由废水中提取的电活性微生物生物膜：生长、维护与基本表征

本实验的总体目标是利用废水接种物培养一种阳极电活性微生物生物膜，并表征其生物电催化特性。首先，通过建立并启动一个电位静态控制的生物电化学补料分批式反应器进行接种；第二步，采用恒电位计时电流法监测电流的产生情况。

接下来，在底物耗尽后定期更换培养基，直至达到可重复的最大电流密度，表明已形成稳定的生物膜。最后一步是通过循环伏安法，在有底物和无底物条件下研究电活性细菌的胞外电子传递。最终，数据分析可提供微生物电子传递热力学的基本见解，并可用于确定可能及实际的胞外电子传递位点的形式电位。

该技术的主要优势在于能够直接洞察微生物与固体电极之间的电子传递过程，从而获得有关微生物胞外电子传递的基本信息。通常，初次接触该方法的研究人员在参数选择以及对所得曲线的正确解读方面会遇到困难。在数据采集和数据分析过程中，容易出现严重错误。

开始此实验步骤前，使用磷酸盐缓冲液配制适量的培养基，并根据以下参考添加其他营养成分。以10毫摩尔的乙酸钠作为底物。每20毫升培养基中加入1毫升原始废水作为接种物。

然后将针头插入培养基中，并用氮气吹扫至少半小时。在通入氮气除氧的同时，测量三电极体系中电极的尺寸。通过硅胶塞将工作电极、对电极和参比电极插入一个改进的四颈250毫升圆底烧瓶中。

用对二氯苯包裹硅胶塞，以在用氮气冲洗时密封系统。将250毫升培养基与接种物的混合液通过取样口倒入反应器中。用硅胶塞关闭取样口，并用对二氯苯进行气密性密封。

将容器置于35 °C的温控环境中，以确保恒定的环境条件。接着，将电极连接至恒电位仪相应的电缆上。打开恒电位仪控制软件，并选择相应的技术方法。

计时测温法。将工作电极设定在0.2伏的恒定电位下，持续500小时，每隔600秒记录一次数据。随后开始计时测温实验，观察随时间变化的测量电流曲线。在计算出优先电流密度后，绘制测量电流密度随时间变化的函数图。

当氧化电流达到平台期并回到零电流后，暂停计时安培法测量，以进行培养基更换。因此，将反应容器转移至层流罩中，并用氮气冲洗系统。小心排出原有培养基，随后补充新鲜的脱气培养基。

关闭取样口并用多聚甲醛密封。重复上述步骤，直至最大氧化电流达到稳态。每个生长周期后，分别取1毫升新鲜培养基和换液后的培养基样品，用于通过高效液相色谱法（HPLC）进行底物分析。为研究胞外电子传递，选择在电位控制软件中使用循环伏安法技术。

然后将工作电极相对于参比电极的初始电位 EI 设为 -0.5 伏，顶点电位 E1 设为 0.3 伏，最终电位 E2 设为 -0.5 伏。扫描速率为 1 毫伏/秒。启动实验并记录至少三个循环，以获得可重复的循环伏安曲线（cv）。

计算出优先电流密度后，绘制工作电极电位函数下的实测电流密度。根据计时安培法测量结果，可测定最大电流密度和库仑效率。此处展示的是采用补料分批反应器进行多个生长周期的典型计时电流生物膜生长曲线。

经过初始的迟缓期后，电流密度出现第一个峰值，随后由于底物耗尽，电流下降至几乎无电流通过。在底物重新补充后，电流密度再次上升，并达到更高的峰值电流密度。

经过多个生长周期后，最大电流密度保持恒定，表明已形成稳态的生物膜。由于稳态下的最大电流密度值取决于多个参数。

电活性微生物生物膜电极系统的特征通常被如此认为。第二个操作特征是库仑效率，即每个进料批次循环中记录为电流的电子数与理论最大电子数之比。有关计算库仑效率、电流以及理论最大电子数的具体方法，请参见文本方案中的详细说明。

这是非周转条件下的典型循环伏安图。在高扫描速率下，生物膜的循环伏安图仅显示一对峰，因此只能确定一个表观电位 EF，如图所示。通常情况下，氧化还原电对的表观电位可通过该物种的氧化峰电位 EPA 与还原峰电位 EPC 计算得到。

通过计算算术平均值，可确定形式电位，具体计算方法详见文本方案。当对相同的生物膜施加足够低的扫描速率时，最多可识别出四个氧化还原电对。然而，非周转循环伏安法仅能显示电极表面所有具有氧化还原活性的化合物，从而反映出可能的胞外电子传递位点的EF。

只有分析非周转循环伏安图中的周转CV，才能获得实际EET位点的EF。其他特征参数，如峰间距、最大峰电流和最小峰电流密度，也可进行分析。这些参数特别是以不同扫描速率记录时，可用于电极上电子转移过程的机理和动力学分析。

然而，这种在化学体系中已得到充分建立的动力学分析方法，对于电活性微生物生物膜而言并不直接适用。在底物存在下进行循环伏安（CV）测定时，会得到一个 turnover CV 曲线。绘制数据后，可观察到典型的 S 形生物电催化曲线。

在进一步分析数据时，一阶导数的峰值或曲线的拐点可提供实际胞外电子传递位点的形式电位 EF。对于以薄地杆菌比例为主的生物膜，可观察到两个拐点。随后，其导数显示出两个峰值，分别对应于生物电催化活性电子传递位点的形式电位，依次记为 EF2 和 EF3。

这一发现还表明，与形式电位 EF1 和 EF4 相关的氧化还原过程与生物电解无关。随着生物膜的生长并变厚，循环伏安图仅显示一个拐点。该形式电位 EEF 为负 0.32 伏（相对于银/氯化银电极），大致等于分配给薄生物膜胞外电子传递的两个形式电位的算术平均值。

该结果表明，基本的循环伏安分析能够以快速且非侵入的方式提供有关电子传递热力学的深入信息。一旦掌握，该技术可轻松针对不同的研究体系进行调整，并且如果操作得当，可根据数据实现不同程度的深入数据分析。通过遵循本实验流程并学习微生物生物膜结构的基础知识，研究人员可进一步轻松掌握其他方法，如方波遥测技术或电化学阻抗谱，以及深入的数据分析方法。