧，在视交叉两侧各有一个微小的“凹陷”。rd 心室（图1A).</li>
	<li>将切片置于记录室中（36 &#176;C）固定在 Leica DMLFS 显微镜载物台上。灌流室中持续灌注以 95% O₂ 混合 5% CO₂ 预先饱和的记录液（流速 2 ml/min）2 和5% CO₂2 并使用管路加热器预热。</li>
	<li>在脑片制备后0.5–8小时，对SCN神经元进行全细胞膜片钳和钙成像记录。</li>
</ol>
2. 膜片钳记录
<ol>
	<li>在半倍总体积的水中配制电极内液（细胞内液）溶液。</li>
	<li>用1 N KOH将溶液pH值调节至7.3。</li>
	<li>加入剩余的水。溶液的终末渗透压应为280-290 mOsm。</li>
	<li>将电极液通过 0.2 &#181;m 滤膜过滤，分装（0.5 ml）至微量离心管中，于 -20 ℃ 保存 &#176;C.</li>
	<li>将1 mg bis-fura-2六钾盐与99.29 μL溶剂混合，配制钙探针bis-fura-2六钾盐储备液（10 mM）。 &#181;0.2 升 &#181;m 过滤水</li>
	<li>分装至不同的离心管中（2-5 &#181;l 每份）并冷冻（-20 &#176;C）。</li>
	<li>解冻一份内液和Ca2+ 探针在使用前短暂添加。加入2 &#181;将 bis-fura-2 储存液 1 微升加入至 400 微升中 &#181;内部溶液的最终体积为50 l &#181;M 钙探针浓度。轻轻吹打混匀溶液。钙探针浓度（10–250 &#181;M）根据实验设计和成像系统的不同而有所变化。请注意，bis-fura-2 由两个相连的 fura-2 分子组成。</li>
	<li>分两个阶段拉制全细胞膜片钳电极，使其外径尖端直径约为1 &#181;兆欧姆（7-10 MΩ）&#937; 用细胞内液填充时。</li>
	<li>用少量回填电极 &#181;含钙探针的内液，经4 mm注射器滤器（0.2）过滤 &#181;m) 通过Microfil管对低体积样品进行操作。</li>
	<li>在红光照射下，通过视频监视器观察，将电极引导进入记录室时，对其施加少量正压。&#160;</li>
	<li>使用低倍物镜（4X）将微电极置于视交叉上核（SCN）上方。SCN表现为位于第三脑室两侧、视交叉背侧的两个半透明区域。图1A).</li>
	<li>将显微镜切换至高倍放大（40X 或 63X）。在更高放大倍数下，可针对视交叉上核（SCN）的亚区及单个 SCN 神经元进行记录。</li>
	<li>将微电极向前推进至神经元表面时，施加轻微的正向压力。</li>
	<li>对微电极施加轻柔的负压，以形成电阻为3-10 GΩ的封接&#937;.</li>
	<li>使用采集软件控制的放大器将膜电位调节至 -60 mV。</li>
	<li>对电极施加额外的负压，以破裂细胞膜，进入全细胞记录模式。</li>
	<li>进入全细胞模式后，SCN神经元的胞体和树突会充满荧光探针。</li>
	<li>在监测和存储钙探针图像数据的同时（如下所述），以电流钳模式测量膜电位，或以电压钳模式测量电流。在实验过程中查看采集到的图像以及340 nm/380 nm荧光比值的数据图。</li>
</ol>
3. 细胞内 Ca2+ 的测定
<ol>
	<li>定量 Ca2+ 通过单色器以10 nm带宽、分别在340 nm和380 nm波长下快速激发组织，并经UG11光学滤光片过滤以阻断400 nm以上谐波波长，再经400 nm DCLP二向色镜反射，发射光通过510 nm滤光片，记录一对图像以获取测量数据。&#177;40 nm 发射滤光片</li>
	<li>使用冷却CCD相机采集图像，通过调整曝光时间和像素合并模式，以最小化光漂白并最大化记录速度。</li>
	<li>使用定量成像软件采集和显示图像。</li>
	<li>从初始图像中选择感兴趣区域，以转换为相对荧光强度单位数据（即.&#160;胞体，树突，&#160;等等。）。同时选择一个区域用于测量背景荧光（图1B).</li>
	<li>原始图像和定量的光学数据在实验过程中持续保存。实验结束后，通常会重新分析所保存的图像，以便有更充足的时间更精确地选定需定量的目标区域。</li>
	<li>数据可以表示为估计的细胞内钙离子浓度（Est[Ca2+]i)。通过340 nm激发后发射光强度与背景扣除后的比值（R）除以380 nm处的相应比值，并结合340 nm和380 nm处的最大与最小荧光强度，用于计算钙离子浓度4使用数据分析软件进行背景扣除及其他计算。</li>
	<li>一个 在&#160;体外 使用10 mM CaCl可测定bis-fura-2荧光的最大值和最小值2 用于 Ca2+ 结合态与10 mM EGTA用于Ca2+ 自由条件。Ca2+ 探针的解离常数 Kd 取 bis-fura-2（Invitrogen）的值为 370 nM。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

上述方法提供了一种强大的工具，可用于同时记录神经元膜电活动与细胞内钙浓度之间的关联。该方法具有多项优势，它结合了两种已被充分表征的技术——全细胞膜片钳记录和利用荧光染料检测细胞内钙浓度。我们的方法与此前其他研究者所描述的方法相似6,23。
使用该方法时需考虑若干因素。首先是采用全细胞膜片钳构型，这会导致细胞内含物与微电极内液发生透析。透析可能引起电压门控离子通道的衰减以及第二信使介导信号的丢失24-26。其次，细胞损伤或千兆欧封接的破坏可能导致钙水平升高，这可能与细胞输入电阻降低相关24。第三，在填充微电极前，应将含有探针的细胞内溶液过滤，以避免堵塞微电极尖端。通过尽量减少这些因素的影响，可在膜片钳神经元中同时记录细胞内钙浓度和膜电活动超过30分钟。我们曾成功采用β-豆荚素穿孔膜片钳技术27结合双呋拉-2（bis-fura-2）以减缓透析并延长记录时间。第四，钙及螯合剂EGTA或BAPTA通常被添加至细胞内溶液中，用于稳定细胞内钙浓度。然而，在我们的记录条件下并未添加这些成...

已知神经元中基因表达的变化是突触信号传导的结果。兴奋性神经递质谷氨酸的信号传导可使神经元膜电位去极化，最终导致基因的转录与翻译1,2。谷氨酸激活离子型受体后，允许细胞外钙离子进入细胞，钙离子被认为作为第二信使在激活基因转录过程中发挥关键作用。要评估膜电活动（如动作电位发放频率）与细胞内钙离子浓度变化之间的关系，需要结合两种方法——全细胞膜片钳技术和荧光钙探针的定量成像技术3-5，从而可在单个神经元中研究这种关系。单细胞记录技术可记录脑内特定区域单个神经元的活动。全细胞记录技术能够控制膜电压或膜电流，从而实现对特定离子通道电流的实验性操控。使用充满荧光钙探针的微电极还可确保神经元被充分填充钙探针。该技术在处理成年动物脑切片样本时具有明显优势，因为这些神经元使用更常见的细胞渗透性探针难以负载，且该方法可减少潜在的背景荧光干扰问题6-8。
光是哺乳动物调节其位于下丘脑视交叉上核（SCN）的昼夜节律钟的主要方式。视网膜中转换的光信号通过视网膜下丘脑束（RHT）传递9-11，并在SCN中释放谷氨酸12,13。谷氨酸激活位于SCN神经元上的NMDA和AMPA离子型受体，导致钙离子和钠离子内流，进而启动细胞内信号级联反应，最终改变一组时钟基因的表达14-17，并引起昼夜节律钟的相位偏移18-20。然而，钙离子可通过离子型谷氨酸受体直接进入神经元，也可通过膜去极化及电压依赖性钙通道（VDCC）的激活进入细胞21。因此，我们建立了一种实验方案，用于研究SCN神经元中细胞内钙离子浓度与膜电活动之间的关系，例如动作电位发放和突触输入所引发的变化22。

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific 公司</td><td>S271-3</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific 公司</td><td>P217-500</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;bull;H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma化学公司</td><td>S-9638</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;bull;6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Fisher Scientific 公司</td><td>M33-500</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;bull;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Fisher Scientific 公司</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>D-葡萄糖</td><td>Fisher Scientific 公司</td><td>D16-500</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO₃&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific 公司</td><td>S233-500</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Fisher Scientific 公司</td><td>S5-500</td><td></td></tr><tr><td>D-葡萄糖酸钾</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4500</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>腺苷5′&amp;prime;三磷酸二钾盐二水合物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8937</td><td></td></tr><tr><td>鸟苷-5′&amp;prime;三磷酸三钠盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9002</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖（超纯）</td><td>Life Technologies</td><td>15510-027</td><td>将凝胶倒入无菌培养皿，形成6 mm厚的层</td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-6310</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-5881</td><td></td></tr><tr><td>双呋拉-2，六钾盐</td><td>Invitrogen</td><td>B6810</td><td>细胞非通透性</td></tr><tr><td>设备名称</td><td>公司</td><td>货号</td><td>评论</td></tr><tr><td>切片机</td><td>Leica</td><td>VT1000S</td><td>组织切片</td></tr><tr><td>氰基丙烯酸酯胶水（Roti-Coll1）</td><td>卡尔·罗斯特有限责任公司</td><td>货号 0258.1</td><td></td></tr><tr><td>微电极拉制仪</td><td>Narshige International USA</td><td>PP-83</td><td></td></tr><tr><td>微电极毛细管</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B150F-4</td><td></td></tr><tr><td>Microfil 34 g</td><td>World Precision Instruments</td><td>MF34G-5</td><td></td></tr><tr><td>注射器滤器</td><td>康宁</td><td>#431212</td><td></td></tr><tr><td>显微镜</td><td>Leica</td><td>DM LFS</td><td>配备4倍、40倍紫外和63倍紫外物镜，以及落射荧光装置</td></tr><tr><td>CCD相机</td><td>滨松</td><td>ORCA ER</td><td>12 bit CCD</td></tr><tr><td>Fura-2滤光立方体</td><td>染色</td><td>71500A</td><td>使用 UG11 滤光片设置</td></tr><tr><td>多色染料 IV</td><td>Till Photonics GmBH</td><td></td><td>单色计时器</td></tr><tr><td>紫外线阻隔安全眼镜</td><td>紫外产品</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EPC-9 放大器</td><td>HEKA Eletronik</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metafluor</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>成像软件</td></tr><tr><td>Patchmaster</td><td>HEKA Eletronik</td><td></td><td>数据采集软件</td></tr><tr><td>Igor version 6</td><td>Wavemetrics</td><td></td><td>电生理学 &amp;和 Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; 数据分析</td></tr><tr><td>VAPRO 5520</td><td>Westcor</td><td></td><td>蒸气压渗透压计</td></tr></tbody></table>

同时记录视交叉上核神经元的电生理活动与钙成像

Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons

同时采用电生理记录与荧光成像方法，用于研究膜电位或电流变化在调控细胞内钙离子浓度中的作用。环境条件的改变（例如明暗周期）可调节下丘脑视交叉上核（SCN）中神经元及神经网络的活动，以及该区域作为哺乳动物脑内主生物钟所在部位的一系列昼夜节律钟基因的表达。兴奋性突触传递可导致突触后细胞内Ca2+浓度升高，这一过程被认为能够激活信号通路，从而改变昼夜节律钟基因的节律性表达。本研究使用含SCN的下丘脑脑片，通过填充有钙离子指示剂双呋拉-2（bis-fura-2）的内液微电极进行膜片钳记录。当微电极与SCN神经元膜之间形成高阻封接后，通过轻柔负压使细胞膜破裂，钙探针随之扩散进入神经元，填充胞体及树突区域。在记录膜电位或膜电流的同时，同步进行细胞内钙离子浓度的定量比率测量。利用这些方法，可研究突触活动及单个神经元动作电位发放所引起的细胞内钙离子浓度变化的作用。在本演示中，我们展示了在脑片中维持的单个SCN神经元上，同步记录其电生理活动与细胞内钙信号的技术方法。

利用下丘脑脑片，我们在全细胞模式下同时记录了电压钳和电流钳条件下细胞内钙离子的变化。如图1A所示，在高倍镜（40X 或 63X 紫外物镜）下，将微电极在施加少量正压的情况下缓慢下移至目标位置。接触神经元后，通过轻柔抽吸形成吉欧姆封接。在电压钳模式下，将细胞膜电位设定为 -60 mV 后，进一步施加抽吸以破裂膜片，形成全细胞记录构型。在显微镜监视器上可观察到神经元迅速被探针填充。与胞体处于相似焦平面的树突结构也可被观察到（图1A插图）。此外，也可调整焦平面以测量远端树突中的钙离子变化。在 -60 mV 电压钳模式下，我们通过施加短暂（2 毫秒）至 +20 mV 的电压阶跃（频率为 10 Hz）来模拟动作电位的发放，该频率处于许多视交叉上核（SCN）神经元日间动作电位发放率的生理范围内（图1B和1C）。对神经元的不同兴趣区域（ROI），包括近端树突，进行定量分析，并在每个波长下扣除背景信号，以计算在 340 nm 和 380 nm 激发光激发下发射荧光的比值（图1B，插图）...

本文描述了同时记录膜电位或电流以及细胞内钙离子浓度变化的方法。通过全细胞膜片钳配置的膜片钳电极，将钙离子指示剂bis-fura-2导入视交叉上核神经元中。

同时采用电生理记录与荧光成像方法，以研究膜电位或电流变化在……中的作用

以下实验的总体目标是研究电压或电流变化（例如动作电位发放频率的变化）与视上核神经元内钙离子浓度之间的相互关系。该目标通过以下步骤实现：首先制备脑切片，以便使用充满钙离子敏感探针的微电极记录视上核神经元的活动；第二步，将微电极与神经元膜形成密封。 接下来，通过破裂与微电极密封的神经元膜，将钙荧光探针导入单个神经元，同时记录膜电活动。获得的结果可显示电压或电流的测量值，以及两种波长下钙探针荧光的图像；这两个波长荧光强度比值的变化反映了神经元内钙离子浓度的改变。随后可进一步分析以确定细胞内的钙浓度。该技术的主要优势在于，可在单个室旁核神经元中同时测量突触激活所引起的膜电活动变化和细胞内钙离子变化。演示该技术的是我的同事 Dr. Robert Irwin。首先将大鼠脑置于玻璃培养皿中，培养皿内放置一张用切片液润湿的圆形滤纸，并将培养皿置于冰上。进行冠状切面切割，仅去除小脑和脑干，然后切去大脑左右两侧的部分皮层，保留包含下丘脑的脑组织块，同时小心保护包含视交叉上核（SCN）、视神经和视交叉的脑腹侧区域。随后，在冰冷的切片机切片室中，涂抹一层足够大的Sano丙烯酸胶薄层，用于固定脑组织块和琼脂块。将冰冷的脑组织块侧面朝下转移到胶水上，使包含视交叉上核（SCN）的一侧朝向最先切割的位置，视神经形成一个向上的“V”形，并将琼脂块放置在另外三个侧面。随后，向切片室中加入冰冷的切片缓冲液，并持续通入碳氧混合气体。Sano丙烯酸胶在水分作用下会固化，从而固定脑组织和琼脂块的位置。然后切取包含视交叉上核（SCN）的冠状下丘脑切片，厚度为220至250微米。注意左侧的脑块在切片过程中脱落，这可能是由于胶水涂抹不足所致。随后，确定包含视交叉上核（SCN）的脑片。通常选择视交叉宽度约为2至4毫米的脑片，视交叉呈白色带状结构，而SCN位于其背侧，在第三脑室两侧的视交叉上表现为两个微小的凹陷。将一片脑组织转移至置于显微镜载物台上的36摄氏度记录室中。以每分钟两毫升的速度持续灌注记录液填充记录 chamber。用95%碳氧混合气体（carbogen）进行充气，并通过串联加热器预热。在透射光照射下，视交叉呈现一条黑色带状结构，其背侧为第三脑室两侧的两个半透明视交叉上核（SCN）核团，据此可识别SCN。为准备用于记录的微电极，使用四毫米注射器滤器过滤含有钙探针的内液，并通过微填充管将滤液注入微电极内部。然后将微电极插入微电极持器中。接着，向电极施加少量持续的正压。在红光照明的引导下，将微电极放入记录室中。然后使用低倍物镜将微电极置于视交叉上核（SCN）上方。随后，切换显微镜至高倍放大模式，以选择 SCN 的特定亚区域及单个 SCN 神经元。继续在推进微电极至细胞表面时施加轻柔的正向压力。一旦电极到达细胞表面，施加轻柔的负向压力，以形成电阻为3至10吉欧姆的封接。随后，将膜电压调节至负60毫伏。然后对电极施加额外的负压，以破裂细胞膜，形成全细胞膜片钳。进入全细胞模式后，SCN神经元的胞体和树突将被荧光探针填充。在电流钳模式下测量膜电位，或在电压钳模式下测量电流。在监测和存储钙探针图像数据的同时，可实时查看所采集的图像以及340纳米和380纳米荧光比值的图表。实验过程中，使用单色计通过快速将视交叉上核（SCN）暴露于紫外光下来定量获取钙离子测量数据。在340纳米和380纳米波长下，激发光依次通过UG 11光学滤光片以阻隔400纳米以上的谐波波长，并由400纳米DCLP二向色镜将光线反射至组织样本上。发射的光通过510纳米的发射滤光片，并由相机捕获。为分析结果，需从初始图像中选择一个感兴趣区域和一个背景区域，以转换为相对荧光强度单位。在实验过程中，感兴趣区域的数据可实时观察。背景信息将在后续的数据分析中使用。这是一张包含视交叉上核（SCN）和视交叉的下丘脑冠状切片的明场图像。一根充满含有BISRA2的内液溶液的玻璃微电极被密封在单个神经元上。图中显示的是从电压钳制的SCN神经元记录到的一系列50次电压阶跃所引发的钙反应。电压门控钠电流通过0.5微摩尔TTX抑制，此图为与钙反应相对应的胞体和树突区域的屏幕截图。这些是钙反应对不同数量电压阶跃的示例。该图展示了膜电位与细胞内钙离子的同步记录。在视交叉上核（SCN）神经元中，于含有50微摩尔河豚毒素的条件下进行电流钳实验。膜电位的小幅去极化引发了一系列动作电位的爆发，同时伴随细胞内钙离子浓度的相应上升及随后下降。观看本视频后，您应能够充分了解如何制备健康的超薄美容核脑片，并进行同步的电生理与成像实验。请务必注意，使用紫外光可能具有极高危险性，在执行该操作时，应始终采取适当预防措施，例如佩戴合适的眼部防护装备。

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