3.13: 酵母的转化和克隆

酵母或酿酒酵母是一种广泛使用的简单真核模式生物，用于遗传学和细胞生物学研究，可以深入了解人类细胞过程。本视频讨论了转化 - 酵母细胞对外源 DNA 的摄取。它将介绍酵母质粒、如何制备用于转化的酵母细胞、分步转化程序，并将提供该基本技术的一些应用。

在我们讨论酵母的转化之前，让我们先讨论一种用于转化的 DNA：质粒。质粒是一种小的环状双链 DNA，可以超螺旋，因此很容易穿过细胞膜上的孔。

质粒包含一个多克隆位点或 MCS，其中限制性核酸内切酶（又名"限制性内切酶"）可以切割 DNA。然后可以将用相同酶切割的目标 DNA 片段连接到 MCS 中。 质粒还包含复制起点或 ORI，它向细胞发出复制应该开始的信号。此外，质粒具有选择性标记物，允许包含质粒的酵母细胞在特定环境条件下生长。未成功掺入质粒的酵母将无法在含有选择性标记物的培养基中存活。可选择标记可以编码使耐药性的基因或编码酶的基因，这些酶使酵母菌株能够合成它们原本无法产生的氨基酸。

穿梭载体是可以在多个宿主物种中复制的质粒。例如，来自大肠杆菌的质粒可以在酵母中生长。 酵母质粒可以是非整合的或整合的，这意味着质粒要么与基因组 DNA 结合，要么保持独立。

酵母中使用了五种不同的一般类型的质粒或载体。酵母转化中最常用的两种是酵母游离型质粒或 YEp 和酵母着丝粒质粒或 YCp。这两种类型的向量都包含自主复制序列或 ARS。ARS 包含复制起点，并允许在酵母中进行染色体外复制。

有几种不同的程序可用于转化酵母，包括原生质球法、电穿孔和醋酸锂介导的转化。在本视频中，我们将重点介绍醋酸锂程序。

在这种转化方法中，带正电荷的锂阳离子中和细胞膜和质粒 DNA 上的电荷 - 添加到转化混合物中 - 与酵母的细胞壁结合，留下质粒 DNA 可供酵母细胞摄取。暴露于温度突然升高或热休克的环境中，会在细胞内外产生压力差，从而形成质粒 DNA 可以通过的孔隙。 当温度降低时，酵母细胞壁会重组，转化完成。

让我们从如何准备酵母进行转化的分步过程开始。制备酵母细胞时，必须首先从琼脂平板中挑取一个菌落，然后在酵母提取物蛋白胨葡萄糖培养基（缩写为 YPD，一种用于酵母生长的完全培养基）中扩增该菌落。

从平板中挑选菌落并置于 YPD 培养基中后，将培养物在 30 ？C 在摇床或滚轮装置上搅拌，就像您在这里看到的那样。通过离心使酵母细胞沉淀并除去上清。用所需的缓冲液或无菌水重悬沉淀的细胞。这些制备的感受态酵母细胞将用于转化过程。

一旦制备了酵母细胞，就可以通过首先制备转化混合物来进行转化。

该试剂混合物应包括：无菌蒸馏水;50% 聚乙二醇或 PEG、1M 乙酸锂、10 mg/ml 单链 DNA、质粒 DNA 和感受态酵母细胞的溶液。在开始实验之前，应通过查阅实验室的酵母转化标准方案来计算每种溶液的确切比例。

然后将混合物在 30 °C 下孵育C 30 分钟并摇晃。 溶液应混合，而不是涡旋，以确保酵母细胞不会破裂。

细胞被放置在 42 ？C 水浴 15 分钟，然后在冰上冷却 2 分钟。然后通过离心收获细胞。

将细胞重悬于双蒸水中，并接种在琼脂平板上，琼脂平板将选择所需的转化体。然后将转化板在 30 ？C 2 到 4 天，直到菌落形成。

转化程序应始终包括阳性和阴性对照板，直到它们得到优化。阳性对照应为酵母细胞悬液，质粒 DNA 位于 YPD 板上，不含任何可选标记物。这表明细胞在转化过程后是健康的。阴性对照板应为适当选择板（例如含有抗生素的板）上的酵母细胞悬液。该板应没有菌落，并显示没有污染。

酵母转化有无数种不同的应用。转化酵母的一种应用是使用酵母-双杂交系统来识别与目标蛋白质或诱饵蛋白相互作用的蛋白质。 当来自候选结合伴侣文库或猎物蛋白的质粒被转化并发生相互作用时，会释放出转录因子，该转录因子将激活报告基因，例如 β-半乳糖苷酶。当在含有 X-gal 的平板上时，报告基因会将具有相互作用的菌落变成蓝色 ？β-半乳糖苷酶的底物。

可以通过使用性循环的技术将多个缺失设计成酵母。包含报告基因和缺失基因座的单倍体细胞通过随机分类或减数分裂重组组合成一个细胞。 可选择标记用于选择已成功掺入缺失的酵母。在这种情况式细胞术用于选择表达 GFP 的细胞。

酵母可以用荧光标记的蛋白质转化，以查看突变对蛋白质-蛋白质相互作用的影响。 这篇视频文章使用荧光显微镜研究了不同突变对内吞作用所必需的蛋白质-蛋白质相互作用的影响。

您刚刚观看了有关酵母转化的 JoVEs 视频。您现在应该了解质粒的基本方面、如何制备用于转化的酵母细胞以及如何执行转化程序。一如既往，感谢您的观看！