废水衍生的电活性微生物生物膜：生长、维护和基本表征

该程序的总体目标是从废水接种物中生长阳极电活性微生物生物膜，并表征其生物电催化特性。这是通过首先设置、接种和启动潜在的静态控制生物电化学补料分批反应器来实现的。第二步是使用 Krono 高温法监控当前生产。

接下来，在底物耗尽后定期更换介质，直到达到可重复的最大电流密度，代表稳态生物膜的形成。最后一步是在底物存在和不存在期间使用循环体积遥测研究电活性细菌的细胞外电子转移。最终，数据分析为微生物电子转移热力学提供了基本见解，并允许确定可能的和实际的细胞外电子转移位点的形式电位。

该技术的主要优点是可以直接了解微生物和固体电极之间的电子转移，从而获得有关微生物细胞外电子转移的基本信息。通常，刚接触该方法的人将难以选择正确的参数和正确解释派生的图。在数据采集和数据分析过程中，可能会犯严重的错误。

在开始此过程之前，使用磷酸盐缓冲液制备适量的生长培养基，包括根据以下参考的进一步营养物质。使用 10 毫摩尔的乙酸钠作为底物。每 20 毫升生长物加入 1 毫升初级废水，培养基作为接种物。

然后将针头插入培养基中，用氮气冲洗至少半小时。要在用氮气冲洗时对其进行脱气，请测量三个电极设置的电极尺寸。通过硅胶塞将工作电极、对电极和参比电极插入改良的四颈 250 毫升圆底烧瓶中。

用 Paraform 包裹硅胶塞以密封系统，同时用氮气冲洗。将 250 毫升生长培养基和接种物混合物通过采样口倒入反应器中。用硅胶塞关闭采样口，并用 perfil 密封。

将容器置于 35 摄氏度的温控室中，以确保恒定的环境条件。接下来，将电极连接到电位统计器的相应电缆。打开软件以控制潜在统计数据并选择技术。

Chrono 高温测量。将工作电极设置为 0.2 伏特的恒定电位，持续 500 小时，之后每 600 秒记录一次，启动计时高温法并观察测得电流随时间变化的曲线。计算优先电流密度后，将测得的电流密度绘制为时间的函数。

当氧化电流达到平台期并恢复为零电流后，暂停计时安培公制测量以进行介质交换。因此，将容器转移到层流箱中，并用氮气冲洗系统。小心地排出培养基，并在补充培养基后补充新鲜的脱通气培养基。

关闭采样口并用 Paraform 密封。重复前面的步骤，直到最大氧化电流达到稳定状态 在每个生长周期后，取 1 毫升新鲜和交换的培养基溶液样品，通过 HPLC 进行底物分析。要研究细胞外电子转移，请在电位统计控制软件中选择技术循环体积遥测。

然后将工作电极的初始电位 EI 设置为相对于参比电极的负 0.5 伏，将顶点电位 E 设置为 1 至 0.3 伏，将最终电位 E 设置为 2 至负 0.5 伏。使用每秒 1 毫伏的扫描速率。开始实验并记录至少三个循环以获得可重现的 cv。

在计算优先电流密度后，将测得的电流密度绘制为工作电极电位的函数。从计时安培公制测量中，可以测量最大电流密度和 Kula 效率。这里显示的是用补料分批反应器的几个生长周期的典型计时生物膜生长曲线。

在初始滞后阶段之后，第一个电流密度最大值开始，然后由于衬底耗尽，电流减少到几乎为零的电流。在底物补充之后。电流密度会随着最大电流密度的增加而再次增加。

经过几个生长周期后，最大电流密度是恒定的，这表明形成稳态生物膜。作为稳态最大值。电流密度值取决于几个参数。

它通常被认为是电活性微生物生物膜电极系统的一个特性。第二个作特性是组效率，即每个进料批量周期记录为电流的电子数，与理论最大电子数相关。有关如何计算呼叫效率、电流和所示的理论最大电子数的详细信息，请参阅文本协议。

以下是非换人情况的典型简历。在高扫描速率下，高扫描速率下生物膜的 CV 如图所示，其中只能识别一个峰对，从而可以识别一个正式的潜在 EF。这里。通常，氧化还原对的形式电位可以根据氧化峰 EPA 的峰电位和相应物质 EPC 的还原峰来计算。

通过形成算术平均值，有关如何计算形式势的详细信息，请参阅文本协议。当对相同的生物膜应用足够低的扫描速率时，最多可以识别四个氧化还原对。然而，非翻转 CV 仅显示电极上的所有氧化还原活性化合物，从而显示可能的细胞外电子转移位点的 EF。

在进一步分析非营业额 CV 时，只有对营业额 CV 的分析才能提供实际 EET 站点的 EF。可以分析其他特性参数，如峰值分离、最大峰值电流和最小峰值电流密度。这些参数，尤其是以不同的扫描速率记录时，可用于电极电子转移过程的机理和动力学分析。

然而，这种在化学系统中已经建立起来的动力学分析对于电活性微生物生物膜来说并不简单。在有衬底的情况下进行 CV 测量时，可获得周转 CV。绘制数据后，观察到典型的 S 形生物电催化曲线。

在进一步分析数据时，一阶导数的最大值或曲线的拐点提供了实际 EET 位点的正式潜在 EF。在较薄的地杆菌比率占主导地位的生物膜的情况下，可以观察到两个拐点。随后，该衍生物显示了两个最大值，对应于生物电催化活性 EET 位点的形式电位，分别表示为 EF 2 和 EF 3。

这一发现还表明，与形式电位 EF 1 和 EF 4 相关的氧化还原过程与生物电解无关。随着生物膜的生长和变厚，CV 只显示一个拐点。与银、氯化银相比，这种形式电位 EEF 为负 0.32 伏特，大致等于分配给薄生物膜 EET 的两个形式电位的算术平均值。

这一结果表明，基本 CV 分析确实以快速和非侵入性的方式提供了对 EET 热力学的见解。一旦掌握，该技术就可以很容易地针对不同的感兴趣系统进行定制，并且根据数据，如果执行得当，确实允许进行不同深度的数据分析。按照这个程序并学习微生物生物膜几何学的基础知识，人们可以轻松学习其他方法，如方波遥测或电化学阻抗谱，以及深入的数据分析。