Name: 光学检测 E。大肠杆菌由细菌介孔硅生物传感器 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-20T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 22 s
Description: 学习利用纳米结构多孔硅构建无标记光学生物传感器，通过固定单克隆抗体直接捕获大肠杆菌，实现无需样品前处理的快速细菌检测。该技术可在数分钟内检测低浓度细菌，适用于环境监测和食品安全领域。

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本工作由以色列科学基金会（资助号 1118/08 和资助号 1146/12）以及明娜·克罗尔纪念研究基金资助。E.S. 衷心感谢拉塞尔·贝瑞纳米技术研究所提供的经济支持。

1. 氧化多孔SiO2的制备
<ol>
	<li>将单面抛光、重掺杂p型（0.0008 Ω·cm）的硅片（&#60;100&#62;晶面）在体积比为3:1的氢氟酸水溶液与无水乙醇混合液中，于恒定电流密度385 mA/cm2条件下腐蚀30秒。请注意，氢氟酸为强腐蚀性液体，操作时须格外小心。</li>
	<li>用无水乙醇多次冲洗所得多孔硅（PSi）薄膜表面，并在干燥氮气氛围下吹干薄膜。</li>
	<li>将 freshly-etched PSi 样品置于管式炉中，在空气氛围下800 °C氧化1小时（将样品于室温放入炉内，升温至800 °C，保持1小时，关闭炉子并待其冷却至室温后方可取出样品）。</li>
</ol>
2. PSiO2 支架的生物功能化
<ol>
	<li>将氧化的多孔硅（PSiO2）样品在95%巯丙基（三甲氧基硅烷-3）（MPTS）溶液（108 mM，甲苯中）中孵育1小时。</li>
	<li>用甲苯、甲醇和丙酮冲洗经硅烷处理的PSiO2样品，并在干燥氮气下吹干。</li>
	<li>将经硅烷修饰的PSiO2样品在1 ml 100 mM PEO-碘乙酰基生物素溶液中孵育30分钟。</li>
	<li>用0.1 M磷酸&#160;缓冲盐水（PBS）溶液多次冲洗经生物素处理的PSiO2样品。</li>
	<li>将经生物素修饰的PSiO2样品在1 ml 100 μg/ml链霉亲和素（SA）溶液中孵育30分钟。</li>
	<li>用0.1 M PBS溶液多次冲洗经SA处理的PSiO2样品。</li>
	<li>将所得的SA修饰PSiO2样品在1 ml 100 μg/ml生物素化E. coli单克隆抗体（免疫球蛋白G，IgG）溶液中，或在100 μg/ml生物素化兔IgG溶液中（作为单克隆抗体的模型）孵育30分钟。</li>
</ol>
3. 荧光标记与荧光显微镜观察
<ol>
	<li>将IgG修饰的表面与15 μg/ml荧光素（FITC）标记的抗兔IgG孵育40分钟，同时以15 μg/ml荧光素（FITC）标记的抗小鼠IgG作为对照。</li>
	<li>用0.1 M PBS溶液多次冲洗修饰后的样品。</li>
	<li>在荧光显微镜下观察样品。</li>
</ol>
4. 细菌培养
<ol>
	<li>在10 ml离心管中加入5 ml LB培养基（每升去离子水中含5 g NaCl、5 g酵母提取物和10 g胰蛋白胨），培养大肠杆菌K12（E. coli K12）。于37 °C条件下振荡培养过夜。</li>
	<li>通过在600 nm波长下测定光密度（OD）来监测细菌浓度。在LB培养基中过夜培养后，使用分光光度计测定OD600以确定细菌浓度。细胞数量与OD600值成正比（1 OD600 = 108 个细胞/ml）。</li>
</ol>
5. 细菌检测
<ol>
	<li>将IgG修饰的PSiO2和未处理的PSiO2（作为对照）样品置于定制的聚甲基丙烯酸甲酯（Plexiglas）流动池中。固定流动池，以确保在所有测量过程中均在同一位置测定样品的反射率。</li>
	<li>在室温下用大肠杆菌（E. coli）K12悬液（104 个细胞/ml）孵育样品30分钟，随后用0.85% w/v的生理盐水冲洗流动池30分钟，以去除细菌悬液。</li>
	<li>在整个实验过程中监测反射率数据的变化。所有光学测量均需在水相环境中进行。光谱应使用CCD光谱仪采集，并通过快速傅里叶变换（FFT）进行分析，具体方法如前所述25,26。</li>
	<li>在生物传感实验结束后，立即在直立式光学显微镜下观察样品，以确认细菌存在于生物传感器表面。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在竞争性财务利益。

基于PSiO2纳米结构（一种法布里-珀罗薄膜）构建了一种无标记光学免疫传感器，并验证了其作为细菌检测生物传感器的潜在应用价值。
修改与故障排除
在设计免疫传感器时，一个主要问题是抗体在沉积和图案化到固体基底过程中容易发生非预期的构象变化，这可能导致生物传感器灵敏度下降31,32。为尽量减少这一问题，通过生物素-链霉亲和素（SA）桥接将抗体与PSiO2表面偶联。由于生物素与链霉亲和素之间具有高结合亲和力（Kd ~10-13 M），它们被广泛应用于多种生物技术领域。生物素-链霉亲和素连接是生物传感器开发中受体固定最常用的化学方法之一10,32,33,34。通过生物素-链霉亲和素反应可调控固定化抗体的可及性，该反应在固体表面与IgG之间提供了一种灵活的连接方式31,35。因此，首先需用生物素/链霉亲和素对PSiO2进行生物功能化修饰，以实现生物素化抗体在纳米结构上的...

对致病菌的早期和准确鉴定在食品安全、水质安全、环境监测以及即时诊断方面具有重要意义1。由于传统微生物学技术耗时长、操作繁琐，且无法在实验室环境之外实现对微生物的&#34;实时&#34;检测，生物传感器正不断发展以应对这些挑战2-5。
近年来，多孔硅（PSi）已成为构建传感器和生物传感器的有前景的平台6-20。在过去十年中，已发表了大量关于基于多孔硅的光学传感器和生物传感器的研究21,22。纳米结构的多孔硅层通常通过单晶硅片的电化学阳极腐蚀法制备而成。所得的多孔硅纳米材料具有多种优势特性，例如较大的比表面积和自由体积、可调控的孔径尺寸以及可调的光学性质10,16。多孔硅层的光学性质，如光致发光8,11和基于白光反射的干涉测量技术7,19，受环境条件影响显著。当目标分子或分析物被捕获到多孔层内部时，会导致薄膜平均折射率发生变化，表现为光致发光光谱的调制或反射光谱中波长的偏移10。
尽管PSi光学生物传感器技术取得了巨大创新，但基于PSi的细菌检测平台的相关报道仍较少6,8,20,23-29此外，大多数这些概念验证研究已经证明 &#34;间接&#34; 细菌检测。因此，通常需要在检测前对细胞进行裂解，以提取目标蛋白或DNA片段，这些片段是所研究细菌的特征性标志29我们的方法是直接将目标细菌细胞捕获到多孔硅（PSi）生物传感器上。因此，将针对目标细菌的特异性单克隆抗体固定在多孔表面。细菌细胞通过抗体-抗原相互作用结合到生物传感器表面，从而引起反射光谱振幅（强度）的变化。24-26.
本研究中，我们报道了一种基于多孔硅（PSi）的光学生物传感器的构建，并展示了其作为无标记生物传感平台在检测大肠杆菌（Escherichia coli（E. coli）K12细菌（作为模式微生物）中的应用。所监测的光学信号来源于PSi纳米结构因法布里-珀罗薄膜干涉而反射的光（图1A）。光信号振幅/强度的变化与目标细菌细胞在生物传感器表面的特异性固定相关联，从而实现对细菌的快速检测与定量分析。

<table><tbody><tr><td>硅晶片</td><td>Siltronix Corp.</td><td></td><td>高度硼掺杂，p型，电阻率为0.0008 &amp;Omega;-cm，&amp;lt;100&gt;晶向</td></tr><tr><td>水性氢氟酸（48%）</td><td>Merck</td><td>101513</td><td></td></tr><tr><td>无水乙醇</td><td>Merck</td><td>818760</td><td></td></tr><tr><td>PBS缓冲液（pH 7.4）</td><td></td><td></td><td>通过将50 mM Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;、17 mM NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO4和68 mM NaCl溶于Milli-Q水（18.2 M&amp;Omega;）中配制而成</td></tr><tr><td>0.85% w/v生理盐水</td><td></td><td></td><td>通过将0.85 g NaCl溶于100 ml Milli-Q水（18.2 M&amp;Omega;）中配制而成</td></tr><tr><td>95% (3-巯丙基)三甲氧基硅烷（MPTS）</td><td>Sigma Aldrich Chemicals</td><td>175617</td><td></td></tr><tr><td>PEO-碘乙酰基生物素</td><td>Sigma Aldrich Chemicals</td><td>B2059</td><td></td></tr><tr><td>链霉亲和素（SA）</td><td>Jackson ImmunoResearch Labs Inc.</td><td>016-000-114</td><td></td></tr><tr><td>荧光素（DTAF）标记的链霉亲和素</td><td>Jackson ImmunoResearch Labs Inc.</td><td>016-010-084</td><td></td></tr><tr><td>生物素化的兔IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch Labs Inc.</td><td>011-060-003</td><td></td></tr><tr><td>荧光标记的抗兔IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch Labs Inc.</td><td>111-095-003</td><td></td></tr><tr><td>荧光标记的抗小鼠IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch Labs Inc.</td><td>115-095-003</td><td></td></tr><tr><td>生物素化的&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt;抗体</td><td>Jackson ImmunoResearch Labs Inc.</td><td>1007</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt;（K-12）</td><td></td><td></td><td>由以色列理工学院Sima Yaron教授慷慨提供</td></tr></tbody></table>

光学检测 大肠杆菌 多孔硅生物传感器检测细菌

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

一种基于纳米结构多孔硅的无标记光学生物传感器被设计用于快速捕获和检测大肠杆菌（Escherichia coli）K12 菌株，作为模式微生物。该生物传感器依赖目标细菌细胞直接结合到其表面，且无需对检测样本进行预处理（例如&#160;细胞裂解）。采用介孔硅薄膜作为该生物传感器的光学换能元件。在白光照射下，多孔层在其反射光谱中呈现出清晰可辨的法布里-珀罗干涉条纹。对反射光谱数据进行快速傅里叶变换（FFT）后可得到单一峰。通过监测FFT峰强度的变化，可实现对目标细菌通过抗体-抗原相互作用在生物传感器表面捕获过程的检测，从而实现对细菌附着过程的“实时”观察。
通过电化学阳极氧化工艺制备的介孔硅薄膜与针对目标细菌的单克隆抗体相偶联。通过荧光标记实验验证了抗体的固定化、免疫活性及特异性。当该生物传感器暴露于目标细菌时，细菌细胞可直接被捕获到经抗体修饰的多孔硅表面。这些特异性捕获事件导致生物传感器薄膜光学干涉光谱的强度发生变化。我们证明，该生物传感器可在不到一小时内检测相对较低浓度的细菌（检测限为104 个细胞/ml）。

氧化的多孔硅（PSiO2）薄膜的制备方法如“实验方案”部分所述。图1B展示了热氧化后所得多孔硅薄膜的高分辨率扫描电子显微图像。PSiO2层具有定义明确的圆柱形孔隙，孔径范围为30–80 nm。
采用成熟的硅烷化技术结合生物素-链霉亲和素（biotin-SA）系统，将单克隆抗体（IgG）分子接枝到PSiO2表面。详细的合成路线如图2所示。首先，对热氧化后的表面用MPTS进行硅烷化处理，形成含巯基的硅烷化表面（图2c）。接下来，将活化的表面与SH反应性生物素连接分子孵育（图2d），随后通过生物素-SA桥接将链霉亲和素（SA）蛋白连接到生物素修饰的表面30（图2e）。生物传感器表面功能化的最后一步是将生物素化的单克隆抗体与SA进行生物偶联（图2f）。
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介绍了一种用于快速检测细菌的无标记光学生物传感器。该生物传感器基于纳米结构的多孔硅，设计用于将目标细菌细胞直接捕获到其表面。我们将单克隆抗体固定在多孔换能器上，作为捕获探针。研究结果表明，该生物传感器可在数分钟内检测出低浓度细菌，且无需对样品进行预处理（如细胞裂解）。

一种基于纳米结构多孔硅的无标记光学生物传感器被设计用于快速捕获和检测大肠杆菌K12，作为一种……

以下实验的总体目标是设计一种基于纳米结构多孔硅的无标记光学生物传感器，用于快速检测细菌。该目标通过构建氧化多孔硅并将其用作生物传感器的光学换能元件来实现。第二步是将特异性捕获探针（如抗体）固定在多孔表面上，以提供生物传感器的活性组分。接下来，将生物传感器暴露于目标细菌中，以直接捕获细菌细胞至抗体上。获得经修饰的氧化多孔硅表面结果，显示生物传感器薄膜光学干涉光谱的强度变化。由于细菌的捕获，采用光学显微镜以确认生物传感器表面存在细菌。与传统的培养方法及其他现有技术相比，我们的技术主要优势在于能够在不到一小时内快速检测细菌的存在。该方法有助于解决特定微生物环境监测中的关键挑战，同时保障水质与食品安全。此外，该方法还可在实时及现场护理条件下实现对特定细菌种类的检测。首先，在恒定电流密度为 385 毫安每平方厘米的条件下，将硅片在体积比为 3:1 的氢氟酸水溶液与乙醇混合液中蚀刻 30 秒。请注意，氢氟酸是一种强腐蚀性液体，必须极其小心地操作。用乙醇多次冲洗所得多孔硅薄膜的表面，然后在干燥的氮气下吹干薄膜，随后将新刻蚀的多孔硅样品在管式炉中于800摄氏度的空气环境中氧化一小时。为了对氧化的多孔硅样品进行生物功能化，首先将薄膜在95%的MPTS溶液中孵育一小时。用甲苯、甲醇和丙酮冲洗后，在干燥的氮气下干燥经硅烷处理的氧化多孔硅样品。接下来，将硅烷修饰的样品在1毫升100毫摩尔的PEO-oto-乙酰基生物素溶液中孵育30分钟。用0.1摩尔磷酸盐缓冲液（PBS）溶液多次冲洗经生物素处理后的样品。接着，将样品在1毫升浓度为100微克/毫升的链霉亲和素溶液中孵育30分钟，然后再次用PBS溶液反复冲洗数次。随后，将经链霉亲和素修饰的氧化多孔硅样品在1毫升浓度为100微克/毫升的生物素化大肠杆菌单克隆IgG抗体溶液或100微克/毫升的其他指定试剂中孵育30分钟。使用生物素标记的兔IgG对支架进行荧光标记。将经IgG修饰的表面与15 µg/mL孵育。用荧光素标记的抗兔IgG孵育40分钟。用每毫升15微克的荧光素标记抗-US IgG作为对照进行孵育。用PBS溶液将修饰后的样品冲洗数次后，在荧光显微镜下观察样品。在含有5毫升LB（Luria-Bertani）培养基的10毫升试管中培养大肠杆菌K-12。将细菌在37°C下振荡培养过夜。培养过夜后，在分光光度计上用600纳米波长（OD600）测定LB培养基中的光密度，以确定细菌浓度。细胞数量与 OD 600 测量值成正比。将经 IgG 修饰的氧化多孔硅支架和对照组未处理的氧化多孔硅样品置于定制的有机玻璃流动池中。固定流动池，以确保在所有测量过程中样品反射率均在同一位置进行测定。将样品与大肠杆菌K 12悬液在室温下孵育30分钟。随后用生理盐水（0.85% 质量/体积）冲洗流动池30分钟，以去除细菌悬液。在整个实验过程中，使用CCD光谱仪监测反射率数据的变化。在采集光谱后，通过应用快速傅里叶变换分析CCD光谱仪数据，完成所有在水相环境中的光学测量。最后，在生物传感实验结束后，立即在正置光学显微镜下观察样品，以确认细菌存在于生物传感器表面。图中所示为多孔硅薄膜经热氧化后的高分辨率扫描电子显微照片。氧化后的多孔硅层具有界限清晰的圆柱形孔隙，孔径范围为 30 至 80 纳米。通过荧光标记法标记抗体，并在荧光显微镜下观察表面，可确认抗体已成功结合至氧化多孔硅表面。此外，通过结合荧光标记的抗兔IgG和抗鼠IgG作为对照，荧光研究可表征固定在表面的抗体的活性及其抗原特异性。同时展示了无IgG的对照实验，以证明细菌生物传感的效果：监测从氧化多孔硅纳米结构反射光的幅度或强度变化，快速获取生物传感器在引入大肠杆菌前后变换的光谱。在接触大肠杆菌后，记录到光强下降了7±1%，而在未修饰的氧化多孔硅表面则观察到无明显变化。此外，为了确认捕获的细胞是否存在于氧化的多孔硅表面，在完成所示生物传感实验后，应立即在光学显微镜下观察生物传感器。此处可见生物传感器表面已固定化了细菌细胞，而在未修饰的对照表面上则未观察到任何细胞。一旦掌握该技术，若操作得当，整个过程可在一小时之内完成。观看本视频后，您应能充分理解如何设计一种特定的光学生物传感器，以监测目标分析物。

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科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

光学检测 E。大肠杆菌由细菌介孔硅生物传感器

生物传感器通过表面修饰将高灵敏度传感器与高特异性探针结合，从而与复杂的生物环境相互作用并实现靶向检测。在此，我们演示了使用硅烷偶联剂作为桥梁，通过生物素对二氧化硅光学传感器进行表面功能化修饰的方法。...

使用硅烷偶联剂将生物探针连接到二氧化硅光学生物传感器上

我们近期报道了一种新型的荧光生成型DNA酶探针的构建方法，可用于建立一种简单、直接“混合即读”的荧光检测法以检测细菌。这些特殊的DNA探针可在特定细菌产生的粗制胞外混合物（CEM）存在下，催化切割经发色团修饰的DNA-RNA嵌合底物，从而将细菌的检测转化为荧光信号的产生。在本报告中，我们将描述关键的实验步骤，其中使用一种名为“RFD-EC1”的特异性DNA酶探针来检测模式菌株大肠杆菌（Escherichia coli, E.

利用荧光生成型DNA酶检测细菌

我们描述了一种用于快速检测和鉴定细菌的电化学传感器分析方法。该分析方法采用经DNA寡核苷酸捕获探针功能化的传感器阵列，该探针针对核糖体RNA（rRNA）的物种特异性序列。目标rRNA与捕获探针及辣根过氧化物酶标记的DNA寡核苷酸检测探针发生夹心杂交反应，产生可测量的安培电流。...

使用电化学传感器进行细菌检测与鉴定

来源： Barber, A. E., 等. 一种用于初步检测枪击残留物的新型细菌生物传感器的制备与应用. J. Vis. Exp.

利用细菌生物传感器检测目标分析物

本视频展示了一种利用纳米传感器检测食品和水样中细菌污染物的技术。该方法通过磁弛豫和荧光发射两种模式相结合，实现对目标致病菌的检测。...

利用磁荧光纳米传感器检测细菌污染

裂解性噬菌体生物传感器和抗体微珠能够区分耐甲氧西林（MRSA）和敏感型葡萄球菌。通过朗缪尔-布洛杰特法将噬菌体固定在石英晶体微天平传感器表面，作为广谱葡萄球菌探针。抗体微珠可特异性识别MRSA。...

用于检测耐抗生素葡萄球菌的生物传感器

本研究描述了一种纳米压印光刻技术，用于制备基于异常光学透射原理的高质量传感阵列。该生物传感器成本低、稳定性好、操作简便，可在临床相关浓度下检测血清中的心肌肌钙蛋白I（99th 百分位数截断值 ∼10–400...

利用超常光学透射技术定量检测人血清中的心脏生物标志物

本实验方案的总体目标是合成一种功能性纳米传感器，通过结合磁弛豫和荧光发射两种模式，实现对特定目标病原菌的便携式、低成本且快速的检测。...

使用磁荧光纳米传感器进行食源性致病菌筛查：快速检测 E. Coli O157:H7

本文介绍了一种利用分子印迹技术结合电容型生物传感器检测和定量复杂溶液中低丰度分子的实验方案。...

基于分子印迹电容型生物传感器的生物标志物超灵敏检测

本方案介绍了如何基于微流控芯片构建连续流动聚合酶链式反应系统，以及如何在实验室中搭建毛细管电泳系统。该方法为实验室中核酸分析提供了一种简便的途径。...

扩增 大肠杆菌 在连续流动PCR微流控芯片中的扩增及其通过毛细管电泳系统的检测

学习利用纳米结构多孔硅构建无标记光学生物传感器，通过固定单克隆抗体直接捕获大肠杆菌，实现无需样品前处理的快速细菌检测。该技术可在数分钟内检测低浓度细菌，适用于环境监测和食品安全领域。

光学检测大肠杆菌多孔硅生物传感器检测细菌

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