从救援的cDNA重组新城疫病毒
2013年10月11日
新城疫病毒（NDV）已被广泛研究，在过去的几年里，以开发新的载体接种疫苗和治疗，等等。这些研究已经可能由于技术由cDNA拯救重组病毒，如那些我们在这里描述。
该程序的总体目标是从克隆的 DNA 中拯救重组新城疫病毒或 NDV。这是通过首先用编码 T 7 聚合酶的辅助病毒感染哺乳动物细胞，然后用质粒横切这些细胞，编码在 T 7 启动子控制下的病毒的最小复制机制。第二步是将转染的哺乳动物细胞与来自病毒自然宿主的禽细胞共培养。
从哺乳动物细胞中释放的新生成的 varian 将感染禽细胞进行第一轮扩增。接下来，将共培养物的上清液接种到胚胎化的鸡蛋中，以进一步生长获救的病毒，最后一步是从接种的鸡蛋中收集 LAN toic 液。最终，使用简单的血凝素国家测定法来显示 LAN 小液中 NDV 的存在以及抢救过程的成功。
通过这种方法拯救的重组病毒可以提供对影响感染的不同因素的见解，也可以用作递送抗原的载体，用于疫苗接种和抗肿瘤治疗。要在转染前一天开始分裂哺乳动物 hep 2 或 a 5 49 细胞，在 6 孔板中转染，第二天细胞密度应达到 80% 至 90% 汇合。对于要挽救的每种病毒，包括 2 到 4 个不同的孔。
还包括两个用于对照 PCA、GFP 和 PITE 的额外孔，GFP 旨在分别监测转染和 MVAT 七种感染效率。用 1 毫升加热的 PBS 洗涤细胞两次，然后用 MVA T 7 病毒感染培养的哺乳动物细胞，每个细胞感染 1 个 PFU。在 PBS 中，最终体积为 200 μL，在病毒感染孵育期间，将细胞在室温下孵育 1 小时，在制备脂肪切除术最佳溶液并预孵育 5 分钟后，按照书面文本中的说明制备转染混合物。
将 250 μL 溶液加入 DNA 管中，在室温下孵育 20 至 30 分钟，然后与 MVAT 7 孵育，通过抽吸去除病毒接种物，并替换为 DNA 脂质转染混合物。向每个培养皿中加入 1 毫升 DMEM 10%FBS。将感染的转染细胞在 37 摄氏度、5% 二氧化碳下孵育 6 至 8 小时。
然后用 1.5 毫升新鲜 DMEM 10%FBS 替换转染培养基：转染后 24 小时，可以在荧光显微镜下观察对照孔，以评估转染效率和 T 7 聚合酶活性，然后再进行感染的转染哺乳动物细胞与禽成纤维细胞的共培养。通常，每两个转染孔使用一个汇合的 100 毫米组织培养皿的鸡或鸭胚胎成纤维细胞。请务必提前做好准备。
每次救援尝试使用 100 毫米的禽细胞组织培养皿，以有效拯救病毒。DMEM 10% FBS 培养基补充有 5% elan toic 液和 30 毫摩尔氯化镁。用温热的 1 XPBS 胰蛋白酶洗涤哺乳动物细胞两次后，用 0.2 毫升 EDTA 胰蛋白酶观察细胞，直到它们分离。
将细胞重新悬浮在 1 毫升补充的 DMEM 中，并转移到 100 毫米的组织培养皿中，加入 3 毫升相同培养基。用温热的 1 XPBS 胰蛋白酶洗涤禽细胞两次后，用 1 毫升 EDTA 胰蛋白酶观察细胞，并在 37 摄氏度下孵育 1 至 2 分钟，直至细胞分离。通过添加 8 毫升制备的培养基来重新悬浮禽细胞。
然后将 4 毫升胰蛋白酶化的禽细胞添加到共培养 100 毫米组织培养皿中的哺乳动物细胞中，总体积为 8 毫升。轻轻摇动 100 毫米培养皿中的共培养细胞以确保均匀分布，然后将它们放入 37 摄氏度的培养箱中 3 到 4 天。当所有共培养的细胞都受到 MVAT 7 病毒感染引起的细胞病变效应的影响时，鸡蛋就会被感染。
此时，取出 1 毫升组织培养上清液，并将其添加到 eend DPH 管离心机中。将组织培养上清液在台式离心机中以 12， 000 RPM 的速度放置 1 分钟。为了去除细胞碎片，使用轻质验蛋盒对鸡蛋进行蜡烛照射，以查看气囊和 Alan Toic 腔之间的界面。
在界面边界上做一个标记，避免血管定位。将 70% 乙醇喷洒在鸡蛋上以建立无菌条件。轻轻地在蛋壳的标记处打一个洞。
然后使用 1 毫升注射器接种 500 微升 snat，将针头垂直直接对准 Alan Toic 腔。用融化的蜡或石蜡密封蛋壳上的缺口。将鸡蛋在 37 摄氏度下孵化 2 到 3 天。
将受感染的鸡蛋在 4 摄氏度下孵育 2 到 4 小时或过夜，以杀死鸡胚并凝固血液。用 70% 乙醇喷洒鸡蛋以保持无菌条件。用勺子小心地将鸡蛋的顶端部分敲击到气腔上。
蛋壳破裂后，用镊子取出碎片并完全暴露 LAN toic 膜。用镊子和剪刀切除耳鼻喉科膜，暴露 LAN 口腔，避免损伤血管和橡树。用刮刀小心地将胚胎向下推，并用 10 毫升移液管收集向上流动的 LAN toic 液体。
避免损坏蛋黄膜。将 LAN toic 液体转移到冰上的 15 ml 离心管中。以 1500 RPM 离心 5 分钟，澄清 LAN 溶剂。
将上清液转移到新试管中，不要干扰沉淀。将样品在 4 摄氏度下储存长达一周，直到通过 Hemagglutinin Nation 测定检查它们是否存在 NDV。来自受感染鸡蛋的 Alan Toic 液中存在病毒可以通过它们在血凝素方面的能力从宏观上确定：八个火鸡红细胞、阴性对照样品（如一个 XPBS 或未感染的 Alan Toic 液）以及阳性对照样品（如来自任何 NDV 病毒的 Al Toic 液）应始终包含在任何 HA 测定中以验证它。
要进行 HA 测定，请在 V 形底 96 孔板中每孔吸取 50 微升 1 XPBS，然后将 50 微升 LAN 乳液样品移液到板第一列的孔中。对板的其余部分进行两次连续稀释，并从孔中丢弃最后额外的 50 μL。在最后一列中，将 50 微升 0.5% 土耳其红细胞分装到每孔一个 XPBS 中，轻轻敲击板，在 4 摄氏度下孵育板 30 至 45 分钟，或直到在阴性对照孔中形成透明沉淀。
可以监测 NDV 挽救程序的早期步骤，特别是此处所示的转染效率和 MVAT 7 感染。5 49 个细胞转染 PAGs GFP 或转染 MVAT 7 并转染 P 8 GFP 组成的代表性荧光和明场图像。由 PCA 驱动的 GFP 表达是转染效率的指标，而由 P 位点驱动的 T 7 启动子驱动的 GFP 表达是 MVAT 7 感染和 T 7 聚合酶活性的对照。
图像显示转染和转染感染效率足以在禽哺乳动物共培养物和胚胎卵中进行多轮扩增后成功拯救 NDV，HA 检测中的阳性孔检测到拯救病毒的存在。NDV 通过连接红细胞诱导血凝素，从而防止它们在 V 形孔底部沉淀。因此，HA 活性的缺乏可以很容易地通过形成红细胞的红色圆形颗粒来区分，如此处在阴性对照中所示，以及从救援救援后获得的三个未知样品中得到的一个阴性结果。
看完这个视频，你应该对如何从 CDNA 中拯救重组新城疫病毒有一个很好的了解，并且重现性很高。
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概述
本文介绍了从克隆DNA中拯救重组牛瘟病毒（NDV）的程序。该方法涉及用辅助病毒感染哺乳动物细胞，并用病毒复制的质粒转染它们。
关键研究组成部分
科学领域
- 病毒学
- 疫苗开发
- 基因治疗
背景
- 牛瘟病毒（NDV）是鸟类中的重要病原体。
- 近期研究集中在开发NDV作为疫苗和治疗的载体。
- 从cDNA中拯救重组病毒对这些应用至关重要。
- NDV拯救技术近年来有了显著进展。
研究目的
- 提供从克隆DNA中拯救NDV的详细方法。
- 促进基于NDV的载体开发用于治疗。
- 加强对NDV生物学及其在研究中应用的理解。
使用的方法
- 用编码T7聚合酶的辅助病毒感染哺乳动物细胞。
- 用包含NDV最小复制机制的质粒转染细胞。
- 转染的哺乳动物细胞与鸟类细胞共培养。
- 用上清液接种鸡胚卵以扩增病毒。
主要结果
- 通过血凝试验证明成功拯救了重组NDV。
- 在鸟类细胞中扩增NDV证实了该方法的有效性。
- 该程序允许产生NDV以供进一步研究和应用。
- 该方法为涉及NDV的未来研究提供了框架。
结论
- 所描述的方法有效地从克隆DNA中拯救NDV。
- 这种技术可用于疫苗开发和治疗研究。
- 进一步的研究可以在这种方法基础上探索NDV的应用。
常见问题
Executive Industry Relevance
Rescuing recombinant Newcastle disease virus from cDNA enables the generation of modified viral vectors for antigen delivery in vaccine and therapeutic development. This reverse genetics approach supports target validation by allowing precise genetic manipulation to interrogate viral pathogenesis and immune modulation. The method provides a scalable platform for producing recombinant viruses to assess antigen expression and immunogenicity in preclinical models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables therapeutic hypothesis interrogation through precise genetic modification of NDV to study infection mechanisms and antigen presentation.
- Operational Value: Supports biological de-risking by generating isogenic viral variants to dissect host-pathogen interactions and vector safety profiles.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces standardized viral stocks for consistent antigen expression, enabling reliable evaluation of vaccine candidates in vitro and in vivo.
- Operational Value: Facilitates assay readiness through quantifiable outputs like hemagglutination titers, supporting reproducibility across discovery workflows.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Provides disease-relevant systems by rescuing viruses that replicate in avian cells and embryonated eggs, supporting translational continuity from discovery to preclinical evaluation.
- Operational Value: Enables risk-adjusted advancement decisions by allowing empirical assessment of vector stability, antigen expression levels, and immunogenic potential prior to GLP studies.
Pipeline & Workflow Integration
The rescue method fits within the early discovery continuum, enabling lead identification through vector optimization and supporting preclinical work by generating material for efficacy and safety assessment.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by allowing insertion of antigen-encoding transcriptional units to evaluate immune responses and pathogenicity.
- Screening: Delivers assay-ready virus stocks with quantifiable hemagglutination activity, enabling standardized comparison of vector constructs.
- Analytics: Generates measurable outputs such as viral titers and hemagglutination units, facilitating data-driven decisions on vector performance.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical validation through amplification in natural host systems, ensuring biological relevance of rescued virus.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for generating diverse NDV-based vectors, reducing redundant optimization across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence by enabling mechanistic de-risking of viral vectors through defined genetic modifications.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility via a well-defined rescue protocol with quantifiable endpoints.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early insight into vector functionality and antigen delivery efficiency.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by enabling empirical evaluation of multiple vector designs before resource-intensive development.
Implementation Considerations
- Requires expertise in virology, molecular cloning, and cell culture techniques for successful transfection and virus rescue.
- Dependent on access to embryonated chicken eggs, avian fibroblast cultures, and biosafety-level-appropriate infrastructure for virus handling.
- Necessitates standardization of transfection efficiency and helper virus infection across mammalian and avian cell systems.
- Involves adaptation considerations when modifying the NDV genome, as insert size and transcriptional unit placement can affect virus rescue efficiency.
- Practical limitations include the need for biosafety containment and the dependency on embryonated egg systems for high-titer virus production.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:37
Infection of Mammalian Cells with the Recombinant Modified Vaccinia Ankara Virus Expressing the Bacteriophage T7 RNA Polymerase (MVA-T7)
2:40
Transfection of Mammalian Cells
3:48
Co-culture of Mammalian Cells with Avian Cells
6:31
Harvest of Allentoic Fluid from Infected Chicken Embryonated Eggs
9:03
Results: Transfection and MVA-T7 Infection Efficiencies and Hemagglutination Assay
10:33
Conclusion
5:22
Infection of Chicken Embryonated Eggs
7:52
Hemagglutination (HA) Assay
