Name: 为检验新型抗病毒药物的鉴定对蓝舌病病毒 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-11T23:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 2 s
Description: 了解利用细胞病变效应（CPE）检测、剂量反应分析和时间添加实验来鉴定抗蓝舌病病毒（BTV）的新型小分子抗病毒药物的方法。该技术为抗病毒药物筛选提供了灵敏、稳健且可重复的实验框架。

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本项目由美国国立卫生研究院（NIH）向 Q. Li 提供的资助 1R03MH08127-01 和 7R03MH08127-02，以及阿拉巴马大学伯明翰分校（UAB）医学院的 IMPACT 基金资助。感谢 Molette 基金和奥本大学（Auburn University）提供的支持。我们还感谢 Ms. Pulin Che 和 Mr. Volodymyr Musiienko 在本研究过程中提供的技术协助。

1. 细胞、病毒与抗病毒化合物
<ol>
	<li>在含有5%胎牛血清（FCS）、100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中培养BSR细胞，该细胞系为幼仓鼠肾（BHK）细胞的衍生株10。</li>
	<li>对于全部三种检测，将细胞接种于含1% FCS、100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素的DMEM中，条件已如先前优化所述5。该培养基在三种检测中均称为检测培养基。</li>
	<li>将所有细胞置于37 °C、5% CO2及80–95%湿度的培养箱中孵育。</li>
	<li>按照先前所述方法对10型蓝舌病病毒（BTV-10）进行蚀斑纯化并扩增8。使用检测培养基将BTV-10稀释至各指定检测所需的浓度。</li>
	<li>将所有待测化合物溶于DMSO，配制成10 mM的储存液。将储存液保存于-20 °C。</li>
	<li>使用检测培养基将化合物稀释至各指定检测所需的浓度2。</li>
</ol>
2. 使用 CTG 试剂盒的基于 CPE 的检测
<ol>
	<li>使用 MicroFlo select 分配器将 BSR 细胞接种至 384 孔微孔板（黑色；规格为 16 × 24）中。每孔接种密度为 5,000 个细胞，接种体积为 20 μl，用于抗病毒效果分析。</li>
	<li>将细胞孵育 2–3 小时，直至细胞完全贴附于孔板表面。</li>
	<li>向每孔加入终浓度为 10 μM 的抗病毒化合物，并充分混匀。</li>
	<li>将 BTV 稀释至所需滴度，向每孔加入 5 μl BTV（指定 MOI）。对照孔中加入 5 μl 检测培养基。将感染后的细胞在 37 °C、5% CO2 及 80–95% 湿度条件下孵育 72 小时。</li>
	<li>在感染后 72 小时（72 h.p.i.），使用前将 CTG 缓冲液和冻干 CTG 底物解冻并平衡至室温。按照生产商说明书，将冻干的酶/底物与缓冲试剂混合，配制均一的 CTG 试剂溶液。</li>
	<li>将检测板在室温下平衡 15 分钟。</li>
	<li>通过分配器向每孔加入等体积（25 μl）的 CTG 试剂。在室温避光条件下孵育 15 分钟后，使用多功能酶标仪以 0.1 秒的积分时间测定发光信号。</li>
</ol>
3. 剂量-反应实验
<ol>
	<li>使用分液器将种子BSR细胞接种至384孔微孔板（黑色；16 × 24格式）中，用于抗病毒效力检测时每孔接种体积为20 μl，接种密度为5,000 个细胞/孔；用于细胞毒性检测时每孔接种体积为25 μl，接种密度为5,000 个细胞/孔。</li>
	<li>在 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育细胞 2–3 小时2 并在80-95%湿度下培养，直至细胞充分贴壁。</li>
	<li>在每种化合物的384孔板的四分之一区域内进行检测（相当于96孔板），如图所示 表1在单次实验中，每种浓度分配八个复孔。将第一列设为阳性对照，不添加化合物和病毒，最后一列（12th）作为阴性对照，仅加入病毒而不加化合物。</li>
	<li>将化合物用检测培养基稀释至 50 μM，并加入到 2nd 以每孔20 μl的量将化合物加入96孔板，用于抗病毒功效检测。使用八通道半自动移液器将化合物混匀五次，使其浓度达到25 μM。</li>
	<li>使用8通道半自动移液器，将20 μl混合液转移至2nd 柱到下一柱（3rd），充分混匀，配制成12.5 μM的浓度。随后从3中取出20 μl混合液，重复此过程rd 柱到下一柱（4th）以形成另一个两倍稀释，浓度为6.25 μM。重复此两倍系列稀释至第11孔th 柱。吸取并弃去11中混合物的20 μlth 加入并混匀化合物后的柱子。</li>
	<li>以 MOI 0.01 为基准，向第 2 至第 11 列的每孔中加入 BTV-10，每孔体积为 5 μl。加入病毒后，各列中化合物的终浓度应为：第 2 列 20 μM，第 3 列 10 μM，随后进行两倍系列稀释至第 11 列，终浓度为 0.04 μM。</li>
	<li>在第1列中加入5 μl培养基作为仅细胞对照（阳性），在第12列中每孔加入5 μl BTV作为仅BTV感染对照（阴性）。</li>
	<li>将化合物稀释至初始浓度为 200 μM，用于细胞毒性检测。同样，向第 2 列每孔加入 25 μl 化合物，并用八通道半自动移液器与培养基混合 5 次，使浓度达到 100 μM。不要加入 BTV。</li>
	<li>通过从第2列吸取25 μl至相邻的第3列，依次进行两倍系列稀释，直至最后一列（第12列）th）。在第12列中，混匀后吸取并弃去25 μl混合液。第2列的最终浓度应为100 μM，且第12列th 柱浓度应为 0.2 μM。第 1 列为仅细胞对照。</li>
	<li>在进行抗病毒效果和细胞毒性检测时，将培养板置于37 °C、5% CO₂条件下孵育。2 处理后在37°C、5% CO₂及80-95%湿度条件下培养72小时。按照上述方法（步骤2.5–2.7）使用CTG试剂盒检测细胞活力。</li>
</ol>
4. 加药时间（ToA）实验
<ol>
	<li>使用分液器将BSR细胞以每孔5,000个细胞、每孔15 μl的接种体积，接种至384孔微孔板（黑色；16 × 24格式）的第1至24列。</li>
	<li>针对每种化合物，在384孔板的一半区域使用全部24列，每个时间点设置八个重复孔（表2）。将第1列设为仅含细胞的对照组，每孔加入10 μl培养基；将第24列设为仅BTV感染对照组（阴性对照），每孔加入5 μl培养基和5 μl病毒（MOI为0.01），最终体积为每孔25 μl。</li>
	<li>选择第2至22列中的偶数列作为不同感染后时间点（h.p.i.）的抗病毒效果评估孔。在这些孔中，每孔加入5 μl BTV（MOI为0.01）感染细胞，并在不同的h.p.i.时间点每孔加入5 μl稀释后的化合物，使最终体积为25 μl/孔。对于标注的-2和-1 h.p.i.时间点，需在BTV感染前向BSR细胞中加入化合物；对于0 h.p.i.，则同时加入化合物和BTV。</li>
	<li>同时，将第3至23列中的奇数列设为仅含化合物的对照组，按指定时间点（-2、-1、0、1、2、4、8、16、24、48 h.p.i.）加入化合物。在这些孔中，每孔加入5 μl培养基和5 μl稀释后的化合物，最终体积为25 μl/孔。</li>
	<li>处理完成后，将细胞置于37 °C、5% CO2、湿度为80–95%的培养箱中孵育。</li>
	<li>在感染后72小时（72 h.p.i.）使用CellTiter-Glo试剂盒检测细胞活力，具体操作如前所述（实验步骤2.5–2.7）。</li>
</ol>
5. 数据分析
<ol>
	<li>首先使用基于多功能读数仪获得的发光信号的内部专用软件处理所有数据。确定每种处理的平均值（平均值）、标准偏差（STDEV）以及变异系数（CV），其中变异系数要求不超过10%。</li>
	<li>将上述软件处理后的数据导入生物统计与图形分析软件工具，进行非线性回归分析，以确定EC50和CC50的数值。</li>
</ol>

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<li>Kirchmair, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+anti-viral+agents+using+molecular+modeling+and+virtual+screening+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Disord.+Drug+Targets%22%5BJournal%5D)">Development of anti-viral agents using molecular modeling and virtual screening techniques.</a> Infect. Disord. Drug Targets. 11, 64-93 (2011).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

在抗病毒药物发现与开发的初期筛选阶段，一个关键步骤是建立稳健的检测方法，包括选择可量化的标志物、设计简便的实验流程、获得足够强的信号以及将变异系数控制在10%以下。由于筛选过程需要高度的可重复性，并可能涉及大量待测分子，大多数生化或基于细胞的筛选实验均以最稳健、简便且经济的检测方法为基础，以提供化学起点。基于细胞病变效应（CPE）的检测方法被指定用于满足这些要求，以从大规模化合物库中识别有效的候选分子。CPE是指病毒在培养细胞中增殖所引起的细胞不良反应。目前已有多种检测方法可通过测量不同标志物来评估CPE，这些标志物包括死亡细胞数量（细胞毒性）、活细胞数量（细胞活力）以及细胞死亡机制（凋亡）。市面上已有基于CPE检测的商用试剂，其配套实验流程简便。例如，CTG试剂盒包含单一组分 &#34;混合与测量&#34; 步骤，已广泛用于量化病毒诱导的细胞病变效应（CPE）。然而，基于CPE的检测方法仅适用于能够快速诱导CPE的病毒。对于不能快速诱导CPE的病毒，已开发出多种其他检测方法。例如，基于复制子的检测利用携带复制子的细胞系，可用于筛选病毒复制抑制剂，包括翻译、多聚蛋白加工以及负链和正链RNA合成的抑制剂12-14反义...

蓝舌病毒（BTV）是呼肠孤病毒科（Reoviridae）环状病毒属（Orbivirus）的代表种，是一种双链RNA病毒。BTV是影响绵羊、山羊、牛及其他家畜的重要疫病之一，每年在全球造成约30亿美元的经济损失1,2。外来型BTV血清型被列为美国农业部高影响性家畜病原体&#34;（USDA High Consequence Livestock Pathogens）&#34;。近年来，BTV在北欧多个国家重新出现，导致牛羊群中爆发大规模疫情3,4。由于其重要的经济意义以及作为研究模型的价值，BTV已受到广泛的分子、遗传和结构层面的研究，并已开发出多种疫苗。然而，由于缺乏适用于抗病毒药物筛选的合适检测方法，目前尚无针对BTV的抗病毒药物可用。
在最近一项以BTV为模型系统的高通量筛选（HTS）研究中，我们开发、优化并验证了一种基于细胞病变效应（CPE）的检测方法，用于鉴定针对节肢动物传播病毒的潜在广谱抗病毒药物5基于CPE的检测是一种公认的检测方法，已用于针对多种可诱导快速且可观察到的CPE/凋亡病毒的抗病毒药物发现。5-7在我们的系统中，感染BTV后，脊椎动物细胞（包括HeLa、BSR和HEK 293T）中可明显观察到细胞病变效应（CPE）。8BTV 引起的细胞病变效应（CPE）可通过多种细胞活力检测方法进行监测和定量，包括 CellTiter Glo 细胞活力检测试剂盒（CTG 试剂盒）9该试剂盒通过定量检测细胞内三磷酸腺苷（ATP）的含量来确定培养物中活细胞的数量，ATP的存在表明具有代谢活性的活细胞存在。在优化条件下，本研究所建立的基于细胞病变效应（CPE）的检测方法显示出其可行性 &#34;混合与测量&#34; 一步式操作方案，且具有稳定的发光信号和良好的灵活性。与此同时，该基于CPE的检测方法能够排除对细胞活力具有毒性的化合物。基于CPE的检测方法在针对蓝舌病毒（BTV）的抗病毒药物筛选中表现出良好的稳健性和可靠性，并已用于筛选美国国立卫生研究院分子库小分子化合物库（NIH Molecular Libraries Small Molecule Repository, MLSMR），成功鉴定出六个新的潜在抗病毒先导化合物簇5.
当通过基于细胞病变效应（CPE）的检测方法鉴定出潜在的抗病毒化合物后，需进一步进行十浓度梯度的剂量-反应实验，以确定其抗病毒活性范围及细胞毒性2。抗病毒效力以50%抑制浓度（IC50）或50%有效浓度（EC50）表示，即药物在基线与最大效应之间抑制病毒诱导CPE达到一半程度时的浓度。抗病毒药物的细胞毒性，i.e.&#160;即50%细胞毒性浓度（CC50），是指药物引起基线与最大效应之间50%细胞毒性的浓度。选择性指数（SI），记作50%选择性指数（SI50），由CC50/IC50计算得出，用于评估抗病毒化合物对病毒诱导CPE的特异性。IC50（或EC50）、CC50和SI50值是判断抗病毒化合物是否具有足够强效性和选择性以推进后续药物开发的关键指标。
当抗病毒药物未表现出明显毒性时 体外，但能阻止病毒诱导的细胞病变效应（CPE）和病毒的 productive 生命周期，因此阐明其作用机制（MoA）至关重要2我们首先通过时间进程分析（ToA）实验来开展此类表征，以确定抗病毒化合物所影响的病毒生命周期中的可能作用环节。通常，在病毒感染前或感染后不同时间点将抗病毒化合物加入细胞。若在病毒感染过程中，化合物在其靶向环节之后才被加入，则其抗病毒活性较在该环节之前加入时更低。因此，ToA研究对于确定化合物的抗病毒效力及其潜在作用靶点（无论是病毒生命周期中的环节，还是参与病毒生命周期的宿主细胞机制）至关重要。
在所有三项检测中，均按照制造商说明书使用CTG试剂盒测定细胞活力5。该检测系统可输出足够强度的发光信号，可利用多种内部软件进行分析。每项检测均经过验证，并至少以三组独立实验、每组八个复孔的方式进行。对所有获得的数据，均分析三个参数，包括平均值（AVE）、标准差（STDEV）和变异系数（CV），以评估检测的稳健性。在确定检测的稳健性后，将使用多种生物统计学与图形分析工具对数据进一步分析并作图2。

<table><tbody><tr><td>DMEM 培养基</td><td>Gibco</td><td>1134218</td><td>用于细胞培养</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>16000044</td><td>用于细胞培养</td></tr><tr><td>0.05% 胰蛋白酶-EDTA</td><td>Gibco</td><td>1000185</td><td>用于细胞培养</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gbico</td><td>1049769</td><td>用于细胞培养</td></tr><tr><td>CellTiter-Glo (CTG) 试剂盒</td><td>Promega</td><td>TB288</td><td>用于细胞活力检测</td></tr><tr><td>70% 乙醇</td><td>Fisher</td><td>S25309B</td><td>由 95% 稀释而成</td></tr><tr><td>抗病毒 huashilcompounds</td><td>NIH MLSMR 和全新合成</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BTV-10</td><td>ATCC</td><td>VR-187</td><td></td></tr><tr><td>BSR 细胞</td><td>本实验室研发</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Synergy-II 多功能微孔板读板仪</td><td>BioTek</td><td></td><td>用于化学发光信号读取</td></tr><tr><td>MicroFlo select 分液器</td><td>BioTek</td><td></td><td>用于添加细胞、病毒和试剂</td></tr><tr><td>384 孔平底微孔板</td><td>CORNING</td><td>28908031</td><td>用于细胞培养</td></tr><tr><td>Gen. 5 软件</td><td>BioTek</td><td></td><td>用于分析 Synergy-II 多功能微孔板读板仪的读数结果</td></tr><tr><td>GraphPad Prism 5</td><td>GraphPad</td><td>Version 5</td><td>用于生物统计分析和作图</td></tr></tbody></table>

检测针对蓝舌病毒新型抗病毒药物的实验方法

Assays for the Identification of Novel Antivirals against Bluetongue Virus

为鉴定针对蓝舌病毒（BTV）的潜在抗病毒药物，我们开发、优化并验证了此处介绍的三种检测方法。基于细胞病变效应（CPE）的检测法是首个用于评估化合物是否具有抗病毒活性的方法，并已被用于大规模化合物文库的筛选。同时，该CPE法也可用于评估抗病毒药物的细胞毒性。剂量-反应检测法旨在确定所选抗病毒药物的有效浓度范围， 即 50%抑制浓度（IC50）或有效浓度（EC50），以及其细胞毒性范围（CC50）。ToA检测被用于初步的作用机制研究，以确定新型抗病毒药物在BTV病毒生命周期中的作用靶点，或其对宿主细胞机制的可能影响。这些检测对于评估抗病毒药物在细胞培养系统中的功效至关重要，并已应用于我们近期的研究，助力鉴定出多种针对BTV的新型抗病毒化合物。

1. 化合物的抗病毒功效
基于细胞的CPE检测方法被开发、优化并验证 体外 使用基于荧光素酶的CTG试剂盒鉴定针对BTV的新型抗病毒药物，方法如前所述2,5采用十剂量反应检测法，通过定量测定培养物中活细胞内的ATP含量来反映已鉴定先导化合物的抗病毒活性及细胞毒性，从而评估代谢活跃细胞的数量。5,11在我们之前的研究报告中，评估了多种潜在的抗病毒化合物，包括通过高通量筛选针对BTV鉴定出的各个簇中的化合物5及其衍生物通过 从头合成 合成2. 根据其EC50，CC50 和 SI50，鉴定出若干具有良好前景的先导化合物，具有强效的抗病毒活性、低毒性和高选择性。例如，化合物052（C052）被证实其EC50 0.27±0.12 μM图1)2 以及一个CC50 82.69 μM，两者在非线性回归分析中均呈现典型的...

已开发、优化、验证并应用了三种检测方法，包括基于细胞病变效应（CPE）的检测、剂量-反应检测和加药时间（ToA）检测，用于筛选针对蓝舌病毒（BTV）的新型抗病毒药物，并确定新发现抗病毒药物可能的作用机制（MoA）。

为鉴定针对BTV的潜在抗病毒药物，我们开发、优化并验证了此处介绍的三种检测方法。基于细胞病变效应（CPE）的检测是第一种……

本实验的总体目标是利用基于细胞病变效应（CPE）的细胞活力检测方法，鉴定和表征针对蓝舌病毒（BTV）的小分子抗病毒药物。首先，使用细胞滴度检测试剂（Cell Titer Glow）基于细胞病变效应（CPE）的检测方法，对一组抗病毒化合物文库进行初筛。随后，通过剂量反应实验验证所选化合物的抗病毒效果，并评估其细胞毒性。最后，通过加药时间实验来确定所选抗病毒药物可能作用的病毒生命周期阶段，从而推断其可能的作用机制。最终，结合剂量反应实验和加药时间实验，可以获得结果，显示出具有强效抗病毒CIE活性且细胞毒性较低的新型抗病毒药物。因此，与传统的如空斑实验中的TCI D50实验相比，该技术的主要优势在于，它提供了一种灵敏、稳健且高度可重复的定量方法，可用于筛选和分类针对特定病毒（包括可诱导感染细胞产生可测细胞病变效应（CPE）的病毒，如谷胶病毒）的抗病毒药物。在开展基于CPE的实验前，使用补充DMEM培养基培养的BSR细胞，采用微流量选择分配器，将20 µL细胞悬液（每孔5,000个细胞）接种至384孔板中。将细胞在微孔板中孵育2至3小时，使其充分贴壁，然后向每孔加入终浓度为10 µM的抗病毒化合物，并充分混匀。用检测培养基将经蚀斑纯化并扩增的BTV稀释至所需滴度，并向对照孔中加入5 µL BTV（指定MOI）。向其他孔加入5 µL检测培养基，将含有检测板的湿盒放入培养箱，在37°C、5% CO₂及80%至95%湿度条件下孵育感染细胞72小时。然后将检测板从培养箱中取出，接着将CTG缓冲液和冻干CTG底物解冻并平衡至室温。根据生产商说明书，通过混合冻干的酶底物与缓冲试剂，重新配制均一的CTG试剂溶液。将检测板在室温下平衡15分钟后，使用分配器向每孔加入25 µL CTG试剂，在避光条件下孵育15分钟，随后使用积分时间为0.1秒的多功能酶标仪检测发光信号。在384孔微孔板中，每孔接种5,000个BSR细胞用于剂量反应实验，抗病毒效力实验每孔使用20 µL，细胞毒性实验每孔使用25 µL。经过两到三小时的孵育后，每种化合物浓度在每次检测中分配八个复孔，如图所示。将第一列设为阳性对照，不添加化合物或病毒；在抗病毒效力检测中，将最后一列设为阴性对照，仅添加病毒。用检测培养基将化合物稀释至50微摩尔，并向第二列每孔加入20微升。使用八通道半自动移液器操作。将化合物混合五次，使其浓度达到25 µM。接着将第二列中的20 µL混合液转移至第三列，充分混匀，得到12.5 µM的浓度。重复此两倍稀释步骤两次。进行连续稀释至第11列，最终浓度为0.04微摩尔。然后向第1列每孔加入5微升培养基，作为细胞阳性对照；向第12列每孔加入5微升BTV，作为仅BTV感染对照。在第2列至第11列的每孔中加入5微升BTV，作为阴性对照用于细胞毒性检测，并将化合物稀释至初始浓度为200微摩尔。向第二列每孔

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科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

为检验新型抗病毒药物的鉴定对蓝舌病病毒

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使用通用抗体通过简易槽印迹法对所有A型流感病毒血凝素和神经氨酸酶进行定量分析

本文介绍了一种用于研究病毒进入特定步骤的实验方案，以鉴定和评估新型抗病毒药物。...

早期病毒进入检测法用于抗病毒化合物的鉴定与评价

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一种用于检测丽沙病毒的通用巢式逆转录聚合酶链式反应的评估

本文介绍一种间接ELISA夹心免疫捕获法，用于测定狂犬病疫苗中免疫原性糖蛋白的含量。该检测方法采用一种可识别糖蛋白三聚体的中和性单克隆抗体（mAb-D1），可作为体内NIH试验的替代方法，用于在生产过程中监测疫苗效力的一致性。...

体外ELISA检测法评估狂犬病疫苗效价

这种使用双链DNA嵌 intercalating...

泛丽沙病毒实时逆转录聚合酶链式反应用于狂犬病诊断

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利用病毒进入检测与分子对接分析鉴定柯萨奇病毒A16型抗病毒候选药物

我们提供了一套完整的现场条件下动物狂犬病死后诊断方案，采用快速免疫层析诊断试验（RIDT），从脑组织活检取样到最终结果判读。我们还描述了该设备在分子分析和病毒基因分型中的进一步应用。...

适用于资源有限地区的现场尸体解剖后狂犬病快速免疫层析诊断检测及后续分子应用

在本研究中，我们描述了基于复制子和病毒酶的检测方法所采用的实验方案，用于以高通量筛选形式筛选寨卡病毒复制的抑制剂。...

高通量抗病毒检测用于筛选寨卡病毒复制抑制剂

本文介绍了利用荧光素酶报告系统制备SARS-CoV-2假病毒颗粒的方法及其在筛选病毒进入抑制剂中的应用。本方案以两种不同的进入抑制剂为例进行演示：重组人ACE2-Fc融合蛋白和小分子化合物阿比多尔。...

使用基于MLV的假病毒鉴定SARS-CoV-2进入抑制剂作为潜在抗病毒药物的实验方案

了解利用细胞病变效应（CPE）检测、剂量反应分析和时间添加实验来鉴定抗蓝舌病病毒（BTV）的新型小分子抗病毒药物的方法。该技术为抗病毒药物筛选提供了灵敏、稳健且可重复的实验框架。

检测针对蓝舌病毒新型抗病毒药物的实验方法

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