一种用于果蝇觅食行为的单体检测方法 果蝇

本实验的总体目标是量化食物剥夺在成年果蝇黑腹果蝇（Salala Melanogaster）中引发的行为变化。该目标通过以下步骤实现：首先将果蝇饥饿处理18至24小时；第二步是将单只果蝇装入行为检测室，每个检测室中央均含有一个吸引性气味源。

接下来，配备数字相机的计算机系统会随时间追踪每只果蝇的位置，并记录其坐标以供后续数据分析。最后一步是使用定制软件确定每只果蝇到达气味源的潜伏期。

最终，这种高通量的食物搜索行为检测方法可用于研究神经回路功能与行为反应之间的关系。与现有方法（如队友法）相比，该方法的主要优势在于能够对单只果蝇的趋化行为进行量化。该方法有助于回答神经生物学领域的一些问题，例如哪些神经回路对趋化行为至关重要，以及这些神经回路如何受到动物内部生理状态的调节。

该方法的目标是短时间内获取大规模的行为数据集。尽管该方法已帮助我们深入了解觅食行为，但它也可用于研究其他行为，例如定位行为。该方法的可视化演示至关重要。

正确的果蝇操作以及计算机软件的运行对于本实验的成功均至关重要。通常，初次接触该方法的人员在初期可能会遇到一些困难，因为学习如何轻柔地处理果蝇需要一定的时间和耐心。在采集果蝇前，请先联系本实验室的技术人员，由其示范操作流程，特别是涉及针具的操作步骤。

在12小时光照-黑暗循环条件下，于受控的温度和湿度环境中饲养实验果蝇。在EEC爆发当天，先用二氧化碳麻醉果蝇，再在显微镜下进行性别鉴定。可依据若干基本特征来区分雄性和雌性果蝇。

雄性果蝇四条腿上具有一簇黑色刚毛，称为性梳，而雌性则没有。此外，雄性腹部末端被深色角质层覆盖，并具有雌性所没有的外露生殖器。收集雌蝇，并将其与四到五只白眼雄蝇一同放入新的培养瓶中，每瓶最多放置30只果蝇。将果蝇培养两到五天。为准备果蝇饥饿实验装置，先将一片组织纸推至一个空的塑料培养瓶底部，并用蒸馏水彻底浸湿该组织。

然后用物体按压组织，轻轻挤出多余的水分。倒置小瓶以弃去多余的水。水量应足以保持果蝇的水分以及饥饿室的湿润，但不能过多以免淹死果蝇。

实验开始前约18至24小时，将果蝇从培养瓶转移至饥饿室，并塞住瓶口。将培养瓶在受控的温度和湿度条件下过夜存放，直至实验开始。通过将100毫克低熔点琼脂糖加入10毫升蒸馏水中，制备1%琼脂糖溶液。

在玻璃烧瓶中，将琼脂糖溶液放入微波炉加热，直至溶液刚开始沸腾但尚未溢出时，停止微波炉并轻轻旋转烧瓶一次。重复此步骤两次，直至琼脂糖完全溶解。

将烧瓶置于加热板上保持温热，使Aros溶液维持在液态。在50摄氏度条件下，向一个1.5毫升的倒置DF管中加入990微升1% aro溶液和10微升苹果醋。配制1%苹果醋溶液后，涡旋振荡使其充分混匀，然后放入设定为50摄氏度的干浴培养箱中，并将测试室调节至所需的温度和湿度等条件。

打开660纳米LED面板。用热水冲洗筛网和测试板，并将其放入干燥箱中加热，直至所有水分蒸发。冷却筛网和测试板至测试室温度。

开始实验前，将一个浅盘置于扩散板上方，并加水以提高局部湿度，同时遮蔽气溶胶液滴中的水分。最后，将筛网放置在水盘上方。测试板由透明丙烯酸材料制成，包含六个测试区域。

滑块包含容纳室，可用于果蝇的装载、临时容纳，并同时将六只果蝇释放至各自对应的腔室中。实验开始时，培养板每个区域中心刻有的十字标记指示应将气味物质用移液器加入。将滑块插入丙烯酸测试板中。

轻轻将吸虫器插入小瓶，穿过棉塞，让大约六只果蝇自行爬入吸虫器。操作过程中务必尽可能轻柔。可利用果蝇的趋光性行为，将小瓶开口朝向较暗的光源，诱导果蝇向吸虫器方向爬行。

如有需要，可使用轻微吸力吸取约六只雌蝇。避免选择白眼雄蝇。将吸管的尖端插入检测板的第一个孔中。

让一只果蝇进入滞留孔中，然后轻轻向前推动滑块，将另一只果蝇装入下一个孔。重复此操作，直至所有六孔均被果蝇占据。

然后用移液器吸取5 µL的1%苹果醋琼脂溶液，直接滴加到检测板内表面十字线的中心位置。为校准检测板的位置，请打开名为Positioning tool vi的文件，通过点击屏幕左上角的白色箭头运行该文件。

将测试板放置在 sib 之上，使测试板的 arena 开口朝向 SIV 地板，且气味目标位于测试板的顶部。当完成对齐后，使测试板上的十字线与显示器屏幕上的十字线对齐。通过点击显示器左上角附近的红色圆点，中止执行以追踪并记录果蝇的坐标。

每次觅食实验开始时，打开采集软件文件。跟踪六只果蝇。点击显示器左上角的白色箭头运行文件。

为文件命名，然后点击确定。推动测试室中的滑块，将果蝇释放到测试区域中。注意不要移动测试室，否则会导致坐标记录不准确。

点击开始，确保测试室内的唯一光源为LED面板。试验结束后，移除筛网和行为室。将测试板从筛网上抬起，并通过将平板浸入冰中来移除果蝇。

用热水轻轻清洗培养板，去除所有琼脂残留物。将检测用培养板放入干燥箱中以除去水分。打开小型风扇通风约两分钟，对检测区域进行换气。

关闭风扇，将下一组果蝇装入下一个测试板中。按照文本方案中所述，使用定制软件进行数据分析。该数据分析软件及布局用于根据一组分析标准评估每只果蝇在10分钟试验期间的表现。

这些标准用于确定是否将每只果蝇的数据纳入数据分析，旨在剔除因受伤、疾病、应激或缺乏动机而无法完成觅食任务的个体。若果蝇在超过300秒的时间内处于静止状态，则被视为无活动性，除非其已成功定位食物源或表现出相应行为，否则将被排除在数据集之外。在静止期结束后，需至少有100秒的平均移动速度超过10毫米/秒，以筛选出在主动嗅觉搜索早期阶段表现出健康运动速度的果蝇。仅接受在试验开始后前50秒内以特定速度范围内移动的果蝇用于数据分析。若果蝇未经过实验 arena 的全部四个象限，而是在试验开始后直接朝食物源移动，则该个体将被剔除。

在至少50秒的时间内，在距离食物源10毫米半径范围内来回移动的果蝇，被视为已成功找到食物源。可通过绘制果蝇与气味源之间距离随时间变化的曲线图来评估此类罕见情况：若实验区域中果蝇位置出现明显伪迹，则该轨迹数据将被舍弃。

当数据采集软件检测到果蝇以外的物体时，可能会产生伪迹。这些伪迹通常表现为横跨整个实验区域或从其中心向外辐射的长直线。成年果蝇在饥饿18至24小时后，对与食物相关的气味的嗅觉敏感性高于已进食的果蝇。

成功定位食物气味源的果蝇累积百分比的图形显示，在10分钟时间内，所有饥饿果蝇中有30%成功找到气味源，而喂养充足的果蝇中仅有7%成功。与单独的溶剂对照（agros vehicle）相比，饥饿果蝇应对醋表现出显著更强的趋向性，这一现象可用于排查检测条件中的问题。

例如，当在32摄氏度、环境湿度为35%的条件下使用野生型果蝇进行此项食物搜索实验时，果蝇对醋和agros对照的趋向性之间未检测到显著差异，这可能是由于在较高测试温度下，果蝇对agros液滴中所含水分的趋向性增加所致。通过将测试湿度提高至50%至60%之间，该行为偏移得以纠正，果蝇对醋与agros载体之间的趋向性差异重新达到显著水平。一旦掌握该技术，包括正确执行10分钟实验测试在内，整个操作可在12分钟内完成。

在进行该操作时，务必注意轻柔处理果蝇，避免对其造成损伤或干扰。请注意，检测板和筛网在干燥箱中加热后可能非常烫，因此在完成加热后取出时应佩戴烤箱手套。该技术为神经生物学领域的研究人员探索趋化行为奠定了基础。

该技术还可用于研究果蝇定位其他气味物体的能力。例如，可将其应用于雄性果蝇寻找配偶行为的研究。观看本视频后，您应能够充分掌握如何准备实验、调整实验条件、运行实验以及分析每只果蝇的表现，最终获得一条累积曲线，显示成功定位气味源的果蝇百分比。