Name: 切片培养法继牙胚在植文化的发展 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-13T20:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: 学习利用组织切片培养法在胎儿小鼠下颌骨中培养牙胚，实现谱系追踪和实时观察牙齿发育动态。该方法优于传统外植体培养，为发育生物学研究提供全新视角。

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Sarah A. Alfaqeeh 由沙特阿拉伯王国高等教育 Ministry、沙特国王大学牙科学院资助。

1. 实验准备
<ol>
	<li>使用磨刀石（以矿物油润滑）磨利解剖器械，并在使用前通过70%乙醇喷雾和干热灭菌法进行消毒。使用12 V电源在2 M氢氧化钠溶液中通过电解法磨利解剖针。</li>
	<li>准备用于胚胎器官解剖和培养的培养基，该培养基由添加了1% GlutaMAX&#160;和1%青霉素-链霉素的Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium F12（DMEM F12）组成。</li>
</ol>
2. 胚胎解剖
<ol>
	<li>按照英国政府或其他主管机构批准的计划一方法，处死一只定时交配的怀孕雌性动物。剥离下腹部周围的皮肤，并用剪刀切开腹部。找到在下腹中线处相连的两个子宫角。</li>
	<li>取出子宫并置于装有培养基的离心管中，置于冰上。组织在冰上可保存数小时。</li>
	<li>将子宫取出，放入含有培养基的培养皿中，并置于显微镜下。尽可能在层流罩内进行胚胎解剖操作，以最大限度减少污染。</li>
	<li>从子宫中分离出胚胎，并去除其胚外组织。</li>
	<li>使用钨针切除胚胎头部，并将头部分离转移至含有新鲜培养基的新培养皿中。</li>
	<li>将针插入口腔内，向头后部切割，从而从头部分离下颌骨（图1A和&#160;1B）。分离后的下颌骨可在冰上的培养基中暂时保存，等待后续切片处理。</li>
	<li>对于完整下颌骨切片，E11.5–E15.5阶段最适合牙胚培养。E15.5之后，下颌骨内发育中的骨组织过于坚硬，难以切片。虽然仍可制备牙体切片，但在切片前必须先通过解剖去除骨组织（齿骨及正在形成的牙槽骨）9。使用钨针和镊子小心去除骨组织。</li>
</ol>
3. 胚胎切片
<ol>
	<li>使用标准的台式组织切片机准备下颌组织切片（图1C）。每处理约200个下颌样本后应更换新刀片，并确保刀片落下时与安装盘表面齐平。</li>
	<li>使用前用70%乙醇清洁安装盘和刀片。操作仪器时务必小心，因为刀片非常锋利。</li>
	<li>根据样本的发育年龄以及是否需要完整的牙胚，将切片机的切片距离设置为200–400 μm之间。将刀片力度调至最大。</li>
	<li>使用移液器或镊子将下颌样本转移至塑料安装盘上。在盘上摆放下颌时，需确保其方向清晰可辨。发育中的舌体可作为判断方向的有用解剖标志。对于磨牙，采用额面/横断面方向（见图1B中的切片平面）；对于切牙，则采用通过下颌的矢状面切片，以反映这些牙齿在生长过程中的不同取向（见图2A中的切片平面）。</li>
	<li>用滤纸吸除组织周围的多余培养基，使下颌样本在安装盘上轻微干燥。</li>
	<li>干燥后立即把安装盘放置在切片机的圆形不锈钢平台上。打开机器并按下启动键。平台会自动从左向右移动，同时携带刀片的切片臂以最高达200次/分钟的频率上下往复运动进行切片。</li>
	<li>当组织完全被切片后，关闭机器。确保刀片臂处于抬起位置后再取出安装盘。切片过程中切勿将手指置于刀片臂下方，也不得无人看管运行中的机器。</li>
	<li>取下安装盘后，立即向盘上的切片加入培养基，以防止组织过度干燥。使用钨针小心地将切下的组织从盘底剥离，然后用移液器转移至盛有培养基的小型培养皿中（图2A）。</li>
	<li>用针将切片分开，在体视显微镜下挑选含有目标组织的切片（图1D、1E&#160;和2B）。将选好的切片置于含新鲜培养基的培养皿中。</li>
</ol>
4. 切片培养
<ol>
	<li>通过向培养皿外周加入约 2 ml 经高压灭菌的水以防止脱水，并将金属网格置于培养皿中央，准备好中央小室的器官培养皿用于培养（图 3A 和 3B）。</li>
	<li>通过从不锈钢网片上裁剪出约 4 cm × 1.5 cm 的条状物制备金属网格&#160;。使用打孔器在条带中央打孔，并将两侧弯曲形成交错的末端。网格应平整地横跨中央小室，与培养皿底部平行（图 3A 和 3B）。使用前对网格进行高压灭菌以实现灭菌。</li>
	<li>裁剪一块足够大的透明聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）膜（孔径 0.4 μm），以覆盖网格中的孔洞。将裁剪好的膜放入含有选定组织切片的培养皿中。</li>
	<li>将切片置于膜的上方，然后小心地将膜从培养基中提起，使切片平整地位于中央。</li>
	<li>将滤膜放置在网格上，覆盖中央的圆形孔洞，并向小室中加入约 1 ml 培养基，使液面达到膜的水平。</li>
	<li>如需进行干预操作，可在培养基中添加蛋白质或小分子抑制剂（例如8）。</li>
	<li>在培养第 0 天拍摄切片图像，以记录其形态学特征。</li>
	<li>将培养皿置于 37 °C、5% CO2 的湿润化培养箱中进行培养。</li>
	<li>在平均约 7 天的培养期间定期拍摄培养物图像。每 48–72 小时更换一次培养基。拍摄时使用底部光源观察切片（图 2C–E）。</li>
</ol>
5. 谱系示踪
如果需要进行谱系示踪，可在第4步切片培养之前将脂溶性染料（如DiI或DiO）注入牙胚中。
<ol>
	<li>使用拉针仪拉制玻璃毛细管针头。</li>
	<li>用镊子折断针尖，将针尖朝下放入染料溶液中。静置数分钟，使染料通过毛细作用充满针尖。</li>
	<li>将充满染料的针头插入持针器，并通过导管连接至注射器或口吸装置。</li>
	<li>将针尖置于培养液中，接触待标记的脑片区域。施加气压，将少量染料从针头推出并沉积到组织上。</li>
	<li>移除针头，并在荧光下检查标记情况。</li>
	<li>标记成功的脑片可转移至滤膜上，按步骤4所述进行培养。</li>
</ol>

<ol><li>Rothova, M., Peterkova, R., Tucker, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+map+of+the+dental+mesenchyme%3A+dynamic+development+of+the+dental+papilla+and+follicle%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Fate map of the dental mesenchyme: dynamic development of the dental papilla and follicle.</a> Developmental biology. 366, 244-254 (2012).</li>
<li>Ferguson, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activin+is+an+essential+early+mesenchymal+signal+in+tooth+development+that+is+required+for+patterning+of+the+murine+dentition%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+development%22%5BJournal%5D)">Activin is an essential early mesenchymal signal in tooth development that is required for patterning of the murine dentition.</a> Genes & development. 12, 2636-2649 (1998).</li>
<li>Trowell, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+culture+of+mature+organs+in+a+synthetic+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+cell+research%22%5BJournal%5D)">The culture of mature organs in a synthetic medium.</a> Experimental cell research. 16, 118-147 (1959).</li>
<li>Matalova, E., Antonarakis, G. S., Sharpe, P. T., Tucker, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lineage+of+primary+and+secondary+enamel+knots%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+dynamics+%3A+an+official+publication+of+the+American+Association+of+Anatomists%22%5BJournal%5D)">Cell lineage of primary and secondary enamel knots.</a> Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 233, 754-759 (2005).</li>
<li>Mitsiadis, T. A., Tucker, A. S., De Bari, C., Cobourne, M. T., Rice, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+regulatory+relationship+between+Tbx1+and+FGF+signaling+during+tooth+morphogenesis+and+ameloblast+lineage+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">A regulatory relationship between Tbx1 and FGF signaling during tooth morphogenesis and ameloblast lineage determination.</a> Developmental biology. 320, 39-48 (2008).</li>
<li>Diep, L., Matalova, E., Mitsiadis, T. A., Tucker, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+the+tooth+bud+mesenchyme+to+alveolar+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+experimental+zoology.+Part+B%2C+Molecular%22%5BJournal%5D)">Contribution of the tooth bud mesenchyme to alveolar bone.</a> Journal of experimental zoology. Part B, Molecular. 312B, 510-517 (2009).</li>
<li>Rothova, M., Feng, J., Sharpe, P. T., Peterkova, R., Tucker, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+mesoderm+to+the+developing+dental+papilla%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+journal+of+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Contribution of mesoderm to the developing dental papilla.</a> The International journal of developmental biology. 55, 59-64 (2011).</li>
<li>Buchtova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation+and+patterning+of+the+snake+dentition+are+dependent+on+Sonic+hedgehog+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Initiation and patterning of the snake dentition are dependent on Sonic hedgehog signaling.</a> Developmental biology. 319, 132-145 (2008).</li>
<li>Buchtova, M., Stembirek, J., Glocova, K., Matalova, E., Tucker, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+regression+of+the+dental+lamina+underlies+the+development+of+diphyodont+dentitions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+dental+research%22%5BJournal%5D)">Early regression of the dental lamina underlies the development of diphyodont dentitions.</a> Journal of dental research. 91, 491-498 (2012).</li>
<li>Cho, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+primary+enamel+knot+determines+the+position+of+the+first+buccal+cusp+in+developing+mice+molars%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%3B+research+in+biological+diversity%22%5BJournal%5D)">The primary enamel knot determines the position of the first buccal cusp in developing mice molars.</a> Differentiation; research in biological diversity. 75, 441-451 (2007).</li>
<li>Sakano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+dynamics+in+cervical+loop+epithelium+during+transition+from+crown+to+root%3A+implications+for+Hertwig%27s+epithelial+root+sheath+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+periodontal+research%22%5BJournal%5D)">Cell dynamics in cervical loop epithelium during transition from crown to root: implications for Hertwig's epithelial root sheath formation.</a> Journal of periodontal research. , (2012).</li>
<li>Fisher, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+development+in+vitro+of+the+whole+and+halved+lower+molar+tooth+germ+of+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+oral+biology%22%5BJournal%5D)">Morphological development in vitro of the whole and halved lower molar tooth germ of the mouse.</a> Archives of oral biology. 16, 1481-1496 (1971).</li>
<li>Coin, R., Schmitt, R., Lesot, H., Vonesch, J. L., Ruch, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+halved+embryonic+lower+first+mouse+molars%3A+correlation+with+the+distribution+pattern+of+non+dividing+IDE+cells%2C+the+putative+organizers+of+morphogenetic+units%2C+the+cusps%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+journal+of+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Regeneration of halved embryonic lower first mouse molars: correlation with the distribution pattern of non dividing IDE cells, the putative organizers of morphogenetic units, the cusps.</a> The International journal of developmental biology. 44, 289-295 (2000).</li>
<li>Kavanagh, K. D., Evans, A. R., Jernvall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+evolutionary+patterns+of+mammalian+teeth+from+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Predicting evolutionary patterns of mammalian teeth from development.</a> Nature. 449, 427-432 (2007).</li>
<li>Munne, P. M., Tummers, M., Jarvinen, E., Thesleff, I., Jernvall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tinkering+with+the+inductive+mesenchyme%3A+Sostdc1+uncovers+the+role+of+dental+mesenchyme+in+limiting+tooth+induction%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Tinkering with the inductive mesenchyme: Sostdc1 uncovers the role of dental mesenchyme in limiting tooth induction.</a> Development. 136, 393-402 (2009).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

这种牙齿培养方法的优点在于能够很好地接触到牙胚，从而可以精确地进行谱系示踪，并将微珠准确放置于上皮组织或间充质中。因此，在培养过程中可特异性地靶向发育中牙胚的特定区域。在培养期间，可连续观察牙胚形态的动态变化，并快速评估各种干预操作的效果。
然而，该方法仅适用于硬组织（如牙本质和牙釉质）大量形成之前的年轻牙胚，因为这些硬组织无法被准确切碎。对于胚胎15.5天（E15.5）后的下颌骨，必须在切碎前去除骨组织。这种方法的缺点是可能损伤牙胚，因为从E16.5开始牙胚与骨组织紧密相连。我们已成功对分离的牙胚进行切片，最晚至出生后第4天；此后由于牙釉质的沉积，牙齿变得过于坚硬，无法被切片机切割。该切片方法在E13.5时期的牙胚上效果良好。 即 芽期1,6在此时间点之前，当牙齿处于上皮增厚阶段时，牙胚虽能发育，但成功率降低，且长期来看形态可能受到影响。
该方法的一个主要缺点是切片在牙齿中的切割位置是随机的。在某些切片中，整个牙胚会完整地位于一个切片内，而在另一些切片中，切片器可能会将牙胚从中间切断。...

对于许多实验而言，能够培养组织至关重要 离体 以观察发育过程。通过培养发育中的组织，可在发育的特定时期进行取样，并可通过向培养基中添加因子或加载因子的微珠，以及通过转染和电穿孔技术，实现对基因的操控。1对于许多实验而言，能够观察组织在生长过程中的变化至关重要，例如追踪谱系标记细胞在组织形态发生过程中的命运。对于在胚胎内部深层发育的组织，这一需求尤其具有挑战性，因为当胚胎组织块被培养时，这些深层结构并不明显。牙齿便是一个典型例子，其发育发生在下颌骨、上颌骨以及额鼻突内。当整体培养下颌骨时，仅能观察到牙齿的表层结构，而形态学上的变化只能通过对固定后的组织切片进行分析才能获得。2我们改进了一种活体组织切片培养技术，可实现对牙胚发育过程的连续观察，并在发育过程中方便地接触牙体的各个部分。该技术采用改良的特罗韦尔（Trowell）方法，将牙胚组织切片置于气液界面进行培养。3这些切片培养物在直接观察牙齿形态发生过程以及追踪不同组分（如釉结节、牙乳头和牙囊）的谱系方面非常有用。1,4-7该技术不仅限于小鼠胚胎，已成功用于培养猪和蛇牙齿组织的活体切片8,9除了能够直观观察牙齿发育过程外，切片法还具有组织切片较薄、可更充分接触培养基中的营养物质以及培养箱中的气体的优势。这有助于牙胚生长得到改善，使其发育状况与实际情况相符 体内，并显示内皮细胞侵入乳头7相比之下，下颌骨整体培养中的牙胚发育速度较慢 体内 长期培养中，培养物中心常出现坏死。在组织切片培养中，牙齿在下颌骨切片内发育，可监测其与周围发育中的骨组织及其他组织的相互作用。在本方法中，组织在解剖后直接切碎，无需包埋于支撑介质中。10,11&#160;无需使用任何系统将组织固定在切块板上。因此，该方法具有非侵入性和快速的特点，可在一次操作中对多个下颌骨进行切片。

<table><tbody><tr><td>乙醇</td><td>VWR</td><td>101077Y</td><td>将100%乙醇用蒸馏H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O稀释至70%。</td></tr><tr><td>DMEM F12</td><td>Gibco</td><td>12634-010</td><td>高级DMEM/F12培养基（Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium F12）</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Sigma</td><td>P0781</td><td></td></tr><tr><td>DiI（Molecular probes）</td><td>Vybrant</td><td>V-22885</td><td>细胞标记溶液</td></tr><tr><td></td><td>Invitrogen</td><td></td><td>细胞示踪剂 CM-DiI，C-7000</td></tr><tr><td>DiO（Molecular probes）</td><td>Vybrant</td><td>V22886</td><td></td></tr><tr><td>Geminator 500</td><td>Thomas</td><td>Thomas No. 3885A20</td><td>干热灭菌器</td></tr><tr><td>McIlwain组织切片机</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>10180</td><td>标准型号</td></tr><tr><td>器官培养皿（带中心井的器官培养皿）</td><td>Falcon</td><td>353037</td><td></td></tr><tr><td>膜（细胞培养插件，0.4 &amp;mu;m孔径）</td><td>BD Falcon</td><td>353090</td><td>PET核径迹蚀刻膜，6孔板规格</td></tr><tr><td>金属网格（不锈钢 - AISI 304 - 网格）</td><td>Goodfellow</td><td>FE228710</td><td>(Fe/Cr18/Ni10)</td></tr><tr><td>AutoFlow直接加热CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;培养箱</td><td>Nuaire</td><td>NU-5500</td><td></td></tr><tr><td>Picospritzer III</td><td>Intracel Ltd</td><td>051-0500-900 0-100 psi</td><td>单通道Picospritzer III</td></tr><tr><td>带内丝玻璃毛细管，直径1 mm</td><td>WPI</td><td>TW100F-4</td><td></td></tr><tr><td>钨丝，直径0.1 mm</td><td>Goodfellow</td><td>W005138</td><td></td></tr><tr><td>钨丝，直径0.38 mm</td><td>Goodfellow</td><td>W005155</td><td></td></tr><tr><td>吸液管</td><td>Sigma</td><td>A5177</td><td>用于口吸法细胞谱系示踪</td></tr></tbody></table>

切片培养法用于观察牙胚在器官培养中的发育过程

The Slice Culture Method for Following Development of Tooth Germs In Explant Culture

外植体培养可对特定时间点的发育器官进行操作&#160;因此是发育生物学家的一种重要方法。对于许多器官而言，很难接触到正在发育的组织以实现发育过程中的实时监测 离体 培养。切片培养法可使组织易于观察，从而能够追踪形态发生运动，并可针对特定细胞群体进行操作或谱系示踪。
本文介绍了一种在多种物种中成功用于牙胚培养的组织切片培养方法。该方法可充分暴露牙胚，使其发育速率与体内观察到的发育速率相近 体内，周围环绕着其他颌面部组织。这使得牙齿与其周围组织之间的相互作用得以被监测。尽管本文主要关注牙胚，但该相同方案也可用于追踪其他多种器官的发育过程，如唾液腺、Meckel 软骨、鼻腺、舌和耳。

为了追踪第一恒磨牙牙囊的移动，采用上述方法对下颌骨进行250 μm的冠状切片。牙囊是包绕发育中牙齿外釉上皮（OEE）的一层间充质组织，先前已被证明参与牙周组织的形成6。下颌骨样本取自E14.5时期，即牙齿发育的帽状期。在切片中，牙上皮的轮廓清晰可见，而围绕牙上皮的致密化牙间充质则表现为一圈较深的环状结构（图4A）。在切片舌侧的牙外釉上皮旁的间充质区域注射DiI染料（图4A）。标记后，切片被培养4天，并在不同时间点拍照记录（图4B和图4C）。体内情况下，牙胚在E18.5时应已达到钟状期，而在切片中也观察到了明显的钟状期形态，表明在此时间段内发育进程相似。随着牙齿的生长，DiI标记区域逐渐延伸，形成一条环绕外牙上皮的细胞带（图4B和图4C）。
<img alt="用于组织...

本文详细介绍了一种利用组织切片机在下颌骨切片中培养牙胚的方法。该方法能够在牙齿发育过程中对其进行独特地观察和干预，为操作和谱系示踪提供了极佳的机会，而这些优势是传统培养方法所无法实现的。

器官外植培养可在特定时间点对发育中的器官进行操作，因此是发育生物学研究中的重要方法……

以下实验的总体目标是观察牙齿在数天内的发育过程。通过体外器官培养技术，首先分离胎鼠正在发育的下颌，将其制备成活体组织切片，以暴露正在发育的牙胚，此为第二步。随后选取切片，置于培养基上方的滤膜上进行孵育，以支持其继续发育。接下来的切片使用谱系示踪剂进行标记，以追踪培养期间细胞的移动情况，获得的结果显示了牙组织在离体培养过程中发育时的动态特性。与传统器官块培养技术相比，该方法的主要优势在于能够在整个发育过程中观察到牙齿胚等内部发育器官在周围组织环境中的发育情况。该方法的可视化演示至关重要，因为如果仪器设置或组织方向不准确，切割和选择步骤可能会变得困难。首先，通过向500毫升的高级ECCOs改良Eagle F12培养基中添加1%谷氨酸和1%青霉素-链霉素，制备用于胚胎器官的解剖和培养介质。然后，按照高桥Sumi在视频文章中所述的方法，解剖发育阶段为E11.5至E15.5的小鼠胚胎，并将其放入含有新鲜培养基的培养皿中。接下来，使用新磨制的无菌钨针切除胚胎头部，并将头部转移至冰上预冷的新鲜培养基培养皿中。然后用针插入口腔，暂时向头部后方切割，从头部分离下颌骨。在切片前，将分离的下颌骨置于预冷的培养基中并放在冰上保存。在切取下颌骨组织前，用70%乙醇清洁组织切片机的固定盘和刀片，并确保刀片与固定盘表面齐平。当刀片使用后出现下落情况时，大约切割200个下颌骨后需要更换刀片；根据样本的发育年龄，将切片厚度设置在200至400微米之间。若需要获取E14.5胚胎的完整牙胚用于实验，且需分离牙胚，则采用250微米的切片厚度。接下来，将一个下颌骨转移至塑料包埋盘上，并调整其位置，使发育中的舌体处于前横位。在分离切牙以解剖磨牙时，需沿下颌骨进行矢状切面切片。正确放置后，用滤纸吸去组织周围的过量培养基。通过滤纸轻微按压下颌骨，使其固定在载片上。用滤纸干燥后，立即将载片置于切片机的圆形不锈钢台面上。然后将刀片力度调至最大，打开机器并按下启动按钮。工作台会自动从左向右移动，同时带动刀片的切削臂以每分钟高达200次的频率上下往复运动进行切割。待组织完全切片后，关闭机器。确保刀片臂处于抬起位置，然后取下刀盘。切勿将手指置于刀片臂下方，或无人看管设备。切碎组织时，取下固定刀盘后应立即向刀盘上的组织切片添加培养基，以防止切片过度干燥。然后使用钨针或移液器小心地将组织切片从培养皿底部剥离，并将其移至盛有培养基的小培养皿中。接着，在体视显微镜下用针将各个切片分开，挑选出包含目标区域的组织切片。将选好的切片置于含有新鲜培养基的培养皿中，并通过裁剪不锈钢平纹织网片制备培养系统用的金属网格，每条网格尺寸为4厘米×1.5厘米。然后使用标准的办公打孔器在中心打一个孔，并弯曲边缘，使网格能够平整地覆盖在中央孔上，并与培养皿底部平行。网格成型后，在使用前需通过高压灭菌器进行灭菌处理。接下来，通过向外围孔中加入两毫升高压灭菌水，以防止脱水，从而完成中央孔器官培养皿的培养前准备。然后将一个无菌的金属网格置于培养皿中央。剪取一片孔径为0.4微米的透明聚对苯二甲酸乙二醇酯膜，使其足够大以覆盖网格上的孔。若需进行谱系示踪，则将剪好的膜与选定的下颌骨切片一同放入培养皿中。首先，使用拉针仪将玻璃毛细管拉制成玻璃毛细针。随后折断针尖，并将针尖朝下插入亲脂性染料溶液（如DiI染料或DiO染料）中，通过毛细作用吸入少量染料溶液。数分钟后，将充满染料的毛细针放入针持中，并连接至口控吸管器。将针尖置于培养基中，使其接触需要标记的区域，例如此处所示的牙囊。然后将少量染料释放到组织上。接着，将切片转移至荧光显微镜载物台上，检查切片是否成功标记。标记成功后，小心地将切片提起并置于膜上，然后将膜连同居中展平的切片一起转移至培养基外。接着，将滤膜覆盖在网格中央的圆形孔上，向孔中加入约一毫升培养基，直至液面高度与膜齐平。此时，向培养基中加入所需的蛋白质或小分子抑制剂。同时，使用体视显微镜对切片进行成像，以记录第0天的形态学特征，拍摄时应从下方提供光源以获得最佳图像效果。将培养皿置于37摄氏度、5%二氧化碳的湿润环境中培养，并每两到三天定期更换培养基。持续对培养物进行成像，以追踪其发育进展。此处展示的是一系列图像，记录了第一磨牙牙囊的发育过程，该牙囊使用染料眼荧光染色剂进行标记。该切片为小鼠在胚胎14.5天（E 14.5）时从下颌获取的250微米厚的冠状切片。以黑点勾勒出的牙齿在第0天时处于帽状期。到第四天，牙胚已达到钟状期，牙囊细胞可见围绕正在发育的外釉质呈弧形分布。上皮组织一旦掌握，该技术可从胚胎到最终培养在三小时内完成。观看本视频后，您应能充分理解如何在体外培养中成功观察器官的发育过程。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

切片培养法继牙胚在植文化的发展

来自胚胎啮齿类动物大脑的器官型脑片培养被广泛用于研究大脑发育。尽管在体系统常常具有一些优势，……...

E18 大鼠脑组织器官型切片培养

器官型原代组织外植体培养，包括精密切割的组织切片，能够保留天然组织的三维（3-D）结构以及多细胞间的相互作用。本视频介绍了利用旋转式培养装置培养小鼠肺癌组织来源切片的方法，该系统可使组织间歇性地接触氧气和营养物质。本方案详细描述了制备和培养精密切割肺癌组织切片以用于药物反应研究的技术流程。...

肺肿瘤组织外植体培养：制备与培养精准切割肺肿瘤切片的操作流程

该视频展示了从胶质母细胞瘤组织中制备和维持类器官切片培养物的方法。将分离的组织包埋在琼脂糖基质中，使用振动切片机获取薄切片。随后将这些切片置于微孔板内的可渗透膜插件上，并在切片培养维持培养基中进行长期培养。...

利用人胶质母细胞瘤组织制备和维持脑片培养

本视频展示了利用微流控装置研究牙胚牙髓与三叉神经节之间相互作用的方法。视频中演示了将组织放置于微流控装置内的操作过程，并详细呈现了三叉神经突通过装置中的微通道向牙胚生长的可视化过程。此外，视频还强调了牙源性分子因子在促进或抑制神经突延伸进入牙胚牙髓中的作用，这对于确保出生后牙齿有效神经支配至关重要。...

使用微流控共培养系统分析牙胚与三叉神经节的相互作用

共培养是研究神经与靶组织及器官之间相互作用的重要方法。微流控系统可在不同的培养基中实现神经节与完整发育中的器官或组织的共培养，因此成为一种研究该领域的有力工具。 体外...

利用微流控共培养装置分析发育中牙胚的神经支配

人胶质母细胞瘤类器官切片培养模型用于研究肿瘤细胞迁移及抗侵袭药物的个体化效应

我们提供了一种用于生成、培养及系统分析源自小鼠肺癌肿瘤的器官型组织切片的方法。同时介绍了如何优化切片厚度，以及如何选择药物浓度以处理肿瘤切片。...

建立和分析肿瘤组织切片外植体作为诊断检测的先决条件

本文介绍了一种制备成人人类脑组织游离式脑片培养的实验方案。该方案是广泛使用的膜插件脑片培养法的一种改进，操作简便且成本较低，适用于开展旨在揭示与年龄相关脑疾病中神经退行性变机制的短期检测实验。...

成人脑组织短期游离式脑片培养

Trowell型器官培养方法已被用于解析调控牙齿发育的复杂信号网络，最近还被用于研究小鼠不断生长的门齿中干细胞相关的调控机制。荧光报告动物模型和活体成像技术有助于对牙源性干细胞及其特定的微环境生态位进行深入分析。...

使用Trowell型器官培养研究牙源性干细胞的调控

离体活体成像是一种研究活体组织中细胞运动和相互作用动态过程的强大技术。本文介绍了一种利用双光子显微镜对培养的成年小鼠全门齿中的牙上皮细胞进行活体示踪的实验方案。...

使用 离体 活体成像技术研究小鼠牙齿更新过程中的细胞分裂与迁移

学习利用组织切片培养法在胎儿小鼠下颌骨中培养牙胚，实现谱系追踪和实时观察牙齿发育动态。该方法优于传统外植体培养，为发育生物学研究提供全新视角。

切片培养法用于观察牙胚在器官培养中的发育过程

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