Name: 原代海马神经元的磷酸钙转染 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-12T18:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: 学习磷酸钙转染技术用于原代海马神经元基因导入，该方法与星形胶质细胞共培养，转染效率可达50%，操作简单经济，适用于难转染细胞系的研究。

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本研究由美国国立卫生研究院（NIH）基金项目 NS065183 及罗格斯大学罗伯特·伍德·约翰逊医学院的启动资金资助。

1. 准备大鼠星形胶质细胞培养物以制备条件培养基及星形胶质细胞-神经元共培养体系。
<ol>
	<li>制备解剖缓冲液（BSS，配方见表1），并在使用前于4 °C保存。</li>
	<li>将新生大鼠幼崽（P0-P2）置于500 ml烧杯中，用异氟烷进行麻醉。</li>
	<li>当幼崽完全不动时，用70%乙醇喷洒并断头。</li>
	<li>取出脑组织。
	<ol>
		<li>用Dumont #5镊子牢固夹住头部，使用精细剪刀沿中线切开皮肤和颅骨。</li>
		<li>将颅骨向两侧翻开以暴露脑组织，并将脑组织转移至盛有冷BSS的培养皿中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在解剖显微镜下分离大脑半球与间脑及脑干。用一对镊子固定组织，另一对镊子轻轻牵拉，小心去除所有脑膜。</li>
	<li>将所有半球组织收集至一个60 mm培养皿中。使用小剪刀尽可能将组织剪碎，然后将剪碎的组织转移至50 ml锥形管中。</li>
	<li>向脑组织中加入1.5 ml 1% DNase I、1.5 ml 2.5% 胰蛋白酶和12 ml BSS（总体积为15 ml）。在37 °C摇水浴中孵育15分钟。为确保充分混匀，每5分钟手动轻轻摇动试管一次。</li>
	<li>将上清液通过70 μm细胞滤器过滤至新的50 ml锥形管中。向此上清液中加入3 ml胎牛血清（FBS）。</li>
	<li>向剩余的组织块中加入13.5 ml BSS和1.5 ml 2.5% 胰蛋白酶，再次在摇水浴中孵育15分钟。</li>
	<li>将剩余的上清液通过细胞滤器过滤，并与第1.8步所得上清液合并。</li>
	<li>以1,000 RPM离心5分钟，沉淀细胞。</li>
	<li>用5 ml胶质细胞培养基重悬细胞沉淀。上清液可再次离心以收集残留细胞。</li>
	<li>使用血细胞计数板对细胞进行计数。</li>
	<li>以每150 cm2培养瓶1 × 107的密度接种细胞。</li>
	<li>接种后次日更换为新鲜胶质细胞培养基，之后每周用胶质细胞培养基换液两次。</li>
	<li>当细胞融合度达到&#62;80%（接种后约10天）时，用90%马血清和10% DMSO将细胞冻存于液氮中。每管冻存2 × 106个细胞。每个培养瓶大约可冻存5管。</li>
	<li>在建立海马神经元培养前约10–14天，从冻存细胞中复苏胶质细胞进行接种。我们通常接种五块6孔板，足以支持90个盖玻片的海马神经元生长（每孔3个15 mm圆形盖玻片）。此外，我们还额外接种8–10个60 mm培养皿的胶质细胞，用于制备转染用的N2.1条件培养基。神经元培养前一天，应使用NB27培养基对细胞进行换液。此时星形胶质细胞的理想融合度应&#62;90%。我们发现冻存过程可显著减少星形胶质细胞培养物中的小胶质细胞数量。由于当小胶质细胞存在于星形胶质细胞培养物中时会观察到神经毒性增强，因此我们始终采用由冻存细胞制备的星形胶质细胞培养物与神经元共培养。</li>
</ol>
2. 神经元培养
<ol>
	<li>用 milliQ 水冲洗盖玻片 2 次以清洁。随后将盖玻片浸泡于浓硝酸中 24 小时，并在总共 2 小时内用 milliQ 水至少冲洗 5 次。盖玻片经烘干后，在 225 °C 烤箱中烘烤 6 小时以灭菌。</li>
	<li>灭菌后将盖玻片转移至 60 mm 培养皿中。在每片盖玻片外缘附近放置四滴无菌石蜡，以便在共培养期间将神经元与胶质细胞分隔开。</li>
	<li>用 1 mg/ml 多聚-L-赖氨酸溶于 0.1 M 硼酸盐缓冲液中，在 37 °C 培养箱中过夜包被盖玻片。</li>
	<li>次日，用无菌 milliQ 水冲洗盖玻片两次，每次至少 15 分钟。随后在 37 °C 培养箱中用铺板培养基过夜孵育。</li>
	<li>通过异氟烷麻醉后行气胸法处死孕鼠（E18），并通过断头法处死胚胎鼠。取出大脑并按上述方法分离大脑半球。</li>
	<li>从大脑半球中分离海马组织。将所有海马组织放入 15 ml 圆底离心管中，加入 0.25% 胰蛋白酶（0.5 ml 2.5% 胰蛋白酶 + 4.5 ml BSS）在 37 ℃ 下消化 15 分钟。</li>
	<li>将消化后的海马组织用 BSS 洗涤 3 次，每次 5 分钟。随后用玻璃巴斯德移液管进行吹打解离，并使用血细胞计数板测定细胞密度。将神经元以每 60 mm 培养皿 2 × 105 个细胞的密度接种。</li>
	<li>铺板后约 2–4 小时，将带有贴附神经元的盖玻片转移至含有星形胶质细胞的培养皿中，使神经元面朝下贴近胶质细胞。在 DIV3 时，向培养体系中加入阿糖胞苷，终浓度为 5 μM，以抑制胶质细胞增殖。</li>
</ol>
3. 钙转染
<ol>
	<li>转染前一天，用胶质细胞条件化 N2.1 培养基。</li>
	<li>转染当天，从胶质细胞中收集已条件化的 N2.1 培养基，转移至新培养皿中。将带有神经元的盖玻片转移至该条件化 N2.1 培养基中，在培养箱中平衡 10–30 分钟。</li>
	<li>在一组无菌离心管中，加入 1–4 μg DNA、12.5 μl 2 M CaCl2 和无菌 H2O，总体积为 100 μl。在另一组离心管中，加入 100 μl 2x HBS。</li>
	<li>逐次向含有 CaCl2/DNA 混合物的离心管中加入 2x HBS 的 ⅛ 体积（即 12.5 μl），每次加入后涡旋数秒。室温静置 15 分钟。</li>
	<li>孵育 15 分钟后，将转染混合物逐滴加入细胞中，继续孵育 1–1.5 小时。在 10X 物镜下通过显微镜观察，应可见类似沙粒状的沉淀层。</li>
	<li>孵育结束后，用预温的 HBS 洗涤缓冲液轻柔冲洗盖玻片两次。</li>
	<li>将盖玻片放回原含胶质细胞的培养皿中，并加入犬尿酸，使其终浓度为 0.5 mM。</li>
	<li>转染后的神经元最早可在次日进行活细胞成像或免疫细胞化学检测。转染后神经元可存活长达三周。</li>
</ol>

<ol><li>Karra, D., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+techniques+for+neuronal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Transfection techniques for neuronal cells.</a> J. Neurosci. 30, 6171-6177 (2010).</li>
<li>Zeitelhofer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+transfection+of+mammalian+neurons+via+nucleofection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">High-efficiency transfection of mammalian neurons via nucleofection.</a> Nat. Protoc. 2, 1692-1704 (2007).</li>
<li>Janas, J., Skowronski, J., Van Aelst, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+delivery+of+RNAi+in+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Method+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Lentiviral delivery of RNAi in hippocampal neurons.</a> Method Enzymol. 406, 593-605 (2006).</li>
<li>Graham, F. L., vander Eb, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+technique+for+the+assay+of+infectivity+of+human+adenovirus+5+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">A new technique for the assay of infectivity of human adenovirus 5 DNA.</a> Virology. 52, 456-467 (1973).</li>
<li>Craig, A. M. Transfecting cultured neurons. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCraig%2C+AM+%22Culturing+Nerve+Cells%22">Culturing Nerve Cells</a>. Banker, G. aG. K. , 2nd edition, MIT Press. Cambridge, MA. (1998).</li>
<li>Alavian, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcl-xL+regulates+metabolic+efficiency+of+neurons+through+interaction+with+the+mitochondrial+F1FO+ATP+synthase%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Bcl-xL regulates metabolic efficiency of neurons through interaction with the mitochondrial F1FO ATP synthase.</a> Nat. Cell Biol. 13, 1224-1233 (2011).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+synaptic+function+by+VAC14%2C+a+protein+that+regulates+the+phosphoinositides+PI%283%2C5%29P%282%29+and+PI%285%29P%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Modulation of synaptic function by VAC14, a protein that regulates the phosphoinositides PI(3,5)P(2) and PI(5)P.</a> EMBO J. 31, 3442-3456 (2012).</li>
<li>Dudek, H., Ghosh, A., Greenberg, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+phosphate+transfection+of+DNA+into+neurons+in+primary+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Calcium phosphate transfection of DNA into neurons in primary culture.</a> Curr. Protoc. Neurosci. Chapter 3, Unit 3 11(2001).</li>
<li>Goslin, K. A. H., Banker, G. Rat Hippocampal Neurons in Low-Density Culture. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGoslin%2C+KAH+%22Culturing+Nerve+Cells%22">Culturing Nerve Cells</a>. Banker, G. aG. K. , MIT Press. Cambridge, MA. (1998).</li>
<li>Kohrmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast%2C+convenient%2C+and+effective+method+to+transiently+transfect+primary+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Fast, convenient, and effective method to transiently transfect primary hippocampal neurons.</a> J. Neurosci. Res. 58, 831-835 (1999).</li>
<li>Jiang, M., Chen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+Ca2%2B-phosphate+transfection+efficiency+in+low-density+neuronal+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">High Ca2+-phosphate transfection efficiency in low-density neuronal cultures.</a> Nat. Protoc. 1, 695-700 (2006).</li>
<li>Goetze, B., Grunewald, B., Baldassa, S., Kiebler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+controlled+formation+of+a+DNA%2Fcalcium+phosphate+coprecipitate%3A+application+for+transfection+of+mature+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Chemically controlled formation of a DNA/calcium phosphate coprecipitate: application for transfection of mature hippocampal neurons.</a> J. Neurobiol. 60, 517-525 (2004).</li>
</ol>

未声明利益冲突。

要实现稳定且成功的转染，有几个关键参数需要严格控制10,11。对于磷酸钙转染而言，最关键的参数是2x&#160;HBS的pH值，我们实验中通常控制在7.10–7.15之间。我们建议配制三批pH值相差0.05的储备液，以消除不同pH计之间的测量差异。或者，也可使用Clontech哺乳动物转染试剂盒提供的2x HBS，其转染效率稳定且良好。需要注意的是，即使在冷冻保存条件下，溶液的pH值仍会随时间发生变化。我们通常将2x HBS分装后在4 °C保存不超过一个月，在-20 °C保存不超过一年。
第二个参数是培养基的pH值。为了保持一致，N2.1培养基通常在星形胶质细胞培养物上孵育过夜，但不超过24小时。此外，我们尽量使用汇合度相似的星形胶质细胞培养物。使用胶质细胞条件培养基还有助于降低转染过程中对神经元的毒性。条件培养基在转染前需在培养箱中平衡，以保持pH值一致。
磷酸钙沉淀物的大小和密度是转染成功的关键。过小的沉淀物会导致转染效率低下，而过大或结块的沉淀物通常会引起细胞毒性10。为了确保...

原代神经元是最难转染的细胞类型之一，因为它们处于终末分化状态（有丝分裂后），并且对微环境变化极为敏感。目前有四种常用的方法可用于在这些细胞中表达外源基因和短发夹RNA（shRNA）1。每种方法都有其优缺点。例如，电穿孔通常需在新分离的神经元上进行2，因为细胞必须转移至电穿孔杯中才能完成转染。病毒感染通常可实现很高的转染效率3，但操作更繁琐，且对实验人员存在较高风险。市面上有多种基于脂质介导的转染试剂，其在神经元中的转染效果各不相同，且细胞毒性程度也存在差异。
磷酸钙转染是一种将外源基因导入神经元的简便且经济的方法。该方法最初由 Graham 和 Van Der Eb（1973 年）用于将腺病毒 DNA 导入哺乳动物细胞4。转染过程是将氯化钙与重组 DNA 在磷酸盐缓冲液中混合，从而形成 DNA/磷酸钙沉淀物。当这些沉淀物逐渐滴加到细胞单层上时，会黏附于细胞表面，通过内吞作用被细胞摄取，最终进入细胞核5。该过程可导致外源基因在靶细胞中的表达。磷酸钙转染的典型效率范围为 0.5–5%6–8。然而，通过仔细优化并一致地执行实验方案，转染效率可达近 50%。本文中，我们详细描述了对原代海马神经元进行磷酸钙转染的实验方案，这些神经元以夹心式共培养方式与星形胶质细胞共同培养9。

<table><tbody><tr><td>Dumont #5 镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>精细剪刀</td><td>Fine Science Tools</td><td>14090-09</td><td>直头 / 锐利 / 8.5 cm</td></tr><tr><td>Vannas-Tubinger 弹簧剪刀</td><td>Fine Science Tools</td><td>15008-08</td><td>弯头 / 锐利 / 8.5 cm / 5 mm 刃口</td></tr><tr><td>标准型镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11000-16</td><td></td></tr><tr><td>学生用手术剪刀</td><td>Fine Science Tools</td><td>91401-14</td><td>钝头 / 14.5 cm</td></tr><tr><td>弹簧剪刀</td><td>Fine Science Tools</td><td>15006-09</td><td>侧向弯曲 / 9 cm / 10 mm 刃口</td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Webster Veterinary</td><td>14043-225-06</td><td></td></tr><tr><td>聚-L-赖氨酸</td><td>Sigma</td><td>P2636</td><td></td></tr><tr><td>MEM 培养基</td><td>Sigma</td><td>M2279</td><td></td></tr><tr><td>100 mM 丙酮酸钠</td><td>Sigma</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>10x HBSS</td><td>Sigma</td><td>H4385</td><td></td></tr><tr><td>1 M HEPES, pH 7.3</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal 培养基</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td>21130-049</td><td></td></tr><tr><td>B27 补充剂 (50x)</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>N2 补充剂</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>卵白蛋白</td><td>Sigma</td><td>A5503</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>2.5% 胰蛋白酶</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td>15090-046</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma</td><td>DN-25</td><td></td></tr><tr><td>阿糖胞苷</td><td>Calbiochem/EMD Millipore</td><td>251010</td><td></td></tr><tr><td>犬尿烯酸</td><td>Sigma</td><td>K3375</td><td></td></tr></tbody></table>

原代海马神经元的磷酸钙转染

Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons

磷酸钙沉淀法是一种方便且经济的转染培养细胞的方法。经过优化，该方法也可用于原代神经元等难转染细胞的转染。本文中，我们详细描述了海马神经元与星形胶质细胞共培养体系中磷酸钙转染的实验方案。

当转染的各个参数在不同实验之间得到优化并严格控制时，可以获得高达50%的转染效率。图1展示了在DIV4时用GFP转染的一片神经元区域。该视野中共有28个神经元，其中16个被成功转染，转染效率超过50%。对同一盖玻片上其他视野的抽样观察显示，总体转染效率约为50%（数据未显示）。在星形胶质细胞共培养体系中，神经元在转染后仍保持健康并正常发育。图2展示了转染PSD-95-GFP质粒10天后（即DIV15）的一个海马神经元。该神经元已发育出大量成熟的蘑菇状树突棘，表明神经元状态良好。本方案具有高转染效率和低细胞毒性，是研究原代海马神经元基因功能的有力工具。此外，该方案还可有望被改进用于转染脑内其他类型的神经元以及其他难转染的细胞类型。
<img alt="神经元荧光显微镜图像；上图：发荧光的神经元，下图：微分干涉差（DIC）成像；用于神经元结构研究。" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_uploa...

磷酸钙沉淀法是一种方便且经济的转染培养细胞的方法。经过优化，可以利用该方法……

本实验的总体目标是将基因和短发夹RNA导入培养的神经元中。首先从新生大鼠建立星形胶质细胞培养体系，以支持神经元的生长；随后将来自E18大鼠的海马神经元与胶质细胞共培养。下一步是使用磷酸钙沉淀法转染海马神经元，随后通过荧光显微镜观察转染后的神经元。采用这些方法，转染效率可高达50%。与现有方法相比，该技术的主要优势在于操作相对简单、经济且效率非常高。尽管我们的实验方案主要针对培养的海马神经元转染，但它也可应用于其他难以转染的细胞系。进行本方案时，需预先准备好4°C的BSS解剖缓冲液以供使用。剪除幼鼠头部后，用5号镊子牢固夹住头部，使用精细剪刀沿中线切开皮肤和颅骨。将颅骨向两侧翻开，暴露脑组织。然后将脑组织取出并放入含有冷BSS的培养皿中。在解剖显微镜下，分离大脑半球与头节及脑干。用一对镊子固定组织，另一对镊子轻轻牵拉，小心去除所有脑膜。使用小剪刀将组织尽可能剪碎。然后将剪碎的组织转移至一个 50 毫升的锥形管中。向含有残留组织的培养皿中加入 BSS，再将混合液转移至锥形管中。将DNA和胰蛋白酶加入至总体积为15毫升的溶液中。将组织置于37摄氏度的摇动水浴中孵育15分钟。为确保充分混匀，每5分钟用手轻轻摇动试管一次。静置组织，待其沉淀。随后将上清液通过70微米细胞滤筛，滤入含有3毫升胎牛血清的50毫升离心管中，加入剩余的组织碎片。再加入更多的B、s、s以及胰蛋白酶。然后继续孵育15分钟。将剩余的上清液通过细胞滤筛，并与之前的上清液合并。现在将合并后的收集液在1000 RPM下离心5分钟。重悬细胞沉淀于5毫升胶质细胞培养基中。计数后，每个150平方厘米培养瓶接种一千万个细胞，并于次日开始孵育。用新鲜的胶质细胞培养基更换培养基。此后，每周用胶质细胞培养基喂养细胞两次。约10天后，细胞融合度将超过80%。此时，将细胞以每管200万个细胞的密度加入含MSO的血清中进行冻存。将分装样品置于聚苯乙烯泡沫塑料架中，在负80摄氏度下冷冻，然后转移至液氮中进行长期保存。在准备海马神经元培养板前10至14天，复苏冻存的胶质细胞。五，六。培养板足以支持90个盖玻片的海马神经元生长，另需准备8至10个60毫米的胶质细胞培养皿。在神经元培养前一天，用N 2.1培养基对转染用培养基进行预处理。用B 27培养基喂养细胞。在通过异氟烷麻醉后行气胸处死处于 E18 阶段的妊娠大鼠后，此时星形胶质细胞应达到约 90% 汇合度。解剖出胚胎大鼠。然后将胚胎脑移至BSS中，分离大脑半球和耳朵，并去除大脑半球的脑膜。接着，从大脑半球中解剖出海马体。将所有海马组织转移至一个15毫升锥形管中，用含0.25%胰蛋白酶的BSS溶液在37摄氏度下消化15分钟。随后，用BSS洗涤消化后的海马组织，每次5分钟，共洗涤3次。然后使用火焰抛光的玻璃移液管反复吹打海马组织。计数神经元后，将200,000个细胞接种至每个60毫

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科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

从特定脑区分离并培养细胞有助于研究细胞和生理参数。我们描述了一种原代细胞培养方法，可在无血清环境中获得富含神经元的培养物。...

新生大鼠（P0）海马神经元的原代培养

活细胞成像在研究细胞器运输动态时具有特别重要的应用价值。本文描述了一种利用宽场荧光显微镜对培养神经元中致密核心囊泡进行活体成像的实验方案。该方案具有良好的灵活性，可经适当调整用于成像其他细胞器，如线粒体、内体和过氧化物酶体。...

活体成像原代培养的海马神经元中的致密核心囊泡

本方案概述了分离、通过电穿孔转染以及培养小鼠海马和皮层神经元所需的步骤。短期培养可用于轴突生长和导向研究，而长期培养则适用于突触形成和树突棘分析的研究。...

胚胎小鼠海马和皮层神经元的核转染与原代培养

来源： Calvo-Rodríguez, et al. 老化海马神经元中亚细胞 Ca2+ 的荧光与生物发光成像. J. Vis. Exp. (2015).

短期与长期大鼠海马神经元培养物的体外钙成像

原代海马神经元的低密度培养通常需要胶质细胞饲养层来提供神经营养因子并维持其长期存活。本文介绍一种简化的方法，可在存在高密度神经元饲养层的情况下，在玻璃盖玻片上培养超低密度神经元，从而有利于研究特定的神经元自主机制。...

一种简化的大鼠原代海马神经元超低密度长期培养方法

此处介绍一种通过基因编码将光反应性非天然氨基酸定点插入培养神经元中表达的靶向神经元蛋白，从而利用短时闪光选择性激活该神经元蛋白的方法。 体内...

利用基因编码的非天然氨基酸在神经元中光学控制神经元蛋白

本文介绍了在胶质细胞单层上倒置培养于玻璃盖玻片的低密度原代海马神经元的培养方案。神经元层与胶质细胞层之间由石蜡蜡珠分隔。通过该方法培养的神经元适用于高分辨率光学成像和功能检测。...

低密度原代海马神经元培养

通过将突触小泡蛋白与pHluorin融合后的光学显微镜检测以及突触小泡摄取的电子显微镜观察，可检测突触小泡的内吞作用。...

在培养的海马神经元中测量突触囊泡内吞作用

本文描述了一种定量研究海马神经元轴突起始段（AIS）组装与结构的实验方案，这些神经元由于缺乏巨型锚蛋白-G而不存在预先组装的AIS。...

利用原代培养的海马神经元研究轴突起始段的组装

在此，我们演示如何将原代海马神经元的转染与活细胞共聚焦成像相结合，以分析病理蛋白诱导的轴突运输变化，并鉴定介导这些效应的分子机制通路。...

利用活细胞成像技术测定病理性蛋白对原代海马神经元轴突运输的影响

学习磷酸钙转染技术用于原代海马神经元基因导入，该方法与星形胶质细胞共培养，转染效率可达50%，操作简单经济，适用于难转染细胞系的研究。

原代海马神经元的磷酸钙转染

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