Name: 单线粒体超氧闪烁在完整心脏或共聚焦成像在体内 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-05T19:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 6 s
Description: 了解利用共聚焦显微镜在小鼠骨骼肌和灌注心脏中实时监测单线粒体超氧闪烁和膜电位波动的方法。该技术可在生理相关条件下评估线粒体功能，为研究健康和疾病状态下的线粒体动力学提供高分辨率成像手段。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

作者感谢程和平博士、张慧亮博士和Stephen Kolwicz博士在本方法开发过程中提供的有益建议和技术支持。本研究由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目以及美国心脏协会授予WW的科学家发展基金资助。

1. 实验准备
<ol>
	<li>配制等渗平衡盐溶液（50 ml），其中包含：140 mM NaCl、5 mM KCl、2.5 mM CaCl₂、10 mM 葡萄糖、10 mM HEPES，用 NaOH 调节 pH 至 7.4。2，2 mM MgCl2 和10 mM HEPES（pH 7.2）用于 体内 骨骼肌成像</li>
	<li>配制 1 L 含有以下成分的克雷布斯-亨塞尔特缓冲液（KHB）：118 mM NaCl、5.3 mM KCl、1.2 mM MgSO₄4，0.5 mM EDTA 和 25 mM NaHCO₃3.</li>
	<li>用含95% O₂的气体对KHB进行鼓泡处理2/5% CO₂2 在加入 2 mM CaCl 之前孵育 10–15 分钟2。加入代谢底物（例如&#160;10 mM 葡萄糖和 0.5 mM 丙酮酸盐。</li>
	<li>通过将钳子、剪刀和镊子在70%乙醇中灭菌，然后在无菌ddH₂O中冲洗，以准备手术器械。2O.</li>
	<li>打开心脏灌流系统，调节水浴循环仪的温度，将蠕动泵的转速设为6 ml/min。</li>
	<li>用95% O₂饱和KHB溶液2/5% CO₂2 气体，并监测流出物的流速和温度（37 °C，使用光纤温度探针）。系统需要约20分钟以达到气体和温度的平衡。</li>
</ol>
2. 活体骨骼肌的共聚焦成像 In Vivo
<ol>
	<li>用戊巴比妥钠（80 mg/kg，腹腔注射）麻醉小鼠。动物将在10–15分钟内达到手术麻醉深度（对足趾夹捏无反应），并维持该状态1–1.5小时，足以完成后续操作 体内 骨骼肌成像</li>
	<li>去除一只后肢的毛发，并用70%乙醇对皮肤进行消毒。</li>
	<li>沿肢体外侧皮肤做切口，暴露腓肠肌。</li>
	<li>用尖头镊子轻轻夹起肌外膜，用剪刀将其剪开。进一步解剖以去除肌外膜，暴露其下方的肌纤维。</li>
	<li>对于 体内 将TMRM（500 nM）加入等渗平衡盐溶液中，浸没骨骼肌30分钟，以实现TMRM的加载，随后用不含指示剂的溶液洗去。</li>
	<li>将小鼠侧卧于共聚焦显微镜（Zeiss LSM 510）载物台上，固定其后肢，使暴露的骨骼肌面向培养腔底部的盖玻片。盖玻片位于肌肉组织与倒置物镜（40倍油镜）之间。</li>
	<li>轻轻下压腿部，使组织与盖玻片紧密贴合。将暴露的肌肉浸入等渗平衡盐溶液中。</li>
	<li>记录二维（2D， xy以每帧1秒的采样速率采集共聚焦图像。每个像素的强度以8位深度进行数字化。通常，一次序列扫描包含100帧。</li>
	<li>通过先在405 nm处激发并采集信号来获取连续图像 &#62;505 nm 处，然后在 488 nm 处激发并同时采集信号 &#62;505 nm，用于 mt-cpYFP 的双波长激发成像。采用 405、488 和 543 nm 的顺序激发，分别在 505–545、505–545 和 &#62;560 nm，分别用于mt-cpYFP和TMRM的三波长激发成像。</li>
</ol>
3. 灌注小鼠心脏的共聚焦成像
<ol>
	<li>完成骨骼肌体内成像后，立即向小鼠腹腔注射 200 单位肝素。10 分钟后，通过开胸法处死小鼠，并迅速取出带有肺和胸腺的心脏。</li>
	<li>在冰浴缓冲液中快速分离肺组织。辨认胸腺的各个叶，并轻轻掀开以暴露升主动脉。</li>
	<li>去除胸腺，仔细清除周围组织，分离出主动脉。</li>
	<li>在主动脉弓第一个分支之前的升主动脉上端做一切口。</li>
	<li>用两把显微缝合镊子轻轻夹住主动脉壁以暴露管腔，小心地将主动脉套入灌流导管（PE50 管）。使用微血管夹固定主动脉位置，同时迅速用缝线结扎固定。</li>
	<li>移除血管夹，用镊子小心检查导管，确保导管尖端位于主动脉根部上方。根据需要添加额外结扎线以固定心脏位置。</li>
	<li>启动蠕动泵，以 1 ml/min 的流速灌注心脏。灌注后心脏将恢复搏动。</li>
	<li>调整灌注系统的位�置，将心脏置于显微镜载物台上。载物台配有加热适配器，可对容纳心脏的灌流腔室进行加热。</li>
	<li>向腔室内加入 1 ml KHB 灌注液，使心脏部分浸没。监测腔室温度保持在 37 °C，并使用蠕动泵移除流出液。</li>
	<li>逐步提高蠕动泵流速，使心脏获得足够的灌注流量（约 2 ml/min）。</li>
	<li>稳定灌注 10 分钟后，向灌注液中加入 10 μM blebbistatin 和 100–500 nM TMRM。10 分钟后心率将减慢。</li>
	<li>对心脏施加轻柔压力，确保心脏与腔室底部的盖玻片紧密接触，进一步抑制心跳。</li>
	<li>按照上述第 2.8 步所述方法，对完整心肌组织进行共聚焦成像。仔细调节焦平面，以获得最清晰的图像。</li>
</ol>
4. 图像处理与数据分析
<ol>
	<li>使用共聚焦软件中&#34;生理学分析&#34;模块提供的工具分析单个线粒体闪光事件及膜电位变化。该模块通常包含在共聚焦系统的图像采集软件中，可用于在图像中划定特定区域，并输出带时间标签的荧光强度数据。</li>
	<li>打开数据库，然后打开待分析的连续二维图像文件。</li>
	<li>点击&#34;感兴趣区域（ROI）均值&#34;，切换至&#34;ROI均值&#34;模式。再次点击&#34;感兴趣区域（ROI）均值&#34;，以确认进入&#34;ROI均值&#34;模式。</li>
	<li>关闭除cpYFP 488 nm通道外的其他通道显示，以便选择闪光信号。</li>
	<li>放大图像，并手动移动滑动条以播放连续的二维图像序列。</li>
	<li>通过寻找荧光信号短暂增强的位置，识别单个线粒体超氧闪光事件。使用合适的ROI工具标记闪光区域。每个ROI的荧光强度随时间变化的曲线将显示在图像旁。</li>
	<li>完成所有闪光事件的选取后，重新开启其他通道的显示。在细胞外区域选择一个ROI用于背景信号扣除。输出每个ROI的平均荧光强度及其对应的时间标签。</li>
	<li>记录每个连续扫描图像文件中的闪光次数，以及扫描时间和细胞面积。使用Excel计算闪光频率，单位为每100秒/1,000 μm2细胞面积内的闪光数。</li>
	<li>使用基于交互式数据语言（IDL, ResearchSystems）编写的自定义程序计算每个闪光事件的参数（包括幅度、达峰时间及衰减时间）。IDL软件为商业软件，用于闪光参数分析的自定义程序可向作者申请获取。</li>
</ol>

<ol><li>Brookes, P. S., Yoon, Y., Robotham, J. L., Anders, M. W., Calcium Sheu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium%2C+ATP%2C+and+ROS%3A+a+mitochondrial+love-hate+triangle%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Calcium, ATP, and ROS: a mitochondrial love-hate triangle.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 287, 817-833 (2004).</li>
<li>Scheffler, I. E. Mitochondria. , 2nd, J. Wiley and Sons, Inc. (2008).</li>
<li>Rosca, M. G., Hoppel, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+in+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Mitochondria in heart failure.</a> Cardiovasc. Res. 88, 40-50 (2010).</li>
<li>Griffiths, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+and+heart+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Exp.+Med.+Biol%22%5BJournal%5D)">Mitochondria and heart disease.</a> Adv. Exp. Med. Biol. 942, 249-267 (2012).</li>
<li>Winklhofer, K. F., Haass, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+in+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1802, 29-44 (2010).</li>
<li>Pieczenik, S. R., Neustadt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+and+molecular+pathways+of+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Mol.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction and molecular pathways of disease.</a> Exp. Mol. Pathol. 83, 84-92 (2007).</li>
<li>Szentesi, P., Zaremba, R., van Mechelen, W., Stienen, G. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP+utilization+for+calcium+uptake+and+force+production+in+different+types+of+human+skeletal+muscle+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">ATP utilization for calcium uptake and force production in different types of human skeletal muscle fibres.</a> J. Physiol. 531, 393-403 (2001).</li>
<li>Lemieux, H., Hoppel, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+in+the+human+heart%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bioenerg.+Biomembr%22%5BJournal%5D)">Mitochondria in the human heart.</a> J. Bioenerg. Biomembr. 41, 99-106 (2009).</li>
<li>Chance, B., Williams, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+enzymes+in+oxidative+phosphorylation.+III.+The+steady+state%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation. III. The steady state.</a> J. Biol. Chem. 217, 409-427 (1955).</li>
<li>Lambert, A. J., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species+production+by+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species production by mitochondria.</a> Methods Mol Biol. 554, 165-181 (2009).</li>
<li>Brand, M. D., Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+mitochondrial+dysfunction+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Assessing mitochondrial dysfunction in cells.</a> Biochem. J. 435, 297-312 (2011).</li>
<li>Robinson, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+fluorescent+imaging+of+superoxide+in+vivo+using+ethidium-based+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Selective fluorescent imaging of superoxide in vivo using ethidium-based probes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 15038-15043 (2006).</li>
<li>Dickinson, B. C., Srikun, D., Chang, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial-targeted+fluorescent+probes+for+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial-targeted fluorescent probes for reactive oxygen species.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 14, 50-56 (2010).</li>
<li>Dooley, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+dynamic+redox+changes+in+mammalian+cells+with+green+fluorescent+protein+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Imaging dynamic redox changes in mammalian cells with green fluorescent protein indicators.</a> J. Biol. Chem. 279, 22284-22293 (2004).</li>
<li>Hanson, G. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+mitochondrial+redox+potential+with+redox-sensitive+green+fluorescent+protein+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Investigating mitochondrial redox potential with redox-sensitive green fluorescent protein indicators.</a> J. Biol. Chem. 279, 13044-13053 (2004).</li>
<li>Belousov, V. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+fluorescent+indicator+for+intracellular+hydrogen+peroxide%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded fluorescent indicator for intracellular hydrogen peroxide.</a> Nat. Methods. 3, 281-286 (2006).</li>
<li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superoxide+Flashes+in+Single+Mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Superoxide Flashes in Single Mitochondria.</a> Cell. 134, 279-290 (2008).</li>
<li>Wei-Lapierre, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respective+Contribution+of+Mitochondrial+Superoxide+and+pH+to+Mitochondria-targeted+Circularly+Permuted+Yellow+Fluorescent+Protein+%28mt-cpYFP%29+Flash+Activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Respective Contribution of Mitochondrial Superoxide and pH to Mitochondria-targeted Circularly Permuted Yellow Fluorescent Protein (mt-cpYFP) Flash Activity.</a> J. Biol. Chem. 288, 10567-10577 (2013).</li>
<li>Fang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+superoxide+flash+and+metabolism-coupled+mitochondrial+permeability+transition+in+living+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Imaging superoxide flash and metabolism-coupled mitochondrial permeability transition in living animals.</a> Cell Res. 21, 1295-1304 (2011).</li>
<li>Wei, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+superoxide+flashes%3A+metabolic+biomarkers+of+skeletal+muscle+activity+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial superoxide flashes: metabolic biomarkers of skeletal muscle activity and disease.</a> FASEB J. 25, 3068-3078 (2011).</li>
<li>Sheu, S. S., Wang, W., Cheng, H., Dirksen, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superoxide+flashes%3A+illuminating+new+insights+into+cardiac+ischemia%2Freperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Superoxide flashes: illuminating new insights into cardiac ischemia/reperfusion injury.</a> Future Cardiol. 4, 551-554 (2008).</li>
<li>Wei, L., Dirksen, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perspectives+on%3A+SGP+symposium+on+mitochondrial+physiology+and+medicine%3A+mitochondrial+superoxide+flashes%3A+from+discovery+to+new+controversies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Perspectives on: SGP symposium on mitochondrial physiology and medicine: mitochondrial superoxide flashes: from discovery to new controversies.</a> J. Gen. Physiol. 139, 425-434 (2012).</li>
<li>Johnson, I., Spence, M. T. Z. Ch. 12.2. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJohnson%2C+I+%22The+Molecular+Probes+Handbook%2C+A+Guide+to+Fluorescent+Probes+and+Labeling+Technologies%22">The Molecular Probes Handbook, A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies</a>. , Life Technologies Corp. 510-511 (2013).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superoxide+flashes%3A+elemental+events+of+mitochondrial+ROS+signaling+in+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Superoxide flashes: elemental events of mitochondrial ROS signaling in the heart.</a> J. Mol. Cell Cardiol. 52, 940-948 (2012).</li>
<li>Li, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superoxide+flashes+reveal+novel+properties+of+mitochondrial+reactive+oxygen+species+excitability+in+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Superoxide flashes reveal novel properties of mitochondrial reactive oxygen species excitability in cardiomyocytes.</a> Biophys. J. 102, 1011-1021 (2012).</li>
<li>Bell, R. M., Mocanu, M. M., Yellon, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrograde+heart+perfusion%3A+The+Langendorff+technique+of+isolated+heart+perfusion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Cell.+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Retrograde heart perfusion: The Langendorff technique of isolated heart perfusion.</a> J. Mol. Cell. Cardiol. 50, 940-950 (2011).</li>
<li>Pasdois, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+diazoxide+on+flavoprotein+oxidation+and+reactive+oxygen+species+generation+during+ischemia-reperfusion%3A+a+study+on+Langendorff-perfused+rat+hearts+using+optic+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effect of diazoxide on flavoprotein oxidation and reactive oxygen species generation during ischemia-reperfusion: a study on Langendorff-perfused rat hearts using optic fibers.</a> Am. J. Physiol. 294, H2088-H2097 (2008).</li>
<li>Granville, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduction+of+ischemia+and+reperfusion-induced+myocardial+damage+by+cytochrome+P450+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Reduction of ischemia and reperfusion-induced myocardial damage by cytochrome P450 inhibitors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 1321-1326 (2004).</li>
<li>Davidson, S. M., Yellon, D. M., Murphy, M. P., Duchen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slow+calcium+waves+and+redox+changes+precede+mitochondrial+permeability+transition+pore+opening+in+the+intact+heart+during+hypoxia+and+reoxygenation%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Slow calcium waves and redox changes precede mitochondrial permeability transition pore opening in the intact heart during hypoxia and reoxygenation.</a> Cardiovasc. Res. 93, 445-453 (2012).</li>
</ol>

作者声明不存在相互竞争的经济利益。

在活体动物或灌注器官中成像单个线粒体事件，相较于传统的线粒体功能评估方法具有显著优势17,19,21,22,24,25. 此处所述技术可实现实时 原位 在亚细胞分辨率下测定线粒体功能在真实生理条件下的状态。当与其他测量方法结合时，这对于系统研究线粒体在特定器官或细胞类型正常功能中的作用尤为有用。 体内这是一种结合了共聚焦显微镜和复杂灌注系统的复杂技术，可对多种参数进行精确控制。尽管如此，该技术已被用于将机体整体葡萄糖代谢与肌肉线粒体功能关联起来。17,19,20 目前我们正利用这些方法研究心脏病中的线粒体功能障碍。
朗根多夫心脏灌流系统可通过监测左心室压力和成像细胞内Ca²⁺来评估心脏功能2+ 每次搏动期间的瞬时变化。或者，可灌注其他荧光探针（如 MitoSOX 或 DCF）以辅助 原位 心肌中稳态活性氧水平的成像。Langendorff 灌流心脏已被广泛用于评估心脏对生理条件（例如 多巴酚丁胺诱导的β-肾上腺素能刺激）或病理性的（例如<...

线粒体在细胞生物能量学、自由基信号传导、氧化还原稳态、离子调节以及细胞命运决定中发挥核心作用1,2。线粒体功能障碍常常伴随并参与多种疾病的发病机制3-6。尤其在心脏和骨骼肌等肌肉系统中，线粒体呼吸作用提供了大部分ATP，以支持细胞内钙离子的及时调控和强健的收缩力生成7,8。这些肌肉含有大量线粒体，其体积可占细胞总体积的20–40%，并&#34;固定&#34;分布于肌丝之间2。
尽管已有大量研究，但我们对线粒体功能调控的理解，特别是在活体（in vivo）和生理相关条件下的调控，仍然有限。其中一个原因是，目前开发的大多数评估线粒体功能的方法依赖于体外（in vitro）或离体（ex vivo）手段，例如通过人工底物补充后监测分离线粒体的耗氧量，或通过形态学（例如&#160;电子显微镜）、酶活性（例如&#160;顺乌头酸酶活性）或细胞内ATP水平等间接方式来评估线粒体功能9-11。
近年来，具有相对线粒体富集特性的 小分子荧光探针 已被用于观察完整细胞中线粒体的信号，包括膜电位、钙离子和活性氧（ROS）11-13此外，已开发出多种基于绿色荧光蛋白（GFP）的氧化还原与活性氧（ROS）探针，以实现对区室化细胞内氧化还原状态或ROS信号的更特异性检测。14-16其中，我们开发了一种可遗传编码的超氧阴离子指示剂——环状重排的黄色荧光蛋白，并将其靶向定位至线粒体（mt-cpYFP）17mt-cpYFP 可在 405 或 488 nm 激发，两种激发条件下的发射峰均位于 515 nm。在 488 nm 激发时的发射信号对超氧阴离子具有特异性响应，这一点已被先前研究证实。 体外 和 体内 校准17,18405 nm 激发下的发射信号用作内参对照（有关 mt-cpYFP 在不同条件下的激发和发射光谱的详细信息，请参见参考文献17中的图1）。通过时间推移共聚焦成像，该探针可检测完整细胞中单个线粒体内爆发性超氧阴离子生成事件，称为超氧闪（superoxide flash）。超氧闪是线粒体呼吸功能的综合体现，伴随短暂的线粒体膜去极化和活性氧（ROS）的产生17-20最近，我们利用pUC-CAGGS-mt-cpYFP载体构建了泛组织mt-cpYFP转基因小鼠17,19 在C57/BL6背景下验证了该指示剂在心脏、骨骼肌及其他组织中的强表达（图2). 转基因小鼠将在华盛顿大学批准材料转让协议（MTA）后，根据请求提供给感兴趣的学术研究人员。
在本研究中，我们描述 原位 离体灌注心脏中超氧闪光的成像以及 体内 麻醉状态下mt-cpYFP转基因小鼠骨骼肌中闪光事件的成像17,19该技术可在生理相关条件下实时监测单个线粒体活性氧生成事件 体内 21,22还可以利用该系统结合适当的荧光探针监测其他单个线粒体参数，如膜电位和钙离子浓度。此外，可同步或平行评估线粒体功能与细胞内事件例如&#160;钙瞬变）或心脏功能（例如&#160;射血分数）可以实现。可通过向灌注心脏施加缺血与再灌注等病理干扰，以评估应激对完整心肌中单个线粒体功能的影响。

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;强&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Blebbistatin</td><td>多伦多研究化学品公司</td><td>B592500</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Acros Organics</td><td>AC34961-5000</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP120-500</td><td></td></tr><tr><td>D-葡萄糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270-1</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7006-500</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541-1</td><td></td></tr><tr><td>MgCl₂&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;bull;6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP214-500</td><td></td></tr><tr><td>MgSO₄&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;bull;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1880-1</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8282-500</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO₃&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6014-1</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2256-25</td><td></td></tr><tr><td>TMRM</td><td>Invitrogen</td><td>T-668</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;强&gt;设备&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">共聚焦线扫描显微镜（LSM 510 Meta，Zeiss），软件版本 4.2 SP1，包含 &quot;生理学分析&quot; 模块</td></tr></tbody></table>

完整心脏中单个线粒体超氧闪光的共聚焦成像 体内

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

线粒体是真核生物系统中一种关键的细胞内细胞器，负责能量生成和细胞内信号传导。线粒体功能障碍常伴随人类疾病发生，并在其中发挥促进作用。目前开发的用于评估线粒体功能与功能障碍的大多数方法均基于 体外 或 离体 测量。这些实验的结果在确定线粒体功能方面能力有限 体内在这里，我们介绍一种利用共聚焦扫描显微镜对活体动物完整组织进行成像的新方法，该方法可实时评估单个线粒体的功能。 体内首先，我们构建表达线粒体靶向的超氧阴离子指示剂——环状重排的黄色荧光蛋白（mt-cpYFP）的转基因小鼠。将麻醉后的mt-cpYFP小鼠固定于定制的载物台适配器上，对暴露的后肢骨骼肌进行延时成像。随后处死小鼠，取出心脏并连接至Langendorff灌流系统，以37 °C的生理溶液进行灌流。将灌流中的心脏置于共聚焦显微镜载物台上的特制腔室中，并施加轻柔压力以固定心脏，抑制心跳引起的空间位移伪影。通过每秒一帧的实时二维共聚焦成像检测超氧闪变信号。灌流液可添加不同的呼吸底物或其他荧光指示剂，亦可通过调整灌流条件构建缺血-再灌注等疾病模型。该技术为在完整组织中研究单个线粒体功能提供了一种独特的方法 体内.

根据本方案，可在麻醉小鼠的骨骼肌中进行单个线粒体事件的活体成像，随后在灌注心脏中进行原位成像（图1）。优化成像条件可确保获得完整肌肉组织的清晰图像，并达到单个线粒体的分辨率（图2）。通常使用TMRM来验证mt-cpYFP的定位，其信号应与mt-cpYFP信号完全重叠（图2）。TMRM是一种 commercially available 的用于完整细胞中线粒体膜电位检测的指示剂23，其光谱与cpYFP可区分。此外，通过使用顺序激发方法，TMRM与mt-cpYFP的发射信号不会相互干扰17。如图3所示的代表性图像表明，在连续二维扫描图像中可识别出伴随膜去极化的单个线粒体超氧爆发事件，在骨骼肌组织和心肌中均表现为相对于背景信号的瞬时荧光增强（图3）。除了高分辨率外，还需具备足够的荧光强度，这可通过调节激光强度和信号采集通道的增益来实现。通常将细胞的基础荧光信号设定为通道最大强度的三分之一至四分之一...

共聚焦扫描显微镜用于在活体动物的灌注心脏或骨骼肌中成像单个线粒体事件。对单个线粒体过程（如超氧自由基闪光和膜电位波动）进行实时监测，能够在生理相关环境以及病理干扰条件下评估线粒体功能。

线粒体是真核系统中负责能量产生和细胞内信号传导的关键细胞器。线粒体……

本实验的总体目标是原位或活体监测单个线粒体事件，例如超氧自由基闪光和膜电位波动，从而在生理相关背景下实时评估线粒体功能。该目标首先通过暴露小鼠后肢的骨骼肌来实现，随后在活体状态下获取骨骼肌的时间序列共聚焦图像。然后对小鼠心脏进行灌注，并使用共聚焦显微镜进行成像。最后，对图像进行处理并分析数据。最终，可通过延时和二维共聚焦图像获得结果，显示体内骨骼肌或灌注心脏中单个线粒体超氧化物闪光及膜电位波动。与现有的通过分离线粒体来评估线粒体功能的方法相比，该技术的主要优势在于能够在生理相关条件下实时评估单个线粒体的功能。本方法的演示至关重要，因为活体组织、动物或离体组织的共聚焦成像较难掌握，其操作过程更为复杂且学习曲线陡峭。根据文本方案准备好等渗平衡盐溶液（IBSS）、Krebs Henseleit 缓冲液（KHB）以及手术器械后，通过腹腔注射戊巴比妥麻醉小鼠，并进行足趾夹捏实验以确认动物已处于镇静状态。使用剃刀剃除后肢一侧的毛发，然后用70%乙醇对部位进行消毒。接着，沿肢体外侧皮肤做一切口，以暴露腓肠肌。随后使用锐利的镊子轻轻提起肌膜，并用剪刀将其剪开。进一步解剖以去除肌外膜，暴露其下方的肌纤维。向IBSS中加入500纳米浓度的四乙基罗丹明甲酯（tetraethyl, rod domine methyl ester）或TMRM，将肌肉浸入该溶液中孵育30分钟。用40倍油镜观察，在肌肉加载TMRM后，使用不含TMRM的IBSS洗涤肌肉。将小鼠侧置于共聚焦显微镜载物台上，固定后肢，使暴露的骨骼肌位于定制腔室中并与盖玻片相对。然后轻轻按压腿部，使组织与盖玻片紧密接触，并用 IBSS 浸没暴露的肌肉。使用 8 位像素深度和每帧 1 秒的采样速率，对肌肉进行二维连续扫描。首先在 405 纳米波长激发，收集大于 505 纳米的发射光，以获取连续图像。然后在488纳米处激发，同时在大于505纳米的波长范围内收集信号。对于MT.CCP YFP的双波长激发，采用405、488和543纳米的顺序激发，并分别在505至545、505至545以及大于560纳米的波长范围内收集发射光。对于M-T-C-P-Y-F-P和TMRM的三波长激发成像以观察小鼠心脏，需向动物注射200单位的肝素。等待10分钟后，通过胸腔切开术处死小鼠，迅速取出心脏、肺脏以及附着其上的胸腺。迅速将植入的组织转移至冰冻的IBSS中。然后辨认胸腺的叶状结构，并轻轻将其掀开。为了暴露升主动脉，需移除肺和胸腺，并通过仔细剥离周围组织来游离主动脉。接着，在主动脉弓第一个分支之前的升主动脉上端做一切口。然后用两把显微缝合镊子轻轻夹住主动脉壁以暴露管腔，并小心将其套入导管上。使用微血管钳固定主动脉并迅速在其周围结扎缝线。移除血管钳，用镊子仔细检查确保套管尖端位于主动脉根部上方。如有必要，可加扎缝线以固定心脏位置。启动蠕动泵并灌注心脏。以

confocal-imaging-single-mitochondrial-superoxide-flashes-intact-heart

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

单线粒体超氧闪烁在完整心脏或共聚焦成像在体内

本文介绍了一种高效的方法，用于深入研究旁分泌来源的活性氧（ROS）诱导内皮细胞Ca2+信号的可视化。该方法利用共培养模型，检测旁分泌来源的ROS所触发的血管内皮细胞内Ca2+动员。...

由旁分泌来源的活性氧触发的血管钙2+信号转导的可视化

通过追踪光转化的基质靶向GFP在随时间变化的线粒体网络中的平衡情况，来测量线粒体融合。迄今为止，每次仅能对一个细胞进行长达一小时的动力学分析。我们提出了一种可同时测量多个细胞的方法，从而加快了数据采集过程。...

一种基于mtPA-GFP的快速、高分辨率线粒体融合检测方法：利用共聚焦显微镜并行获取多个细胞的动力学数据

本研究的目的是在生理前负荷和后负荷压力条件下，监测离体心脏的线粒体氧化还原状态。本文介绍了一种双心室工作状态的兔心脏模型。通过高时空分辨率的NADH荧光成像，监测心外膜组织中线粒体的氧化还原状态。...

离体双心室工作兔心脏的NADH荧光成像

来源：Kennedy, L. H., 等人 利用腺相关病毒和共聚焦显微镜对脑片中少突胶质细胞细胞器进行可视化与活体成像 视频实验杂志...

器官型脑切片培养中少突胶质细胞内线粒体运动的共聚焦成像

要深入理解线粒体功能的调控机制，必须分析线粒体结构与功能之间的关系。本文描述并演示了在活体和固定处理的黑腹果蝇（Drosophila）卵巢中研究线粒体结构与功能的特定方法。...

在 Drosophila 卵巢中研究线粒体结构与功能

我们提出了一种研究线粒体和内质网在基因改造后于全细胞中分布的方案，该方案结合了相关光镜与三维电子显微镜技术，包括抗坏血酸过氧化物酶2和辣根过氧化物酶染色、在同一切片中对含有或不含目标基因的细胞进行连续切片，以及通过电子显微镜进行连续成像。...

线粒体与内质网的光与体电子显微镜关联成像

本技术描述了一种有效的工作流程，利用基于荧光的活细胞成像方法，在HeLa细胞中对线粒体膜电位和超氧化物水平进行可视化及定量检测。...

基于荧光的活体成像法定量检测HeLa细胞线粒体膜电位和超氧水平

过氧化氢（H2O2）既是氧化损伤的来源，也是一种信号分子。本实验方案介绍了如何在活酵母细胞中利用线粒体靶向的基因编码比率型生物传感器 HyPer7（mtHyPer7）来检测线粒体内的...

活酵母细胞中线粒体过氧化氢比率型生物传感器 mtHyPer7 的成像

本方案描述了一种利用相关联的光学显微镜与电子显微镜技术，分别对经mEosEM和APEX2标记的线粒体与溶酶体进行成像，以可视化其相互作用的方法。...

双色相关光镜与电镜技术用于线粒体与溶酶体相互作用的可视化研究

本文介绍了利用共聚焦显微镜和ImageJ评估线粒体裂变/融合动态的方法 通过 Dendra2...

肾近端小管细胞中线粒体分裂/融合动态的评估

了解利用共聚焦显微镜在小鼠骨骼肌和灌注心脏中实时监测单线粒体超氧闪烁和膜电位波动的方法。该技术可在生理相关条件下评估线粒体功能，为研究健康和疾病状态下的线粒体动力学提供高分辨率成像手段。

完整心脏中单个线粒体超氧闪光的共聚焦成像体内

探索更多视频

完整心脏中单个线粒体超氧闪光的共聚焦成像 体内

探索更多视频

完整心脏中单个线粒体超氧闪光的共聚焦成像体内