完整心脏中单个线粒体超氧闪光的共聚焦成像 体内

本实验的总体目标是原位或活体监测单个线粒体事件，例如超氧自由基闪光和膜电位波动，从而在生理相关背景下实时评估线粒体功能。该目标首先通过暴露小鼠后肢的骨骼肌来实现，随后在活体状态下获取骨骼肌的时间序列共聚焦图像。

然后对小鼠心脏进行灌注，并使用共聚焦显微镜进行成像。最后，对图像进行处理并分析数据。最终，可通过延时和二维共聚焦图像获得结果，显示体内骨骼肌或灌注心脏中单个线粒体超氧化物闪光及膜电位波动。

与现有的通过分离线粒体来评估线粒体功能的方法相比，该技术的主要优势在于能够在生理相关条件下实时评估单个线粒体的功能。本方法的演示至关重要，因为活体组织、动物或离体组织的共聚焦成像较难掌握，其操作过程更为复杂且学习曲线陡峭。根据文本方案准备好等渗平衡盐溶液（IBSS）、Krebs Henseleit 缓冲液（KHB）以及手术器械后，通过腹腔注射戊巴比妥麻醉小鼠，并进行足趾夹捏实验以确认动物已处于镇静状态。

使用剃刀剃除后肢一侧的毛发，然后用70%乙醇对部位进行消毒。接着，沿肢体外侧皮肤做一切口，以暴露腓肠肌。随后使用锐利的镊子轻轻提起肌膜，并用剪刀将其剪开。

进一步解剖以去除肌外膜，暴露其下方的肌纤维。向IBSS中加入500纳米浓度的四乙基罗丹明甲酯（tetraethyl, rod domine methyl ester）或TMRM，将肌肉浸入该溶液中孵育30分钟。用40倍油镜观察，在肌肉加载TMRM后，使用不含TMRM的IBSS洗涤肌肉。

将小鼠侧置于共聚焦显微镜载物台上，固定后肢，使暴露的骨骼肌位于定制腔室中并与盖玻片相对。然后轻轻按压腿部，使组织与盖玻片紧密接触，并用 IBSS 浸没暴露的肌肉。使用 8 位像素深度和每帧 1 秒的采样速率，对肌肉进行二维连续扫描。首先在 405 纳米波长激发，收集大于 505 纳米的发射光，以获取连续图像。

然后在488纳米处激发，同时在大于505纳米的波长范围内收集信号。对于MT.CCP YFP的双波长激发，采用405、488和543纳米的顺序激发，并分别在505至545、505至545以及大于560纳米的波长范围内收集发射光。对于M-T-C-P-Y-F-P和TMRM的三波长激发成像以观察小鼠心脏，需向动物注射200单位的肝素。

等待10分钟后，通过胸腔切开术处死小鼠，迅速取出心脏、肺脏以及附着其上的胸腺。迅速将植入的组织转移至冰冻的IBSS中。然后辨认胸腺的叶状结构，并轻轻将其掀开。

为了暴露升主动脉，需移除肺和胸腺，并通过仔细剥离周围组织来游离主动脉。接着，在主动脉弓第一个分支之前的升主动脉上端做一切口。然后用两把显微缝合镊子轻轻夹住主动脉壁以暴露管腔，并小心将其套入导管上。

使用微血管钳固定主动脉并迅速在其周围结扎缝线。移除血管钳，用镊子仔细检查确保套管尖端位于主动脉根部上方。如有必要，可加扎缝线以固定心脏位置。

启动蠕动泵并灌注心脏。以每分钟1毫升的速度灌注时，心脏将在灌注后恢复搏动。稳定10分钟后，用10微摩尔的BLE他汀和100至500纳摩尔的TMRM立即灌注心脏。

10分钟后，心跳将逐渐减慢。接下来，调整灌注系统的位置，将心脏置于显微镜载物台上，该载物台配备有加热适配器，可将孵育腔加热至37摄氏度。向孵育腔中加入1毫升KHB灌注液，使心脏部分浸没于溶液中。

使用蠕动泵从灌流 chamber 中移除流出液。逐渐增加泵速，以提供足够的心脏灌注流量，确保心脏与盖玻片紧密接触，并进一步抑制心跳，对心脏施加轻柔压力。按照本视频前面所述肌肉成像的方法对器官进行成像，并调整焦平面以获得最清晰的图像。

使用共聚焦显微镜软件的生理分析模块。首先打开自动生成的数据库，然后打开待分析的二维图像文件。点击“感兴趣区域”或 ROI 均值。

切换至 ROI 均值模式。关闭除 488 纳米处的 CP YFP 通道外的所有通道显示，以用于选择荧光信号。放大图像，并手动移动滑动条以播放连续的二维图像。

接下来，通过定位荧光信号短暂增强的位置来识别单个线粒体超氧瞬变事件。使用适当的 ROI 工具标记这些瞬变事件，每个 ROI 的时间依赖性荧光变化曲线将显示在图像旁边。在选中所有瞬变事件后，开启其他通道的显示。

在细胞外的图像上选择一个感兴趣区域（ROI），用于背景信号扣除。然后输出每个 ROI 的平均荧光强度及其对应的时间标签。记录每幅连续扫描图像文件中的闪光次数，同时记录扫描时间及细胞面积。

使用 Excel 计算闪光频率，单位为每 100 秒闪光次数以及每 1000 平方微米细胞面积的闪光次数。计算每次闪光的振幅、达峰时间及衰减时间。采用基于交互式数据语言编写的一套自定义程序中的闪光参数分析模块进行分析。

利用本方案，可在麻醉小鼠的骨骼肌中进行单个线粒体事件的活体成像，随后在灌注心脏中进行原位成像。如图所示，四甲基罗丹明甲酯（TMRM）是一种线粒体膜电位指示剂，常用于验证 M-T-C-P-Y-F-P 的定位，其信号应与 M-T-C-P-Y-F-P 信号呈现完全重叠的模式。

其光谱可与CP YFP区分开来，通过使用顺序激发方法，TMRM和M-T-C-P-Y-F-P的发射信号不会相互干扰。这些图像表明，在连续的二维扫描图像中可以识别出伴随膜去极化的单个线粒体超氧爆发事件，该事件在骨骼肌组织和心肌中均表现为相对于背景信号的瞬时荧光增强。除了高分辨率外，还需要足够的荧光强度。

这可以通过调节激光强度和采集通道的增益来实现。通常，将细胞的本底荧光信号设定为该通道最大强度的三分之一至四分之一。由于 M-T-C-P-Y-F-P 的表达水平以及 TMRM 的加载量在不同动物之间可能存在差异，因此应针对每次实验对成像条件进行精细调整，包括生理和病理干扰因素，例如代谢底物。

此处所示的电刺激以及缺血再灌注已被用于证明超氧闪光活性会响应细胞代谢状态的变化。在尝试该操作时，重要的是要记住保持口腔适当的麻醉状态以及灌注心脏的正确生理条件。在完成该操作后，还可进行其他方法，如缺血与融合实验，以回答更多科学问题，例如心肌白血病及再灌注损伤过程中的线粒体功能障碍。