同时记录视交叉上核神经元的电生理活动与钙成像

以下实验的总体目标是研究电压或电流变化（例如动作电位发放频率的变化）与视上核神经元内钙离子浓度之间的相互关系。该目标通过以下步骤实现：首先制备脑切片，以便使用充满钙离子敏感探针的微电极记录视上核神经元的活动；第二步，将微电极与神经元膜形成密封。

接下来，通过破裂与微电极密封的神经元膜，将钙荧光探针导入单个神经元，同时记录膜电活动。获得的结果可显示电压或电流的测量值，以及两种波长下钙探针荧光的图像；这两个波长荧光强度比值的变化反映了神经元内钙离子浓度的改变。随后可进一步分析以确定细胞内的钙浓度。该技术的主要优势在于，可在单个室旁核神经元中同时测量突触激活所引起的膜电活动变化和细胞内钙离子变化。

演示该技术的是我的同事 Dr. Robert Irwin。首先将大鼠脑置于玻璃培养皿中，培养皿内放置一张用切片液润湿的圆形滤纸，并将培养皿置于冰上。进行冠状切面切割，仅去除小脑和脑干，然后切去大脑左右两侧的部分皮层，保留包含下丘脑的脑组织块，同时小心保护包含视交叉上核（SCN）、视神经和视交叉的脑腹侧区域。随后，在冰冷的切片机切片室中，涂抹一层足够大的Sano丙烯酸胶薄层，用于固定脑组织块和琼脂块。

将冰冷的脑组织块侧面朝下转移到胶水上，使包含视交叉上核（SCN）的一侧朝向最先切割的位置，视神经形成一个向上的“V”形，并将琼脂块放置在另外三个侧面。随后，向切片室中加入冰冷的切片缓冲液，并持续通入碳氧混合气体。Sano丙烯酸胶在水分作用下会固化，从而固定脑组织和琼脂块的位置。

然后切取包含视交叉上核（SCN）的冠状下丘脑切片，厚度为220至250微米。注意左侧的脑块在切片过程中脱落，这可能是由于胶水涂抹不足所致。

随后，确定包含视交叉上核（SCN）的脑片。通常选择视交叉宽度约为2至4毫米的脑片，视交叉呈白色带状结构，而SCN位于其背侧，在第三脑室两侧的视交叉上表现为两个微小的凹陷。将一片脑组织转移至置于显微镜载物台上的36摄氏度记录室中。

以每分钟两毫升的速度持续灌注记录液填充记录 chamber。用95%碳氧混合气体（carbogen）进行充气，并通过串联加热器预热。在透射光照射下，视交叉呈现一条黑色带状结构，其背侧为第三脑室两侧的两个半透明视交叉上核（SCN）核团，据此可识别SCN。

为准备用于记录的微电极，使用四毫米注射器滤器过滤含有钙探针的内液，并通过微填充管将滤液注入微电极内部。然后将微电极插入微电极持器中。接着，向电极施加少量持续的正压。

在红光照明的引导下，将微电极放入记录室中。然后使用低倍物镜将微电极置于视交叉上核（SCN）上方。随后，切换显微镜至高倍放大模式，以选择 SCN 的特定亚区域及单个 SCN 神经元。

继续在推进微电极至细胞表面时施加轻柔的正向压力。一旦电极到达细胞表面，施加轻柔的负向压力，以形成电阻为3至10吉欧姆的封接。随后，将膜电压调节至负60毫伏。

然后对电极施加额外的负压，以破裂细胞膜，形成全细胞膜片钳。进入全细胞模式后，SCN神经元的胞体和树突将被荧光探针填充。在电流钳模式下测量膜电位，或在电压钳模式下测量电流。

在监测和存储钙探针图像数据的同时，可实时查看所采集的图像以及340纳米和380纳米荧光比值的图表。实验过程中，使用单色计通过快速将视交叉上核（SCN）暴露于紫外光下来定量获取钙离子测量数据。在340纳米和380纳米波长下，激发光依次通过UG 11光学滤光片以阻隔400纳米以上的谐波波长，并由400纳米DCLP二向色镜将光线反射至组织样本上。

发射的光通过510纳米的发射滤光片，并由相机捕获。为分析结果，需从初始图像中选择一个感兴趣区域和一个背景区域，以转换为相对荧光强度单位。在实验过程中，感兴趣区域的数据可实时观察。

背景信息将在后续的数据分析中使用。这是一张包含视交叉上核（SCN）和视交叉的下丘脑冠状切片的明场图像。一根充满含有BISRA2的内液溶液的玻璃微电极被密封在单个神经元上。

图中显示的是从电压钳制的SCN神经元记录到的一系列50次电压阶跃所引发的钙反应。电压门控钠电流通过0.5微摩尔TTX抑制，此图为与钙反应相对应的胞体和树突区域的屏幕截图。这些是钙反应对不同数量电压阶跃的示例。

该图展示了膜电位与细胞内钙离子的同步记录。在视交叉上核（SCN）神经元中，于含有50微摩尔河豚毒素的条件下进行电流钳实验。膜电位的小幅去极化引发了一系列动作电位的爆发，同时伴随细胞内钙离子浓度的相应上升及随后下降。

观看本视频后，您应能够充分了解如何制备健康的超薄美容核脑片，并进行同步的电生理与成像实验。请务必注意，使用紫外光可能具有极高危险性，在执行该操作时，应始终采取适当预防措施，例如佩戴合适的眼部防护装备。