一种用于研究结核病与疟疾共感染的实验模型——基于自然传播途径 结核分枝杆菌 和 疟原虫伯氏疟原虫

本实验的总体目标是建立一种小鼠实验模型，可用于研究结核病与疟疾共感染在体内的影响。首先通过使用吸入暴露系统，使实验动物接触含有结核分枝杆菌的感染性气溶胶颗粒，从而实现这一目标。

第二步，通过肺组织的菌落形成单位（CFU）分析，验证小鼠摄入所需数量的结核分枝杆菌。气溶胶感染后一天，再过40天，将小鼠暴露于感染性蚊子，以实现疟原虫子孢子的自然传播，子孢子在蚊子吸血过程中沉积于全层皮肤下。最后一步，通过吉姆萨染色的血涂片分析，监测疟疾红细胞期寄生虫的发育情况。

最终，可通过定量肺部结核分枝杆菌的负荷以及共感染动物血液中的寄生虫数量，分别确定结核病和疟疾的病程。该方法有助于回答结核病与疟疾共感染领域中的关键科学问题，例如：疟原虫共感染如何影响结核分枝杆菌感染的发病机制及其控制？本实验方案旨在研究疟原虫（odium buri）共感染对免疫功能正常C57BL/6小鼠结核分枝杆菌慢性感染阶段的影响。

它也可应用于其他小鼠品系，包括基因敲除小鼠，或与其他分枝杆菌或枝孢霉属物种联合使用。首先将结核分枝杆菌置于适宜温度下复苏。使用已知CFU滴度的菌种储备液。

待细胞解冻后，使用装有27号针头的1毫升注射器轻柔吹打悬液5次，以分散细菌团块，避免产生气溶胶；根据所需感染剂量，将分枝杆菌储备液适量转移至含有无菌PBS的50毫升离心管中，终体积为6毫升。随后，将实验动物 individually 放入分隔的金属网篮中，将网篮置入圆形气溶胶暴露室，并盖紧腔室盖子。

将文丘里雾化器单元连接到三个不锈钢接头。用配有18号钝针的10毫升注射器吸取分枝杆菌悬液，并将注射器置于密闭转运盒中带至气溶胶室。然后取下雾化器螺帽，小心地将分枝杆菌悬液注入装置中。

注意避免产生气溶胶。将注射器丢弃至含有2%Burton的锐器容器中，然后密封雾化器。当循环完成后，运行吸入装置。

在打开气溶胶室之前，确认分枝杆菌悬液已完全雾化。佩戴动力送风式空气净化呼吸器头盔，然后将动物放回笼中。气溶胶感染后一天，对指定的安乐死对照动物，在二级生物安全柜内的解剖板上将其置于吸水纸上，并用70%乙醇对每只小鼠进行消毒。首先在腹部中央做一个小切口，然后将皮肤向动物头部方向拉开。

接下来，使用手术剪刀打开腹部和胸腔。移除胸壁以暴露肺组织，然后将其取出。将肺组织转移至含有 2 毫升匀浆缓冲液的 15 毫升离心管中，随后使用 5 毫升注射器的推杆将组织通过 100 微米细胞筛过滤至小型培养皿中。

使用带滤芯吸头的1毫升移液器反复冲洗筛子，然后将约250微升肺组织匀浆液分装至八个琼脂平板上。待平板干燥后，使用一次性涂布棒小心地将样品涂布均匀。每个平板用Perfil密封。

用铝箔包裹，并于 37 摄氏度下直立孵育至少四周。通过蚊虫叮咬使疟原虫感染无感染史的小鼠或分枝杆菌感染小鼠时，将麻醉后的动物置于蚊笼的网膜上，使具感染性的蚊子能够透过膜吸血，以确保子孢子成功传播。将小鼠留在蚊笼上 10 至 15 分钟。

将小鼠转移回笼中，置于纸巾上，并用纸巾覆盖以保持温暖，直至其从麻醉中苏醒。通过笼网向蚊子喷洒70%乙醇或其他消毒剂将其灭杀，并通过高压灭菌对笼子进行消毒。为监测寄生虫血症，用针头刺破每只感染动物静脉末端，采集一滴血液。

在载玻片的每一端，用另一张载玻片将一滴血液沿底部载玻片长度的一半均匀推开。然后将推片翻转，用另一侧边缘制备第二张血涂片。将载玻片放入染色架中。

用纯甲醇短暂固定血涂片，然后空气干燥。接着将涂片浸入吉姆萨染液中。10分钟后，将载玻片在盛有去离子水的染色缸中反复浸入和取出数次，以洗去多余的染液。

最后，将载玻片置于垂直位置空气干燥。通过蚊虫叮咬使实验动物感染子孢子，可在4至5天后通过血液阶段寄生虫的存在确认感染，感染率达到100%。如表格所示，无论是在未免疫小鼠还是在感染结核分枝杆菌的小鼠中，通过蚊虫叮咬感染伯氏疟原虫（Plasmodium buri）均可在实验组内实现所有动物的一致且可重复的感染。

通过比较弓首蛔虫（Toxocara）感染潜伏前期小鼠、未处理对照小鼠与结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）共感染动物，可以观察到潜伏前期略有延迟。利用吸入暴露系统使小鼠预先感染结核分枝杆菌，可成功将细菌沉积至动物肺部，且个体间变异程度相对较低。在弓首蛔虫（p burga）存在的情况下，感染的C57BL/6小鼠肺部的分枝杆菌载量有所增加。

相比之下，共感染小鼠的寄生虫血症水平较单纯疟原虫感染小鼠有所降低。通过该实验流程，可对目标组织或体液进一步开展流式细胞术、PCR、ELISA或组织学技术等分析方法，以同时解析针对疟原虫和结核分枝杆菌的免疫应答及其在共感染宿主中的相互作用。切记，操作人类病原体结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）具有极高危险性，必须始终采取严格措施，避免暴露于具有传染性的气溶胶环境中。

所有涉及结核分枝杆菌的实验工作都必须在适当的生物安全三级设施中进行。