Name: 实验模型后的自然传播到研究结核病，疟疾混合感染结核分枝杆菌和伯氏疟原虫 /i (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-17T21:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 2 s
Description: 了解结核病与疟疾混合感染的小鼠实验模型建立方法，通过气溶胶吸入感染结核分枝杆菌，并经蚊虫自然传播感染伯氏疟原虫。该模型可用于研究两种病原体在体内的相互作用机制及免疫应答。

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作者感谢 Miriam Ester 在蚊子繁育方面的工作。本研究得到了博斯特尔研究中心内部资金以及莱布尼茨感染研究中心联合资助的支持。

安全措施与伦理声明
本文所述研究涉及人类病原体Mtb和啮齿类疟原虫约氏疟原虫（P. berghei）的操作。对Mtb（H37Rv菌株）和P. berghei的实验必须在适当的生物安全条件下进行。P. berghei等啮齿类疟原虫需在生物安全二级（BSL-2）实验室中操作，而Mtb则需在三级生物安全（BSL-3）实验室中操作，因此本文所述所有共感染研究均须在BSL-3条件下进行。注意：感染Mtb的小鼠不会将病原体传播给邻近的其他小鼠（基于我们自身的观察）。因此可排除对实验人员的传播风险；但在BSL-3实验室中，必须始终穿戴适当的防护装备。根据我们的规定，实验人员需穿着外科手术服、佩戴发网、一次性呼吸器以及两层手套，其中外层手套在手臂每次从生物安全柜中退出时即应丢弃。再次进入安全柜前需更换新手套。实验前需准备两个容器，一个装有2% Buraton（注意：也可使用其他经批准可灭活Mtb的消毒剂，并按批准浓度配制），用于盛装液体及感染性废弃物；另一个用于表面去污，均置于安全柜内。此外，塑料袋将用于盛装非感染性固体废弃物。根据德国相关规定，所有涉及Mtb培养物或来自Mtb感染小鼠组织的处理操作，均必须在BSL-3实验室内的II级生物安全柜中进行。操作分枝杆菌时，必须始终采取措施避免气溶胶的产生。
所有共感染实验均使用6至8周龄的雌性C57BL/6小鼠（Charles River），并在生物安全三级设施的特定屏障条件下饲养。动物护理和实验操作均依照石勒苏益格-荷尔斯泰因州农业、环境和农村事务部动物实验伦理委员会批准的方案进行。
为获取疟疾蚊虫阶段，实验所用NMRI小鼠购自德国苏尔茨费尔德的查尔斯河实验室，并饲养于海德堡大学动物设施（IBF）的特定无病原体环境中。所有动物实验均依照欧洲法规进行，并经巴登-符腾堡州政府卡尔斯鲁厄行政区政府批准。
1. 小鼠气溶胶感染 Mtb 使用Glas-Col气溶胶室
对实验动物进行气溶胶感染时，最理想的标准化方法是使用已知CFU滴度的冻存Mtb菌株。制备菌种储备液时，将Mtb培养于添加OADC（油酸、白蛋白、葡萄糖、过氧化氢酶）增补剂和0.05%吐温-80的Middlebrook 7H9液体培养基中，吐温-80既作为分枝杆菌的碳源，又可防止细菌聚集。收获菌液时，其光密度（OD）应≤1。当OD值过高时，细菌易发生聚集，且活力下降。将菌液以1 ml分装后于-80 °C保存。通过将三个独立冻存管的菌液进行10倍系列稀释，取样接种于添加0.5%甘油、1 g/L天冬酰胺及OADC的7H11琼脂平板上，在37 °C培养4周后计数菌落，以确定冻存菌液中活菌的菌落形成单位（CFU）数量。随后按以下所述方法进行气溶胶感染。
<ol>
	<li>解冻已知CFU滴度的Mtb菌种，使用装有27 G针头的1 ml注射器将菌悬液轻轻吹打混合5次，以分散细菌团块。避免产生气溶胶。</li>
	<li>根据所需的感染剂量，将适量的分枝杆菌菌液转移至含有无菌PBS的50 ml离心管中，终体积为6 ml。注意：通过调整此悬浮液中的微生物数量，可改变携带细菌的气溶胶液滴比例。我们通常以每肺感染100个活菌为目标（低剂量感染）。根据我们的经验，这需要在6 ml总体积中含有约1–2 × 106 Mtb/ml，其中5.5 ml用于雾化（见下文）。建议进行一系列不同细菌浓度的实验性气溶胶攻击，以确定最适合您感染实验的条件。虽然可通过高达5,000个分枝杆菌的高剂量感染来加速感染进程，但也可使用低至5个细菌成功通过气溶胶感染小鼠。感染率通常为100%。</li>
	<li>从菌液中取出足够体积（制备时应超过最终所需体积）用于涂板以确定接种物滴度；我们通常取出500 µl进行技术重复三份涂板。</li>
	<li>将动物放入圆形气溶胶室内的分隔式金属网篮中（每个篮子放一只小鼠），并关闭气溶胶室盖子。注意：其他型号设备配备由五个独立隔间组成的扇形篮，每个隔间可容纳20只小鼠。</li>
	<li>将文丘里雾化器单元连接至三个不锈钢接口。</li>
	<li>使用装有18 G钝头针的10 ml注射器从50 ml离心管中吸取分枝杆菌悬液，并将注射器置于密闭运输盒中带至气溶胶室。</li>
	<li>取下雾化器单元的螺帽，小心地将分枝杆菌悬液注入雾化器中。避免产生气溶胶。将注射器丢弃至含有2% Buraton的锐器盒中。用螺帽密封雾化器。</li>
	<li>打开主电源开关和紫外灯。控制面板显示屏上将显示“Glas-Col Apparatus Co”。</li>
	<li>打开程序开关。显示屏将显示“雾化器准备就绪了吗？”“篮子已装载了吗？”准备就绪后按回车键。按下回车键。</li>
	<li>显示屏将显示“输入预热时间 900”；表示焚烧炉（用于净化排气空气）的预热时间为900秒。按下回车键。</li>
	<li>显示屏将显示“输入雾化时间 1,800”；表示默认雾化时间为1,800秒。若需延长雾化时间，请输入“2,400”并按回车键。注意：在雾化循环期间，加压空气将菌液雾化，从而产生含有分枝杆菌的微小气溶胶液滴。这些液滴（大小约为2–5 µm）随主气流进入气溶胶室。</li>
	<li>显示屏将显示“输入衰减时间 1,800”；表示衰减周期为1,800秒。设置为“2,400”后按回车键。注意：在此周期中，气溶胶室内在雾化过程中形成的气溶胶云可逐渐消散，微小液滴被实验动物吸入。</li>
	<li>显示屏将显示“输入净化时间 900”；表示紫外光去污周期将持续900秒。按下回车键。仪器将开始依次运行预热、雾化、气溶胶衰减和紫外去污程序。 
	警告：真空流量计应显示60立方英尺/小时（在预热周期开始时检查；必要时调节真空控制阀），压缩空气流量计应显示10立方英尺/小时（在雾化周期开始时检查；相应调节空气控制阀）。</li>
	<li>当程序完成后，控制面板将显示“程序完成——移出样本”。关闭程序开关、紫外灯及主电源开关。</li>
	<li>检查分枝杆菌悬液是否已完全雾化，若未完全雾化，使用配备18 G钝头针的合适注射器小心吸取残留液体并记录体积。残留体积不应超过1 ml。</li>
	<li>从接口上取下雾化器，放入盛有2% Buraton的容器中浸泡至少2小时，通常过夜消毒。之后将雾化器转移至新的容器中，用清水彻底冲洗，并静置晾干。</li>
	<li>打开气溶胶室，将动物放回笼具中。将篮子装入高压灭菌袋并进行高压灭菌。用2% Buraton擦拭气溶胶室内表面。 注意：出于安全考虑，此操作过程中应佩戴动力送风式呼吸防护器。</li>
	<li>使用剩余的500 µl分枝杆菌悬液（见步骤1.3），对技术重复三份样品（3 × 100 µl）进行10倍系列稀释后，涂布于7H11琼脂平板上。</li>
</ol>
2. 验证肺部中目标CFU的摄取情况
在实验动物进行气溶胶感染后一天，测定指定对照组动物肺组织中的细菌载量，以验证已摄入目标菌落形成单位（CFU）。注意：我们通常额外设置一组3-5只小鼠用于第1天的CFU测定。
为了监测结核分枝杆菌（Mtb）感染随时间的进展，可通过将整个器官匀浆液进行系列稀释后涂板，测定菌落形成单位（CFU），以评估分枝杆菌的组织负荷量。肺是结核病病变的主要部位，但通常也会相应地分析脾脏、肝脏和淋巴结。涂板所用的稀释倍数取决于器官中预期的分枝杆菌载量，而后者又受初始接种剂量（低剂量与高剂量）的影响，不同接种剂量会导致组织中细菌载量的不同，同时也取决于待分析的器官种类和时间点。在低剂量感染情况下，肺中 Mtb H37Rv 的细菌载量通常在感染后第25至30天达到平台期。
<ol>
	<li>将已实施安乐死的动物放置（安乐死方法：CO2 在II级生物安全柜内的解剖板上，将小鼠通过窒息或终末麻醉处死，并用70%乙醇对小鼠体表进行消毒。注意：70%乙醇仅用于表面去污，不能杀灭结核分枝杆菌（Mtb）。</li>
	<li>在腹部中央做一个小切口，并将小鼠的皮肤向头部方向拉开。</li>
	<li>用手术剪刀打开腹腔和胸腔，移除胸壁，使肺脏暴露并便于操作。</li>
	<li>取出肺脏并转移至含有匀浆缓冲液（无菌水/1% v/v Tween 80/1% w/v 牛血清白蛋白）的15 ml离心管中。</li>
	<li>使用5 ml注射器的推杆将肺组织通过100 µm细胞筛过滤至小型培养皿中。</li>
	<li>使用带滤芯吸头的1 ml移液器多次冲洗筛子，并将肺组织匀浆液分装至8个琼脂平板中（ca250 µl/板；确保表面充分干燥。</li>
	<li>使用一次性涂布棒小心地将样品涂布于平板上，用后将涂布棒丢弃至2% Buraton溶液中。</li>
	<li>将琼脂平板置于超净台内晾干。每块平板均用封口膜密封，再用铝箔纸包裹，于37 °C直立培养至少4周。</li>
</ol>
3. 构建防逃逸蚊笼
啮齿动物 疟原虫 菌株对人类无害。然而，由于 Mtb感染小鼠作为寄生虫的受体，实验需在生物安全三级（BSL-3）条件下进行，必须采取预防措施以防止蚊子从笼中逃逸。根据计划的感染方案，可使用可高压灭菌且可重复使用的金属框架笼具，或自制的一次性笼具。若后续处理要求较高或需避免交叉污染，建议使用后者。 通过叮咬 每只小鼠需由确定数量的蚊子进行感染实验。若需自制笼子，应严格按照规格制备，因为蚊子的健康状况和实验室的安全依赖于笼子的合理构造。图2).
<ol>
	<li>取一个纸盒，例如半品脱的冰淇淋盒或纸制咖啡杯（图2）。</li>
	<li>在纸盒侧面切一个小开口，并用两层乳胶膜覆盖，每层乳胶膜上切出切口，以形成蚊虫安全进入的通道。注意：开口的总体尺寸为 2 cm × 2 cm；我们用于引入或移出蚊虫的管路（吸蚊装置）是连接至真空泵的改良 15 ml Falcon 管，因此其作为吸蚊器的直径为 1.5 cm。</li>
	<li>在纸盒内部底部贴上一片滤纸，以吸收滴落的液体。</li>
	<li>用网纱（双层尼龙网，孔径 1 mm × 1 mm）封住冰淇淋杯口，并用胶带和橡皮筋固定在纸盒上。</li>
	<li>在需要每只小鼠感染特定数量蚊虫的感染实验中，应准备含有 10–15 只感染蚊虫的笼子，每只蚊虫理想情况下含有平均 10,000 个野生型唾液腺 P. berghei 子孢子。</li>
	<li>理想情况下，在进行血液餐之前，应将蚊虫饥饿处理 24 小时。</li>
</ol>
4. 通过蚊虫叮咬使小鼠感染疟疾
本文使用的啮齿类疟原虫为P. berghei，但也可使用其他任何感兴趣的啮齿类Plasmodium菌株。为了获得可用于子孢子传播的感染性蚊子，需在脊椎动物宿主（小鼠）和蚊媒中维持该寄生虫的完整生活周期。寄生虫的维持工作在昆虫饲养室中进行。在自然传播实验中，每对唾液腺中的子孢子数量最低不应少于10,000个。有关寄生虫维持的详细方案，请参考Moll 等.，2013年出版的《疟疾研究方法》（Methods in Malaria Research）。
<ol>
	<li>通过腹腔注射（每只小鼠 200 µl）使用氯胺酮（100 mg/kg）和赛拉嗪（7 mg/kg）溶液对未免疫小鼠或已感染结核分枝杆菌（Mtb）40天的小鼠进行麻醉。注意：结核分枝杆菌与疟原虫感染之间的时间间隔可根据具体研究问题进行调整。同样，病原体攻击的顺序也可调换，即小鼠可在感染结核分枝杆菌之前先暴露于感染性蚊虫叮咬。</li>
	<li>将麻醉后的小鼠放置于蚊笼的网罩上（每个蚊笼放置一只小鼠，以确保蚊虫与小鼠的比例恒定），让蚊虫通过膜饲喂10–15分钟。注意：若在蚊虫肠道中观察到血液，表明其已完成吸血，从而提示子孢子已成功传播。</li>
	<li>将小鼠转移回其饲养笼中，并持续监护直至其从麻醉状态中苏醒。注意：应将小鼠置于纸巾上而非垫料上（以防窒息），并保持其体温（将小鼠紧密放置并用纸巾覆盖身体）。</li>
	<li>通过网罩向蚊虫喷洒70%乙醇或其他消毒剂将其杀死。若使用一次性蚊笼，需进行高压灭菌后丢弃。</li>
</ol>
5. 监测寄生虫血症
<ol>
	<li>用针头在尾静脉末端穿刺，并在载玻片两端各收集一滴血液。</li>
	<li>用另一张载玻片将其中一滴血液沿载玻片长度方向推展约一半。翻转推片，使用其另一边缘制备第二张血涂片。将载玻片静置，自然晾干。</li>
	<li>吉姆萨染色
	<ol>
		<li>将载玻片放入玻片架中，通过短暂浸入无水甲醇中固定血涂片。注意：由于在生物安全三级实验室（BSL-3）中应尽量减少玻璃器皿的使用，因此所有溶液均使用聚丙烯比色皿。</li>
		<li>将血涂片浸入吉姆萨染液（1:10，溶于去离子水中）。10分钟后，将载玻片在盛有去离子水的染色比色皿中反复浸入和取出数次，以洗去多余染液。</li>
		<li>最后，将载玻片垂直放置，自然晾干。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>替代染色法：瑞氏染色
	<ol>
		<li>将瑞氏染料以1 mg/mL的浓度溶于甲醇中。</li>
		<li>使用前经折叠滤纸过滤。</li>
		<li>将血涂片浸入染色液中，孵育4分钟（注意：由于染色液本身含甲醇，因此无需预先用甲醇固定涂片）。</li>
		<li>按上述方法用去离子水冲洗载玻片，并静置晾干。</li>
		<li>完成吉姆萨或瑞氏染色后，小心将所有使用过的试剂转移至含有Buraton的废弃处理容器中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>血涂片分析
	<ol>
		<li>在光学显微镜下使用油镜（100倍放大）观察染色后的血涂片。</li>
		<li>在血涂片中红细胞呈单层分布的区域，计数未感染和感染的红细胞。</li>
		<li>为获得准确的寄生率，应至少计数10个不同视野中呈单层分布的红细胞区域。</li>
		<li>通过将寄生红细胞数量除以总红细胞数量再乘以100，计算相对寄生率（%）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

我们描述了如何通过自然感染途径使小鼠成功感染结核分枝杆菌（Mtb）和伯氏疟原虫（P. berghei）。我们采用已建立的感染方案来研究实验性结核病13或疟疾12，并近期将其改进用于在小鼠模型中研究Mtb与疟原虫（Plasmodium）的共感染1。
成功感染最关键的步骤是两种病原体均以目标数量进行传播。分枝杆菌菌种保存时间不应超过2年，因为其活性会随着时间推移而下降，最初测定的滴度很可能不再准确，导致感染剂量远低于预期。因此，应每隔几个月重新测定一次菌种储备液的菌落形成单位（CFU）滴度。同样重要的是，首先应采用标准化方法培养和制备结核分枝杆菌（Mtb）菌种储备液。培养条件（如培养基、添加物、培养时间和体积）必须标准化，以便能够比较使用不同Mtb菌种储备液的实验数据。分枝杆菌在培养过程中容易发生聚集，因此保持培养条件的标准化、在相同的生长阶段收获细菌，并在分装过程中频繁重悬，显得尤为重要。否则，CFU滴度和感染结果可能出现较大差异。
获得感染程度均一的蚊虫群体是另一个关键步骤。由于不同的蚊虫会叮咬同一只小鼠，因此一次感染实验所用的所有蚊虫必须来自同一批次，并且仅能使用感染率超过90%的批次。
当前模型可用于通过与单一感染宿主的免疫反应进行比较，解析共感染宿主中的免疫应答及免疫调节机制。我们可以将多种成熟的方法学应用于目标组织或体液，例如组织学、免疫组织化学、免疫细胞群体的流式细胞术分析，或用于细胞因子和趋化因子检测的PCR与ELISA。需要注意的是，此类小鼠模型存在一定局限性。尽管大多数感染者 Mtb 建立潜伏感染且无临床症状，而小鼠则发展为慢性疾病并伴有进行性肺部病理变化。尽管如此，C57BL/6 小鼠对此仍具有相对抗性 Mtb 感染后不会形成在人类结核病患者中所观察到的经典肉芽肿。因此，小鼠的免疫病理反应并不能恰当地反映人类潜伏性或活动性结核病的实际情况。尽管人类与小鼠在潜伏感染和慢性疾病之间存在差异，小鼠仍被广泛用于识别和研究调控宿主反应的因素 Mtb 感染，并且是研究传染病中免疫反应的宝贵且不可或缺的工具。重要的是，对感染的易感性 Mtb 不同常用近交系小鼠品系之间的感染情况存在显著差异，因此可将易感品系（如DBA或C3H）纳入共感染和单感染研究。此外，除本文所述病原体种类外，其他任何 分枝杆菌 目标物种（例如 临床分离株）可用于研究。同样，尽管目前尚无单一的疟疾模型能够完全复制人类疾病的全部特征，但不同的小鼠模型确实能高度模拟自然获得的人类疟疾感染的各个不同方面。例如， P. berghei ANKA 和 P. yoelii YM/17XL 是广泛研究的人类（P. falciparum诱导的）重症疟疾，伴有 P. berghei ANKA 被认为是人类脑型疟疾的优良模型s14,15. P. berghei NK65 是研究高寄生率和急性疟疾性贫血的优良模型，最近还被描述为疟疾相关急性呼吸窘迫综合征（MA-ARDS）的实验模型。16）。利用所述的共感染模型，我们最近发现，同时发生的 P. berghei NK65感染加重慢性结核病1.
除了使用不同的啮齿类疟原虫外，感染事件的顺序和时间安排也可根据具体的研究问题进行调整。在实际研究中，并发 疟原虫 感染可能在当时就已存在 Mtb 感染或后续获得性感染。在这两种情况下，对 Mtb 和 疟原虫 可能受到不同的影响。因此，小鼠可被感染 疟原虫 子孢子，无论在之前或之后 Mtb 感染。此外，可在感染后不同时间点对小鼠进行攻毒挑战 Mtb 感染以评估其影响 疟原虫诱导的免疫反应在急性与慢性结核病中的差异。重要的是，在选择用于研究疟疾-结核病共感染的疟原虫时，应注意到某些啮齿类动物疟原虫 疟原虫 某些小鼠品系感染后会引发急性疾病，并在数天或数周内死亡 Mtb 在免疫功能正常的小鼠中引起慢性且持久的感染。因此，共感染的时间安排至关重要，以避免实验动物过早死亡。
多种病原体同时感染对宿主免疫系统的调节作用仍知之甚少。我们的实验性共感染模型为研究Mycobacterium与Plasmodium在共感染宿主中与免疫系统的相互作用提供了一个强有力的工具，并将有助于我们理解共感染如何影响发病机制、疾病转归、疫苗接种、免疫诊断以及治疗。

人类群体很少仅暴露于单一病原体。特别是在撒哈拉以南非洲等感染高发地区，共感染是一个极为普遍但严重被低估的公共卫生问题。结核病和疟疾分别是人类中最常见的细菌性和寄生虫感染，它们仍是热带贫困地区人群发病和死亡的主要原因。尽管结核病与疟疾在地理分布上存在广泛的重叠，且面临共感染风险的人群数量庞大，但目前对于共感染个体体内针对疟原虫和结核分枝杆菌所同时激发的多种免疫调节因子和效应分子之间复杂且常相互拮抗的相互作用，仍知之甚少。
混合感染的啮齿类动物模型可用于表征同一宿主对不同病原体的差异性免疫反应，从而揭示影响各疾病病理过程和临床结局的相互作用机制，这也将有助于提出新的治疗和预防建议。我们已建立一种实验性小鼠模型，可用于研究在同一宿主体内同时感染结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb）和啮齿类疟原虫（Plasmodium）物种所引发的复杂病理变化1。重要的是，为尽可能模拟自然获得的人类感染，本模型采用了两种病原体在自然界中的实际感染途径。结核病是一种空气传播疾病，主要在肺部发生病变。其致病菌Mtb由活动性结核病患者通过气溶胶途径传播，例如在咳嗽或打喷嚏时释放含有病原体的气溶胶液滴。因此，气溶胶感染是模拟自然感染的首选方法。利用吸入暴露系统可产生含Mtb的空气颗粒，通过该系统中的全身暴露舱，可使实验动物暴露于含Mtb的感染性气溶胶液滴中（图1），这些液滴被吸入肺泡后即启动感染过程2。
另一方面，疟疾是一种由原生动物顶复门寄生虫Plasmodium引起的虫媒传染病，通过雌性按蚊叮咬自然传播。在吸血过程中，具有感染性的子孢子被注入宿主皮肤下，并经血液循环到达肝脏。在肝细胞内，子孢子发育并迅速增殖形成肝期裂殖体。最终，成熟的裂殖体破裂，释放出成千上万具有致病性的第一代裂殖子进入血液，从而启动红细胞侵入、复制、红细胞破裂及再侵入的持续循环3。当部分裂殖子发育为有性阶段的寄生虫——雄性和雌性配子细胞时，Plasmodium的生活史得以延续，这些配子细胞可在蚊子吸血时被摄入。在蚊体内，Plasmodium子孢子在蚊子中肠的卵囊内发育，最终迁移至唾液腺，以便在后续叮咬中传播给新的宿主3,4。
尽管在实验动物模型中递送 Mtb 通过气溶胶这一最相关的途径非常常见，许多实验啮齿类动物 疟原虫 包括疟疾-结核病共感染的研究5-7 通过用感染的红细胞感染小鼠，已实现血液期疟疾感染，同时排除了临床上无症状的肝期阶段。然而，肝期是感染过程中的必经阶段，且与抗疟原虫免疫相关。8-11因此，我们认为在疟疾以及疟疾与结核病共感染的研究中，纳入疟疾肝脏期的传播与维持过程具有重要意义。此外，已有研究表明，自然传播的子孢子比通过针头注射感染的子孢子更具感染性12，这促使我们采用蚊虫叮咬的方式建立疟疾感染，而非注射分离自唾液腺的子孢子。要获得可用于疟原虫自然传播的感染性蚊虫，唯一方法是在脊椎动物宿主（此处为小鼠）和蚊媒中完整维持疟原虫的整个生活周期。因此，开展自然传播研究必须具备用于寄生虫维持的昆虫饲养设施。 通过咬合.
我们在此描述的实验方案旨在研究共感染如何影响 疟原虫 子孢子对慢性结核病的影响1. 为此，将小鼠通过气溶胶感染 M. tuberculosis 40天后，当 M. tuberculosis 感染进入慢性阶段后，将小鼠暴露于感染疟疾的蚊子中。在共感染动物中，可通过监测血液中的寄生虫血症水平和组织中的细菌负荷，分别追踪疟疾与结核病的病程进展。在本方案中，我们将详细描述如何通过两种病原体的自然感染途径使小鼠感染，以及如何确认病原体成功传播。据我们实验经验，这两种实验性感染通常均可达到100%的感染率。这些实验方案既可用于单独研究每种感染，也可如我们所做，用于建立并研究两种最具挑战性的人类传染病之间的共感染模型。该模型亦适用于其他 分枝杆菌属 和啮齿类动物 疟原虫 本方案所述物种以外的其他物种。

<table><tbody><tr><td>Buraton</td><td>Sch&amp;uuml;lke</td><td></td><td>活性成分：醛类（甲醛、戊二醛、乙二醛、己醛）</td></tr><tr><td>Middlebrook 7H9&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>M0178</td><td>用于结核分枝杆菌液体培养物</td></tr><tr><td>Middlebrook 7H11&amp;nbsp;</td><td>BD 生物科学</td><td>283810</td><td>用于结核分枝杆菌培养的琼脂培养基</td></tr><tr><td>Middlebrook OADC 增菌培养基</td><td>BD 生物科学</td><td>212240</td><td>添加至7H9和7H11培养基用于结核分枝杆菌培养</td></tr><tr><td>染色皿</td><td>科学服务</td><td>E62542-12</td><td></td></tr><tr><td>24 片载玻片架（带手柄）</td><td>科学服务</td><td>E62543-06</td><td></td></tr><tr><td>吉姆萨伊红-亚甲蓝溶液</td><td>默克密理博</td><td>109204</td><td></td></tr><tr><td>赖特&amp;acute;s染色</td><td>Sigma</td><td>W0625</td><td></td></tr><tr><td>吸入暴露系统</td><td>Glas-Col</td><td></td><td></td></tr><tr><td>雾化器-文丘里</td><td>Glas-Col</td><td></td><td></td></tr><tr><td>冰淇淋杯</td><td>H&amp;auml;agen-Dazs</td><td></td><td>用作蚊子饲养笼</td></tr><tr><td>金属框架蚊笼</td><td>BioQuip 产品</td><td>1450A</td><td></td></tr></tbody></table>

一种用于研究结核病与疟疾共感染的实验模型——基于自然传播途径 结核分枝杆菌 和 疟原虫伯氏疟原虫

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

由于不同病原体的地理分布存在重叠，共感染在自然条件下常有发生。同时感染多种病原体很可能相互调节针对每种单一病原体的免疫反应，从而可能影响致病过程和疾病结局。共感染患者对抗感染干预措施的反应也可能有所不同。结核分枝杆菌引起的结核病与疟原虫感染之间的共感染 疟原虫，这两种疾病在撒哈拉以南非洲许多地区共同流行，但其相互作用尚未得到深入研究。为了探讨疟疾与结核病共感染如何调节宿主免疫反应及各自疾病进程这一具有重要科学和临床意义但极具挑战性的问题，我们建立了一种实验性小鼠模型，可用于解析共感染宿主体内针对两种病原体所引发的免疫反应。值得注意的是，为了尽可能精确地模拟人类自然获得性感染，我们通过两种病原体各自的自然感染途径对小鼠进行实验性感染 即 气溶胶和蚊虫叮咬。

小鼠感染 Mtb 和 P. berghei 通过自然途径， 即 气溶胶和蚊虫叮咬分别导致所有动物产生一致且可重复的感染（表1)1我们可以通过检测血液中寄生虫的初次出现（潜伏期）及数量，来监测疟疾和结核病感染是否成功以及疾病的发展进程。P. berghei 寄生率）和负担 Mtb 在不同器官中的分布情况。通过感染性蚊虫叮咬成功传播疟原虫的示例如下所示 表1 和 图3每只小鼠由10只感染子孢子的蚊子叮咬后，感染率达到100%，通过4-5天后血液中出现裂殖体阶段的寄生虫得以证实（表1 和 图 3A）。重要的是，我们发现同一实验组小鼠个体间血液中的寄生虫数量相似，表明通过蚊虫叮咬传播的子孢子可导致一致且可重复的感染。通过比较未免疫对照组小鼠与 Mtb-共感染动物中，我们可以观察到先前感染了病原体的小鼠其潜伏期略有延长 Mtb (表1, 图3B)1如我们先前所报道的1，我们可以确定其影响 Mtb 共感染对疟疾病程的影响，通过每日监测吉姆萨染色血涂片中的寄生虫血症水平进行观察，如图所示 图3B.
通过使用吸入暴露系统使小鼠感染结核分枝杆菌（Mtb），可成功将细菌沉积于肺部，且个体小鼠之间的差异相对较小（图 4A）。我们可通过菌落形成单位（CFU）测定法，随时间追踪小鼠肺部及其他目标器官中的分枝杆菌载量。在存在或不存在伯氏疟原虫（P. berghei）的情况下，C57BL/6 小鼠感染 Mtb 后肺部分枝杆菌载量的一个示例如 图 4B 所示。
表1. 蚊子叮咬传播子孢子后的潜伏期。 所有小鼠在通过蚊子叮咬自然传播P. berghei子孢子后均出现血液期感染。经许可改编自1 PLoS ONE, 7(10), e48110。
<table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>实验小鼠组（C57BL/6）</td>
			<td>通过10次感染性蚊虫叮咬进行攻击</td>
			<td>血液期阳性动物数 / 每组动物总数</td>
			<td>平均潜伏期 [d]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>未免疫</td>
			<td>P. berghei</td>
			<td>7/7</td>
			<td>4,4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mtb 感染</td>
			<td>P. berghei</td>
			<td>7/7</td>
			<td>5,5</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
<img alt="气溶胶感染实验示意图：气源性结核分枝杆菌、摄取验证、感染伯氏疟原虫的蚊子、血涂片分析。" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50829/50829fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50829/50829fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 实验流程总体示意图。 C57BL/6小鼠在Glas-Col气溶胶感染舱中暴露于含有Mtb的气溶胶液滴。气溶胶感染后一天，通过肺组织CFU分析验证Mtb的摄取情况。在Mtb感染40天后（此时小鼠体内结核病已转为慢性），动物被暴露于感染P. berghei的蚊子。为确认子孢子成功传播并监测Plasmodium感染进程，自蚊虫叮咬后第3天起，每日通过吉姆萨染色血涂片监测寄生虫血症水平。
<img alt="用于昆虫捕获的诱捕装置示意图，包含网罩、乳胶入口和滤纸。" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50829/50829fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50829/50829fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 蚊笼示意图。 感染性蚊虫被安置在类似半品脱冰淇淋纸盒的容器内。在纸盒侧面开一个小孔，用两层乳胶膜覆盖，每层乳胶膜上切有切口，形成可牢固进入的蚊虫入口。在纸盒内部底部贴有一片滤纸，用于吸收滴落的液体。冰淇淋杯顶部用网罩（尼龙网）封闭，网罩通过胶带和橡皮筋固定在纸盒上。
<img alt="疟疾感染分析；疟原虫形态的显微镜图像，随时间变化的寄生虫血症图表。" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50829/50829fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50829/50829fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 3"> 
图3. 小鼠血液中的寄生虫血症。 A) 瑞氏染色血涂片示例，显示被寄生的红细胞（比例尺，20 µm）。B) 通过每日分析吉姆萨染色血涂片监测小鼠血液中的寄生虫血症。与单纯疟原虫感染小鼠相比，共感染小鼠的寄生虫血症水平降低（n=10）；结果以均值±标准差表示；***p&lt;0.001。经许可转载自1 PLoS ONE，7(10)，e48110。
<img alt="肺部CFU分析图表；实验性细菌生长比较；显示统计学显著性。" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50829/50829fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50829/50829fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 4"> 
图 4. 肺组织中 Mtb 的检测。 C57BL/6 小鼠通过气溶胶感染 100 CFU 的 Mtb，40 天后通过蚊媒叮咬共同感染 P. berghei。A) 气溶胶感染后第 1 天，通过全肺匀浆物平板计数 CFU 以验证摄入的 Mtb 数量是否符合预期。B) 在共感染时点，通过 3 只小鼠肺组织裂解液的 CFU 分析测定细菌载量（Mtb d40/d0）。共感染后 12 天，将肺组织裂解液接种平板进行 CFU 分析，以评估 Plasmodium 共感染对 Mtb 控制的影响。注意，在与 P. berghei NK65 共感染期间，肺组织中 Mtb 数量增加。横轴标注：Mtb 感染后时间 / 共感染后时间。改编自1 PLoS ONE，7(10)，e48110，经许可。

结核病和疟疾是人类中最常见的两种感染性疾病，也是热带地区贫困人群中发病和死亡的主要原因。我们建立了一个实验模型系统，用于研究小鼠经自然感染途径同时感染疟原虫和结核分枝杆菌后，疟疾-结核共感染的结果。

由于不同类型的病原体在地理分布上存在重叠，共感染现象在自然界中普遍存在。同时发生的感染很可能会调节……

本实验的总体目标是建立一种小鼠实验模型，可用于研究结核病与疟疾共感染在体内的影响。首先通过使用吸入暴露系统，使实验动物接触含有结核分枝杆菌的感染性气溶胶颗粒，从而实现这一目标。第二步，通过肺组织的菌落形成单位（CFU）分析，验证小鼠摄入所需数量的结核分枝杆菌。气溶胶感染后一天，再过40天，将小鼠暴露于感染性蚊子，以实现疟原虫子孢子的自然传播，子孢子在蚊子吸血过程中沉积于全层皮肤下。最后一步，通过吉姆萨染色的血涂片分析，监测疟疾红细胞期寄生虫的发育情况。最终，可通过定量肺部结核分枝杆菌的负荷以及共感染动物血液中的寄生虫数量，分别确定结核病和疟疾的病程。该方法有助于回答结核病与疟疾共感染领域中的关键科学问题，例如：疟原虫共感染如何影响结核分枝杆菌感染的发病机制及其控制？本实验方案旨在研究疟原虫（odium buri）共感染对免疫功能正常C57BL/6小鼠结核分枝杆菌慢性感染阶段的影响。它也可应用于其他小鼠品系，包括基因敲除小鼠，或与其他分枝杆菌或枝孢霉属物种联合使用。首先将结核分枝杆菌置于适宜温度下复苏。使用已知CFU滴度的菌种储备液。待细胞解冻后，使用装有27号针头的1毫升注射器轻柔吹打悬液5次，以分散细菌团块，避免产生气溶胶；根据所需感染剂量，将分枝杆菌储备液适量转移至含有无菌PBS的50毫升离心管中，终体积为6毫升。随后，将实验动物 individually 放入分隔的金属网篮中，将网篮置入圆形气溶胶暴露室，并盖紧腔室盖子。将文丘里雾化器单元连接到三个不锈钢接头。用配有18号钝针的10毫升注射器吸取分枝杆菌悬液，并将注射器置于密闭转运盒中带至气溶胶室。然后取下雾化器螺帽，小心地将分枝杆菌悬液注入装置中。注意避免产生气溶胶。将注射器丢弃至含有2%Burton的锐器容器中，然后密封雾化器。当循环完成后，运行吸入装置。在打开气溶胶室之前，确认分枝杆菌悬液已完全雾化。佩戴动力送风式空气净化呼吸器头盔，然后将动物放回笼中。气溶胶感染后一天，对指定的安乐死对照动物，在二级生物安全柜内的解剖板上将其置于吸水纸上，并用70%乙醇对每只小鼠进行消毒。首先在腹部中央做一个小切口，然后将皮肤向动物头部方向拉开。接下来，使用手术剪刀打开腹部和胸腔。移除胸壁以暴露肺组织，然后将其取出。将肺组织转移至含有 2 毫升匀浆缓冲液的 15 毫升离心管中，随后使用 5 毫升注射器的推杆将组织通过 100 微米细胞筛过滤至小型培养皿中。使用带滤芯吸头的1毫升移液器反复冲洗筛子，然后将约250微升肺组织匀浆液分装至八个琼脂平板上。待平板干燥后，使用一次性涂布棒小心地将样品涂布均匀。每个平板用Perfil密封。用铝箔包裹，并于 37 摄氏度下直立孵育至少四周。通过蚊虫叮咬使疟原虫感染无感染史的小鼠或分枝杆菌感染小鼠时，将麻醉后的动物置于蚊笼的网膜上，使具感染性的蚊子能够透过膜吸血，以确保子孢子成功传播。将小鼠留在蚊笼上 10 至 15 分钟。将小鼠转移回笼中，置于纸巾上，并用纸巾覆盖以保持温暖，直至其从麻醉中苏醒。通过笼网向蚊子喷洒70%乙醇或其他消毒剂将其灭杀，并通过高压灭菌对笼子进行消毒。为监测寄生虫血症，用针头刺破每只感染动物静脉末端，采集一滴血液。在载玻片的每一端，用另一张载玻片将一滴血液沿底部载玻片长度的一半均匀推开。然后将推片翻转，用另一侧边缘制备第二张血涂片。将载玻片放入染色架中。用纯甲醇短暂固定血涂片，然后空气干燥。接着将涂片浸入吉姆萨染液中。10分钟后，将载玻片在盛有去离子水的染色缸中反复浸入和取出数次，以洗去多余的染液。最后，将载玻片置于垂直位置空气干燥。通过蚊虫叮咬使实验动物感染子孢子，可在4至5天后通过血液阶段寄生虫的存在确认感染，感染率达到100%。如表格所示，无论是在未免疫小鼠还是在感染结核分枝杆菌的小鼠中，通过蚊虫叮咬感染伯氏疟原虫（Plasmodium buri）均可在实验组内实现所有动物的一致且可重复的感染。通过比较弓首蛔虫（Toxocara）感染潜伏前期小鼠、未处理对照小鼠与结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）共感染动物，可以观察到潜伏前期略有延迟。利用吸入暴露系统使小鼠预先感染结核分枝杆菌，可成功将细菌沉积至动物肺部，且个体间变异程度相对较低。在弓首蛔虫（p burga）存在的情况下，感染的C57BL/6小鼠肺部的分枝杆菌载量有所增加。相比之下，共感染小鼠的寄生虫血症水平较单纯疟原虫感染小鼠有所降低。通过该实验流程，可对目标组织或体液进一步开展流式细胞术、PCR、ELISA或组织学技术等分析方法，以同时解析针对疟原虫和结核分枝杆菌的免疫应答及其在共感染宿主中的相互作用。切记，操作人类病原体结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）具有极高危险性，必须始终采取严格措施，避免暴露于具有传染性的气溶胶环境中。所有涉及结核分枝杆菌的实验工作都必须在适当的生物安全三级设施中进行。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

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