切片培养法用于观察牙胚在器官培养中的发育过程

以下实验的总体目标是观察牙齿在数天内的发育过程。通过体外器官培养技术，首先分离胎鼠正在发育的下颌，将其制备成活体组织切片，以暴露正在发育的牙胚，此为第二步。随后选取切片，置于培养基上方的滤膜上进行孵育，以支持其继续发育。

接下来的切片使用谱系示踪剂进行标记，以追踪培养期间细胞的移动情况，获得的结果显示了牙组织在离体培养过程中发育时的动态特性。与传统器官块培养技术相比，该方法的主要优势在于能够在整个发育过程中观察到牙齿胚等内部发育器官在周围组织环境中的发育情况。该方法的可视化演示至关重要，因为如果仪器设置或组织方向不准确，切割和选择步骤可能会变得困难。

首先，通过向500毫升的高级ECCOs改良Eagle F12培养基中添加1%谷氨酸和1%青霉素-链霉素，制备用于胚胎器官的解剖和培养介质。然后，按照高桥Sumi在视频文章中所述的方法，解剖发育阶段为E11.5至E15.5的小鼠胚胎，并将其放入含有新鲜培养基的培养皿中。接下来，使用新磨制的无菌钨针切除胚胎头部，并将头部转移至冰上预冷的新鲜培养基培养皿中。

然后用针插入口腔，暂时向头部后方切割，从头部分离下颌骨。在切片前，将分离的下颌骨置于预冷的培养基中并放在冰上保存。在切取下颌骨组织前，用70%乙醇清洁组织切片机的固定盘和刀片，并确保刀片与固定盘表面齐平。

当刀片使用后出现下落情况时，大约切割200个下颌骨后需要更换刀片；根据样本的发育年龄，将切片厚度设置在200至400微米之间。若需要获取E14.5胚胎的完整牙胚用于实验，且需分离牙胚，则采用250微米的切片厚度。接下来，将一个下颌骨转移至塑料包埋盘上，并调整其位置，使发育中的舌体处于前横位。在分离切牙以解剖磨牙时，需沿下颌骨进行矢状切面切片。

正确放置后，用滤纸吸去组织周围的过量培养基。通过滤纸轻微按压下颌骨，使其固定在载片上。用滤纸干燥后，立即将载片置于切片机的圆形不锈钢台面上。

然后将刀片力度调至最大，打开机器并按下启动按钮。工作台会自动从左向右移动，同时带动刀片的切削臂以每分钟高达200次的频率上下往复运动进行切割。待组织完全切片后，关闭机器。

确保刀片臂处于抬起位置，然后取下刀盘。切勿将手指置于刀片臂下方，或无人看管设备。切碎组织时，取下固定刀盘后应立即向刀盘上的组织切片添加培养基，以防止切片过度干燥。

然后使用钨针或移液器小心地将组织切片从培养皿底部剥离，并将其移至盛有培养基的小培养皿中。接着，在体视显微镜下用针将各个切片分开，挑选出包含目标区域的组织切片。将选好的切片置于含有新鲜培养基的培养皿中，并通过裁剪不锈钢平纹织网片制备培养系统用的金属网格，每条网格尺寸为4厘米×1.5厘米。

然后使用标准的办公打孔器在中心打一个孔，并弯曲边缘，使网格能够平整地覆盖在中央孔上，并与培养皿底部平行。网格成型后，在使用前需通过高压灭菌器进行灭菌处理。接下来，通过向外围孔中加入两毫升高压灭菌水，以防止脱水，从而完成中央孔器官培养皿的培养前准备。

然后将一个无菌的金属网格置于培养皿中央。剪取一片孔径为0.4微米的透明聚对苯二甲酸乙二醇酯膜，使其足够大以覆盖网格上的孔。若需进行谱系示踪，则将剪好的膜与选定的下颌骨切片一同放入培养皿中。

首先，使用拉针仪将玻璃毛细管拉制成玻璃毛细针。随后折断针尖，并将针尖朝下插入亲脂性染料溶液（如DiI染料或DiO染料）中，通过毛细作用吸入少量染料溶液。数分钟后，将充满染料的毛细针放入针持中，并连接至口控吸管器。

将针尖置于培养基中，使其接触需要标记的区域，例如此处所示的牙囊。然后将少量染料释放到组织上。接着，将切片转移至荧光显微镜载物台上，检查切片是否成功标记。

标记成功后，小心地将切片提起并置于膜上，然后将膜连同居中展平的切片一起转移至培养基外。接着，将滤膜覆盖在网格中央的圆形孔上，向孔中加入约一毫升培养基，直至液面高度与膜齐平。此时，向培养基中加入所需的蛋白质或小分子抑制剂。

同时，使用体视显微镜对切片进行成像，以记录第0天的形态学特征，拍摄时应从下方提供光源以获得最佳图像效果。将培养皿置于37摄氏度、5%二氧化碳的湿润环境中培养，并每两到三天定期更换培养基。持续对培养物进行成像，以追踪其发育进展。

此处展示的是一系列图像，记录了第一磨牙牙囊的发育过程，该牙囊使用染料眼荧光染色剂进行标记。该切片为小鼠在胚胎14.5天（E 14.5）时从下颌获取的250微米厚的冠状切片。以黑点勾勒出的牙齿在第0天时处于帽状期。

到第四天，牙胚已达到钟状期，牙囊细胞可见围绕正在发育的外釉质呈弧形分布。上皮组织一旦掌握，该技术可从胚胎到最终培养在三小时内完成。观看本视频后，您应能充分理解如何在体外培养中成功观察器官的发育过程。