使用点击化学测量的影响，病毒感染宿主细胞RNA合成

以下实验的总体目标是分析病毒感染细胞中的转录活性。首先用裂谷热病毒 MP 12 感染 2 9 3 细胞。然后用尿苷类似物 5 hanal 尿苷标记细胞，它被整合到新生的 RNA 中。

接下来的一对，将 5 个 hanal 尿苷掺入荧光叠氮化物中。为了可视化获得的新合成的 RNA 结果，基于荧光显微镜或流式细胞术评估了感染细胞和未感染细胞之间新合成 RNA 量的差异。与使用氚化、尿苷或五溴化标记不同，这种点击化学方法不需要使用放射性同位素。

它也比抗 Roma UIN 免疫染色更快、更灵敏。这种方法的想法源于我们需要快速可靠的方法来测量感染不同漂移质量、较少病毒和 P 12 s Place 的细胞中的转录抑制。12 mm 圆形盖板滑入 12 孔组织培养板的每个孔中。

然后将 2 9 3 个细胞接种在 1 毫米的完全 DMEM 培养基中，将细胞在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳的加湿培养箱中孵育过夜。根据实验设计，稀释病毒原液，使 MP 12 感染的细胞在每孔 200 微升的总体积中达到 3 的感染倍数。一个标志是未感染的对照，另一个是转录抑制的对照。

现在，去除生长培养基。加入病毒接种物，在加湿培养箱中孵育 1 小时。吸出接种物。

每孔添加 1 毫升新鲜生长培养基，并在感染后 15 小时在 37 摄氏度下孵育。用含有 1 毫摩尔尿苷类似物的培养基替换生长培养基。五个 etal 尿苷到其中一个模拟感染的井。

同时每毫升添加 5 微克 DNA 依赖性 RNA 合成抑制剂作用。抗霉素 D.感染后 16 小时将细胞放回培养箱中。取出培养基，用每孔 1 毫升 PBS 洗涤盖玻片一次，每孔用 1 毫升 4% 对甲醛固定细胞。

用每孔 1 毫升 PBS 冲洗一次。为了组装潮湿室，请在直径为 10 厘米的细胞培养皿或培养皿的底部铺上塑料石蜡膜。用湿纸巾在盘子边缘的内侧铺上一层。

现在，为了渗透细胞，加入 1 毫升 0.2%tritton X 100 的 PBS 溶液，在室温下孵育 10 分钟，经 3 次 PBS 洗涤后，将盖玻片转移到潮湿室中进行点击反应，以检测标记的 RNA 覆盖物。每个盖玻片与 50 至 100 μL 新鲜制备的 Click 染色溶液一起孵育 1 小时。在黑暗中加入室温。

将 1 毫升 PBS 加入新鲜的 12 的孔中。将盖玻片放入孔中，用每孔 1 毫升 PBS 再洗涤两次以安装细胞。对于荧光显微镜检查，将一滴 flora mount G 放在显微镜载玻片上。

将盖玻片浸入水中。去除多余的水。将盖玻片单元的一面朝下放入 Flora Mount G 中，风干 5 分钟。

根据实验设计，用 MP 12 感染 2 9 3 个细胞。添加 MOI 3。取出生长培养基，加入稀释的病毒原液，在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳的加湿培养箱中孵育 1 小时。

用每孔 2 毫升新鲜生长的培养基替换接种物，并在 37 摄氏度下孵育，以获得病毒标记和收获的最佳时间。然后用含有 0.5 毫摩尔 5 哈纳尿苷的培养基替换生长培养基到其中一个模拟感染的孔中。同时添加每毫升 5 微克肌动菌素 D.一次 PBS 洗涤后将细胞放回培养箱中 1 小时，通过胰蛋白酶收获细胞。

用含有 1 毫摩尔 EDTA 的 PBS 洗涤收获的细胞 3 次。要固定细胞，请将沉淀重悬于 1 mL 4% PFA 中，并在室温下孵育 30 分钟。每管用 1 毫升 P-B-S-E-D-T-A 洗涤一次。

然后在室温下将细胞浸透 0.5 mL 的 0.2%Triton X 100 PBS 溶液中 10 分钟。用 1 mL 不含核酸酶的 PBS 洗涤一次，用于点击反应。Resus 将细胞沉淀悬浮在 200 微升含有荧光染料的点击染色溶液中。

如果细胞聚集在一起，则通过移液悬浮，在室温下避光孵育 1 小时，用传真缓冲液洗涤两次。在该实验中，2 9 3 个细胞感染了 MP 12 和一种缺乏抑制宿主细胞转录能力的缺失突变病毒。在模拟感染的细胞中，由于正在进行的转录，细胞核呈亮红色。

由于细胞仅用 EU 标记 1 小时，然后立即固定，因此大多数 RNA 仍留在细胞核中。相反，当用 ACT 抗霉素 D 处理细胞以药理学抑制转录时，细胞核的红色荧光显着降低。当细胞感染 MP 12 时，这种荧光同样会降低，但缺失突变体不会感染。

这不会抑制宿主转录。在这里，细胞用体外合成的 mRNA 转染，而不是用活病毒感染。细胞核中的红色荧光信号表明，与未切除的细胞相比，转染编码绿色荧光蛋白的 mRNA 的细胞仅转染编码裂谷热病毒的 mRNA 没有改变转录活性。

毒力因子 N SS 导致红色荧光减弱。定量后，获得的流式细胞术数据可以表示为散点图，其中 EU 掺入新生 RNA 的荧光信号绘制在 Y 轴上，抗裂谷热病毒染色的荧光信号绘制在 X 轴上。设置象限门，使大多数模拟感染细胞位于左上象限。

大多数 acty DRE 细胞位于左下象限，大多数感染细胞位于小区的右半部分。当细胞感染 MP 1280 时，1.5% 的总细胞或 93% 的抗裂谷热病毒阳性细胞表现出转录活性降低。相比之下，当细胞感染 R MP 12 时，克隆 13 型 91.6% 的总细胞或 97% 的抗裂谷热病毒阳性细胞表现出转录活性，这与 M 感染细胞相当。

这些数据也可以以荧光直方图的形式描述，RNA 标记并掺入 EU。在此之后，可以进行其他方法，如细胞内免疫染色，以可视化这些细胞中病毒蛋白的表达。观看本视频后，您应该对如何利用点击化学通过荧光显微镜或流式细胞术来可视化病毒感染细胞中的转录活性有很好的了解。

不要忘记，与传染性病毒一起工作可能非常危险，因此请采取预防措施，例如佩戴适当的个人防护装备和避免吸入气溶胶。