为检验新型抗病毒药物的鉴定对蓝舌病病毒

该程序的总体目标是使用基于 CPE 的细胞活力测定法鉴定和表征针对蓝舌病毒或 BTV 的小分子抗病毒药物。这是通过首先使用细胞滴度辉光试剂使用细胞病变效应或基于 CPE 的测定来筛选抗病毒化合物库来实现的。接下来，确认抗病毒疗效，并使用剂量反应测定法评估所选抗病毒药物的细胞毒性。

最后，进行添加测定以确定所选抗病毒药物可能的病毒生命周期阶段，从而导致可能的作用机制。最终，根据剂量反应测定和添加测定时间，可以获得显示具有有效抗病毒 CIE 和低细胞毒性的新型抗病毒药物的结果。因此，与现有方法（如噬菌斑测定中的 TCI D 50 测定）相比，该技术的主要优点是，该技术在可测量的方法中提供了一种敏感、稳健且高度繁殖的病毒，以筛选和分类针对某些病毒的病毒，包括麸质病毒，它在受感染的细胞中诱导可测量的 CP 细胞准备来自维持在补充 DMEM 中的 BSR 细胞的基于 CPE 的测定，使用微流选择分配器来以每孔 5， 000 个细胞的速度将 20 微升细胞接种到 384 中。

孔微孔板将细胞孵育 2 到 3 小时，使其完全粘附在板上，然后向每个孔中加入终浓度为 10 微摩尔的抗病毒化合物并完全混合。使用检测培养基将纯化并繁殖的 BTV 的噬菌斑稀释至所需的滴度，并向每个孔中加入 5 微升 BTV，其中标有 MOI，用于对照。加入 5 微升检测培养基，将装有检测板的湿盒放入培养箱中，并在 37 摄氏度、5% 二氧化碳和 80% 至 95% 湿度下孵育感染细胞 72 小时。

然后从培养箱中取出检测板，然后解冻并平衡 CTG 缓冲液和冻干的 CTG 底物至室温。然后根据制造商的说明，通过混合冻干酶底物和缓冲试剂来重构均质的 CTG 试剂溶液。将检测板平衡至室温 15 分钟后，使用分配器向每个孔中加入 25 微升 CTG 试剂，在黑暗中孵育 15 分钟，然后使用积分时间为 0.1 秒的多功能读数仪测量发光信号，在 384 孔微孔板中接种 5， 000 个 BSR 细胞/孔，用于剂量反应测定，使用 20 微升进行抗病毒功效测定，使用 25 微升进行抗病毒功效测定，使用 25 微升进行细胞毒性测定。

孵育 2 到 3 小时后，每次测定为每种浓度的化合物分配 8 个重复，如下所示。将第一列指定为阳性对照，不添加化合物或病毒，将最后一列指定为阴性对照，仅添加病毒用于抗病毒功效测定，在测定培养基中将化合物稀释至 50 微摩尔，向第二列添加 20 μL/孔。使用八通道半自动移液器。

将化合物混合 5 次至浓度为 25 微摩尔。接下来，将第二列中的 20 微升混合物转移到第三列中并充分混合，得到 12.5 微摩尔的浓度。重复此作两次。

连续稀释至第 11 根色谱柱，其最终浓度为 0.04 微摩尔。然后向第 1 列添加 5 微升培养基作为仅细胞阳性对照，向第 12 列每孔添加 5 微升 BTV 作为仅作为 BTV 感染。阴性对照从第 2 列到第 11 列每孔添加 5 微升 BTV 用于细胞毒性测定，将化合物稀释至 200 微摩尔的初始浓度。

将每孔化合物 25 微升添加到第 2 列中，混合 5 次，使浓度达到 100 微摩尔。通过将 25 μL 从第 2 列转移到相邻的第 3 列，并继续通过第 12 列进行双重系列稀释。混合第 12 列后，吸出并丢弃 25 μL 混合物。

第一列是抗病毒和细胞毒性测定的仅细胞对照。将装有检测板的湿盒放入培养箱中 72 小时，然后将板取出。然后使用 CT G 试剂盒测量细胞活力。

使用生物统计学和图形软件计算每种化合物浓度的平均值、标准差、系数变化和细胞活力百分比，并进行非线性回归分析以确定每种化合物的 EC 50 和 CC 50。通过在 384 的第 1 列至第 24 列中将 5， 000 个细胞/孔接种在 15 μL 中，为添加或 TOA 测定时间做准备。每种化合物的孔微孔板。

利用所有 24 个色谱柱，每个时间点重复 8 个。通过每孔添加 10 微升的测定培养基，将第 1 列指定为仅细胞对照，将第 24 列标记为仅 BTV 感染。通过每孔添加 5 μL 的检测培养基和每孔 5 μL 的病毒，MOI 为 0.01 进行阴性对照。

在每孔 25 微升的最终体积中，选择从第 2 列到第 22 列的偶数列作为感染后不同时间的抗病毒功效评价柱或这些列中的 HPI，用每孔 5 微升的 BTV 感染细胞，在不同 HPI 下以 0.01 的 MOI 感染细胞，每孔还加入 5 微升稀释化合物，最终体积为每孔 25 微升，表示为负 2 和减去 1 HPI。在 BTV 感染之前将化合物添加到 BSR 细胞中以实现零 HPI，同时将化合物和 BTV 添加到培养物中。同时，将 3 到 23 的奇数列指定为对应于这些列中不同时间点的仅复合对照。

每孔添加 5 微升检测培养基和每孔 5 微升稀释化合物，最终体积为每孔 25 微升。在培养箱中将细胞孵育至 72 HPI 后，取出检测板并使用细胞滴度辉光试剂盒测定细胞活力。最后，使用处理通过多模式阅读器获得的发光信号的软件来确定平均值。

使用 CPE 测定定量活细胞中细胞 A TP 的每次处理的 S-T-D-E-V CV 和保护细胞活力百分比，我们之前确定了几种有前途的先导化合物，这些化合物具有有效的抗病毒功效、低毒性和高选择性。例如，化合物 0 5 2 的 EC 50 为 0.27 正负 0.12 微摩尔，CC 50 为 82.69 微摩尔，均显示出典型的回归曲线。在非线性回归分析下，确定 C 0 5 2 的 SI 50,306 基于其 EC 50 和 CC 50 值纳米摩尔尺度抗病毒功效、低毒性，因此高 SI 50 表明 C 0 5 2 可能是一种针对 BTV 的有效和选择性抗病毒药物，如图所示， 在 10 种不同浓度的 C 0 5 2 存在下，用 MOI 为 0.01 的 BTV 感染细胞，并在 72 HPI 下测定细胞活力。

使用 CTG 试剂盒，每个数据点代表来自五个重复的平均值和 SD。TOA 测定用于确定化合物靶向的病毒生命周期的可能阶段。当在 BTV 感染前 1 或 2 小时加入 C 0 5 2 时，抗病毒功效保持在纳摩尔尺度，如图所示。

此外，当在 32 和 48 HPI 时添加 C 0 5 2 时，细胞活力进一步降低，表明 C 0 5 2 可能在病毒生命周期的早期阶段（例如病毒进入）之后起作用。由于 BTV 病毒复制的第一个周期通常在 24 HPI 内的受感染细胞中完成，我们的结果表明 C 0 5 2 可能起作用于 BTV 病毒生命周期的后期，例如病毒复制、包装、成熟和出口。同时，C 0 5 2 也有可能作用于在病毒生命周期后期发挥作用的宿主细胞机制。

看完这个视频后，您应该对如何利用 CPE 最佳论文来识别和分类针对感染后诱导可测量 CPE 的病毒的潜在防病毒软件有一个很好的了解。