Name: 从救援的cDNA重组新城疫病毒 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-11T23:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: 学习从克隆DNA中拯救重组新城疫病毒的方法，利用辅助病毒和质粒转染哺乳动物细胞，再与禽类细胞共培养扩增。该技术为疫苗开发和基因治疗研究提供重要工具。

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作者谨向Peter Palese博士和Adolfo García-Sastre博士实验室的历任及现任成员致谢，感谢他们对新城疫病毒反向遗传学技术的建立以及提供的技术支持。AG-S实验室的新城疫病毒研究部分由美国国家过敏与传染病研究所（NIAD）资助项目R01AI088770以及美国国土安全部科学与技术新兴及人畜共患动物疾病卓越中心（CEEZAD，资助编号2010-ST-061-AG001）资助。LM-S实验室的研究由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目RO1 AI077719、R21NS075611-01、R03AI099681-01A1、美国国家过敏与传染病研究所流感研究与监测卓越中心（HHSN266200700008C）以及罗切斯特大学生物防御免疫建模中心（HHSN272201000055C）资助。

1. 哺乳动物细胞的准备（图4A，第1天）
转染前一天，在6孔板中接种分裂的HEp-2或A549细胞。次日细胞密度应达到80%-90%融合度。通常，一个完全融合的100 mm培养皿可分种至8个孔（每孔约1 × 106个细胞）。每种需要拯救的病毒应设置2-4个不同的孔，同时额外设置2个对照孔，分别用于转染效率和MVA-T7感染效率的监测，即pCAGGs-GFP和pCITE-GFP18。
2. 用表达噬菌体T7 RNA聚合酶的重组改良安卡拉痘苗病毒（MVA-T7）感染哺乳动物细胞（图4A，第2天）
<ol>
	<li>将 PBS 1x/BA/PS 和培养基预热至 37 °C。</li>
	<li>用 1 ml PBS 1x/BA/PS 洗涤细胞两次。</li>
	<li>在室温下，用 MVA-T7 病毒以感染复数（moi）为 1 pfu/细胞的条件，在 200 μl PBS/BA/PS 最终体积中感染培养的哺乳动物细胞，孵育 1 小时。</li>
	<li>在病毒感染孵育期间，按步骤 3 所述制备转染混合物。</li>
</ol>
3. 哺乳动物细胞转染（图4A，第2天）
<ol>
	<li>脂质体转染试剂的制备：每次拯救实验取1-2 μg LPF2000与250 μl OptiMEM混合，室温孵育5分钟。</li>
	<li>DNA的制备：在50 μl OptiMEM中为每个拯救实验配制质粒混合物。每管中加入0.4 μg pTM1-NP、0.2 μg pTM1-P和0.2 μg pTM1-L。向每管中再加入1 μg待拯救的新城疫病毒全长cDNA克隆。同时准备两个对照转染组，一组加入2 μg pCAGGs-GFP（用于检测转染效率），另一组加入2 μg pCITE-GFP（用于检测MVA-T7驱动的表达）。</li>
	<li>当LPF2000与OptiMEM的混合液已室温预孵育5分钟后（步骤3.1），向DNA管中加入250 μl该溶液（步骤3.2），室温孵育20-30分钟。</li>
	<li>与MVA-T7孵育后，吸除病毒接种液，加入DNA-LPF2000转染混合液（步骤3.3）。</li>
	<li>每皿加入1 ml含10%胎牛血清和青霉素-链霉素的DMEM培养基。</li>
	<li>将感染/转染的细胞在37 °C、5% CO2条件下孵育6-8小时（或过夜），然后更换为1.5 ml新鲜的含10%胎牛血清和青霉素-链霉素的DMEM培养基。</li>
	<li>转染后24小时，可在荧光显微镜下观察对照孔，以评估转染效率（pCAGGs-GFP）和T7聚合酶活性（pCITE-GFP）（图5A）。随后按以下方法将感染/转染的细胞与禽类成纤维细胞进行共培养。</li>
</ol>
4. 哺乳动物细胞与禽类细胞的共培养（图4A，第3天）
通常，每两个转染孔需要使用一个100 mm的鸡胚成纤维细胞（CEFs）或鸭胚成纤维细胞（DEFs）培养皿，且细胞需达到汇合状态。请提前准备好足够数量的100 mm禽类细胞培养皿，以满足所有病毒拯救实验的需求。为了高效拯救病毒，DMEM 10% FBS/PS培养基中需额外添加5%的羊水液和30 mM MgCl2。此时，即感染后24小时（24 hr p.i.），由于MVA-T7感染，哺乳动物细胞可能已开始出现细胞病变效应（CPE），如图5A所示。
<ol>
	<li>将1× PBS和培养基预热至37 °C。</li>
	<li>用 1 ml 1× PBS 洗涤哺乳动物细胞 2 次。</li>
	<li>用0.2 ml EDTA-胰蛋白酶消化哺乳动物细胞，直至细胞脱落。将细胞重悬于1 ml含10% FBS/PS、5%尿囊液和30 mM MgCl₂的DMEM培养基中2 转移至一个100 mm的组织培养皿中，加入3 ml相同的培养基。</li>
	<li>用 4 ml 1× PBS 洗涤禽类细胞两次。</li>
	<li>用1 ml EDTA-胰蛋白酶消化禽类细胞，在37 °C孵育1–2分钟，直至细胞脱落。加入8 ml含10%胎牛血清/青霉素-链霉素的DMEM培养基、5%尿囊液和30 mM MgCl₂重悬细胞2 将4 ml胰蛋白酶消化的细胞加入共培养的100 mm组织培养皿中的哺乳动物细胞中，总体积为8 ml（4 ml哺乳动物细胞，4 ml禽类细胞）。</li>
	<li>轻轻用手晃动100 mm培养皿中的共培养细胞，使其分布均匀，然后将培养皿置于37 °C培养箱中孵育3至4天。哺乳动物细胞与禽类细胞共培养后3或4天接种鸡胚的标准，取决于此时出现的细胞病变效应程度（如细胞变圆、死亡、从培养皿表面脱落等） 等等在MVA-T7病毒感染中观察到。</li>
</ol>
5. 鸡胚感染（图4A，第6-7天）
<ol>
	<li>在哺乳动物细胞与禽类细胞共培养3-4天后，移除1 ml组织培养上清液，并加入至一个Eppendorf管中。</li>
	<li>将组织培养上清液在台式离心机中以12,000 rpm离心1分钟，以去除细胞碎片。</li>
	<li>使用光照检卵箱对鸡蛋进行照卵，观察气室与尿囊腔之间的界面。在避开血管分布的位置标记界面边界。用70%乙醇喷洒鸡蛋表面以建立无菌条件。在已标记的位置轻轻于蛋壳上打孔，使用胰岛素注射器（1 ml）接种500 μl上清液，将针头垂直并直接插入尿囊腔。（图4B）。</li>
	<li>用熔化的石蜡或石蜡密封蛋壳上的切口。</li>
	<li>将鸡蛋在37 °C下孵育2-3天。</li>
</ol>
6. 收集感染的鸡胚尿囊液（图4A，第8-10天）
<ol>
	<li>将感染的鸡蛋在 4 °C 条件下孵育 2-4 小时或过夜，以杀死鸡胚并使血液凝固。</li>
	<li>用 70% 乙醇喷洒鸡蛋表面（以维持无菌条件）。</li>
	<li>用勺子轻轻敲击鸡蛋顶端的气室部位。待蛋壳破裂后，用镊子移除碎片，并完全暴露尿囊膜。</li>
	<li>用镊子和剪刀小心剪除尿囊膜以暴露尿囊腔，注意避免损伤血管和卵黄。</li>
	<li>用刮勺轻轻下压鸡胚，用 10 ml 移液管收集上涌的尿囊液（每枚鸡蛋 8-12 ml）。注意避免损伤卵黄膜。将尿囊液转移至预冷的 15 ml 离心管中（每枚鸡蛋使用一管），并置于冰上。</li>
	<li>将尿囊液在 1,500 rpm 条件下离心 5 分钟以澄清。将上清液转移至新管中，注意不要扰动沉淀。</li>
	<li>将样品在 4 °C 保存最多 1 周，随后通过血凝试验检测新城疫病毒（NDV）的存在。</li>
</ol>
7. 血凝（HA）试验
可通过观察感染鸡蛋的尿囊液是否能够凝集火鸡红细胞（RBC）来宏观判断其中是否存在病毒。对于新城疫病毒（NDV），通常每毫升需要约106个蚀斑形成单位（pfu）才能在血凝（HA）试验中产生阳性信号。HA试验在V型底96孔板中进行。每次HA试验均应包含阴性对照（1×PBS、未感染的尿囊液）和阳性对照（任何NDV病毒的尿囊液），以验证试验的有效性。进行HA试验的步骤如下：
<ol>
	<li>在V型底96孔板的每个孔中加入50 μl 1× PBS。</li>
	<li>将50 μl尿囊液样本加入该板第一列的各孔中，然后在其余各列进行2倍系列稀释，并从最后一列的孔中弃去多余的50 μl。</li>
	<li>向每孔中加入50 μl含0.5%火鸡红细胞的1× PBS。轻轻敲击振荡平板。</li>
	<li>将平板置于4 °C（或冰上）孵育30–45分钟，或直至阴性对照孔中形成清晰的沉淀。</li>
</ol>

<ol><li>Lamb, R. A., Parks, G. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLamb%2C+RA+%22Fields+Virology%22">Fields Virology</a>. Howley, P. H., Knipe, D. M. , Lippincott Williams & Wilkins. 1647-1689 (2007).</li>
<li>Schnell, M. J., Mebatsion, T., Conzelmann, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infectious+rabies+viruses+from+cloned+cDNA%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Infectious rabies viruses from cloned cDNA.</a> EMBO J. 13, 4195-4203 (1994).</li>
<li>Peeters, B. P., de Leeuw, O. S., Koch, G., Gielkens, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rescue+of+Newcastle+disease+virus+from+cloned+cDNA%3A+evidence+that+cleavability+of+the+fusion+protein+is+a+major+determinant+for+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Rescue of Newcastle disease virus from cloned cDNA: evidence that cleavability of the fusion protein is a major determinant for virulence.</a> J. Virol. 73, 5001-5009 (1999).</li>
<li>Romer-Oberdorfer, A., Mundt, E., Mebatsion, T., Buchholz, U. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+recombinant+lentogenic+Newcastle+disease+virus+from+cDNA%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">Generation of recombinant lentogenic Newcastle disease virus from cDNA.</a> J. Gen. Virol. 80 (Pt 11), 2987-2995 (1999).</li>
<li>Nakaya, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+Newcastle+disease+virus+as+a+vaccine+vector%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Recombinant Newcastle disease virus as a vaccine vector.</a> J. Virol. 75, 11868-11873 (2001).</li>
<li>Zamarin, D., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncolytic+Newcastle+disease+virus+for+cancer+therapy%3A+old+challenges+and+new+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Oncolytic Newcastle disease virus for cancer therapy: old challenges and new directions.</a> Future Microbiol. 7, 347-367 (2012).</li>
<li>Park, M. S., Garcia-Sastre, A., Cros, J. F., Basler, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Newcastle+disease+virus+V+protein+is+a+determinant+of+host+range+restriction%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Newcastle disease virus V protein is a determinant of host range restriction.</a> J. Virol. 77, 9522-9532 (2003).</li>
<li>Park, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Newcastle+disease+virus+%28NDV%29-based+assay+demonstrates+interferon-antagonist+activity+for+the+NDV+V+protein+and+the+Nipah+virus+V%2C+W%2C+and+C+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Newcastle disease virus (NDV)-based assay demonstrates interferon-antagonist activity for the NDV V protein and the Nipah virus V, W, and C proteins.</a> J. Virol. 77, 1501-1511 (2003).</li>
<li>Zamarin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+oncolytic+properties+of+recombinant+newcastle+disease+virus+through+antagonism+of+cellular+innate+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Enhancement of oncolytic properties of recombinant newcastle disease virus through antagonism of cellular innate immune responses.</a> Mol. Ther. 17, 697-706 (2009).</li>
<li>Vigil, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+reverse+genetics+to+enhance+the+oncolytic+properties+of+Newcastle+disease+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Use of reverse genetics to enhance the oncolytic properties of Newcastle disease virus.</a> Cancer Res. 67, 8285-8292 (2007).</li>
<li>Swayne, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+paramyxovirus+type+1-avian+influenza-H7+virus+as+a+vaccine+for+protection+of+chickens+against+influenza+and+Newcastle+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Avian+Dis%22%5BJournal%5D)">Recombinant paramyxovirus type 1-avian influenza-H7 virus as a vaccine for protection of chickens against influenza and Newcastle disease.</a> Avian Dis. 47, 1047-1050 (2003).</li>
<li>Park, M. S., Steel, J., Garcia-Sastre, A., Swayne, D., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+viral+vaccine+constructs+with+dual+specificity%3A+avian+influenza+and+Newcastle+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Engineered viral vaccine constructs with dual specificity: avian influenza and Newcastle disease.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 8203-8208 (2006).</li>
<li>Carnero, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+human+immunodeficiency+virus+gag+expression+by+newcastle+disease+virus+vectors+for+the+induction+of+potent+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Optimization of human immunodeficiency virus gag expression by newcastle disease virus vectors for the induction of potent immune responses.</a> J. Virol. 83, 584-597 (2009).</li>
<li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+type+I+interferon+secretion+through+recombinant+Newcastle+disease+virus+expressing+measles+virus+hemagglutinin+stimulates+antibody+secretion+in+the+presence+of+maternal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Induction of type I interferon secretion through recombinant Newcastle disease virus expressing measles virus hemagglutinin stimulates antibody secretion in the presence of maternal antibodies.</a> J. Virol. 85, 200-207 (2011).</li>
<li>DiNapoli, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Newcastle+disease+virus%2C+a+host+range-restricted+virus%2C+as+a+vaccine+vector+for+intranasal+immunization+against+emerging+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Newcastle disease virus, a host range-restricted virus, as a vaccine vector for intranasal immunization against emerging pathogens.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 9788-9793 (2007).</li>
<li>Martinez-Sobrido, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protection+against+respiratory+syncytial+virus+by+a+recombinant+Newcastle+disease+virus+vector%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Protection against respiratory syncytial virus by a recombinant Newcastle disease virus vector.</a> J. Virol. 80, 1130-1139 (2006).</li>
<li>Bukreyev, A., Collins, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Newcastle+disease+virus+as+a+vaccine+vector+for+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Newcastle disease virus as a vaccine vector for humans.</a> Curr. Opin. Mol. Ther. 10, 46-55 (2008).</li>
<li>Martinez-Sobrido, L., Zuniga, E. I., Rosario, D., Garcia-Sastre, A., de la Torre, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+the+type+I+interferon+response+by+the+nucleoprotein+of+the+prototypic+arenavirus+lymphocytic+choriomeningitis+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of the type I interferon response by the nucleoprotein of the prototypic arenavirus lymphocytic choriomeningitis virus.</a> J. Virol. 80, 9192-9199 (2006).</li>
<li>Jennings, S., Martinez-Sobrido, L., Garcia-Sastre, A., Weber, F., Kochs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thogoto+virus+ML+protein+suppresses+IRF3+function%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Thogoto virus ML protein suppresses IRF3 function.</a> Virology. 331, 63-72 (2005).</li>
<li>Kochs, G., Garcia-Sastre, A., Martinez-Sobrido, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+anti-interferon+actions+of+the+influenza+A+virus+NS1+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Multiple anti-interferon actions of the influenza A virus NS1 protein.</a> J. Virol. 81, 7011-7021 (2007).</li>
<li>Munoz-Jordan, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+alpha%2Fbeta+interferon+signaling+by+the+NS4B+protein+of+flaviviruses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of alpha/beta interferon signaling by the NS4B protein of flaviviruses.</a> J. Virol. 79, 8004-8013 (2005).</li>
<li>Cardenas, W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ebola+virus+VP35+protein+binds+double-stranded+RNA+and+inhibits+alpha%2Fbeta+interferon+production+induced+by+RIG-I+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Ebola virus VP35 protein binds double-stranded RNA and inhibits alpha/beta interferon production induced by RIG-I signaling.</a> J. Virol. 80, 5168-5178 (2006).</li>
<li>Mibayashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+retinoic+acid-inducible+gene+I-mediated+induction+of+beta+interferon+by+the+NS1+protein+of+influenza+A+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of retinoic acid-inducible gene I-mediated induction of beta interferon by the NS1 protein of influenza A virus.</a> J. Virol. 81, 514-524 (2007).</li>
<li>Kopecky-Bromberg, S. A., Martinez-Sobrido, L., Frieman, M., Baric, R. A., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Severe+acute+respiratory+syndrome+coronavirus+open+reading+frame+%28ORF%29+3b%2C+ORF+6%2C+and+nucleocapsid+proteins+function+as+interferon+antagonists%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Severe acute respiratory syndrome coronavirus open reading frame (ORF) 3b, ORF 6, and nucleocapsid proteins function as interferon antagonists.</a> J. Virol. 81, 548-557 (2007).</li>
<li>Rose, K. M., Elliott, R., Martinez-Sobrido, L., Garcia-Sastre, A., Weiss, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+coronavirus+delays+expression+of+a+subset+of+interferon-stimulated+genes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Murine coronavirus delays expression of a subset of interferon-stimulated genes.</a> J. Virol. 84, 5656-5669 (2010).</li>
<li>Roth-Cross, J. K., Martinez-Sobrido, L., Scott, E. P., Garcia-Sastre, A., Weiss, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+the+alpha%2Fbeta+interferon+response+by+mouse+hepatitis+virus+at+multiple+levels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of the alpha/beta interferon response by mouse hepatitis virus at multiple levels.</a> J. Virol. 81, 7189-7199 (2007).</li>
<li>Andersson, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crimean-Congo+hemorrhagic+fever+virus+delays+activation+of+the+innate+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Virol%22%5BJournal%5D)">Crimean-Congo hemorrhagic fever virus delays activation of the innate immune response.</a> J. Med. Virol. 80, 1397-1404 (2008).</li>
<li>Lawson, N. D., Stillman, E. A., Whitt, M. A., Rose, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+vesicular+stomatitis+viruses+from+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Recombinant vesicular stomatitis viruses from DNA.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 4477-4481 (1995).</li>
<li>Kato, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation+of+Sendai+virus+multiplication+from+transfected+cDNA+or+RNA+with+negative+or+positive+sense%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Cells%22%5BJournal%5D)">Initiation of Sendai virus multiplication from transfected cDNA or RNA with negative or positive sense.</a> Genes Cells. 1, 569-579 (1996).</li>
<li>Durbin, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery+of+infectious+human+parainfluenza+virus+type+3+from+cDNA%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Recovery of infectious human parainfluenza virus type 3 from cDNA.</a> Virology. 235, 323-332 (1997).</li>
<li>Zhao, H., Peeters, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+Newcastle+disease+virus+as+a+viral+vector%3A+effect+of+genomic+location+of+foreign+gene+on+gene+expression+and+virus+replication%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">Recombinant Newcastle disease virus as a viral vector: effect of genomic location of foreign gene on gene expression and virus replication.</a> J. Gen. Virol. 84, 781-788 (2003).</li>
<li>Kozak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((At+least+six+nucleotides+preceding+the+AUG+initiator+codon+enhance+translation+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">At least six nucleotides preceding the AUG initiator codon enhance translation in mammalian cells.</a> J. Mol. Biol. 196, 947-950 (1987).</li>
<li>Calain, P., Roux, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+rule+of+six%2C+a+basic+feature+for+efficient+replication+of+Sendai+virus+defective+interfering+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">The rule of six, a basic feature for efficient replication of Sendai virus defective interfering RNA.</a> J. Virol. 67, 4822-4830 (1993).</li>
<li>Wyatt, L. S., Moss, B., Rozenblatt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication-deficient+vaccinia+virus+encoding+bacteriophage+T7+RNA+polymerase+for+transient+gene+expression+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Replication-deficient vaccinia virus encoding bacteriophage T7 RNA polymerase for transient gene expression in mammalian cells.</a> Virology. 210, 202-205 (1995).</li>
<li>Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+selection+for+high-expression+transfectants+with+a+novel+eukaryotic+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector.</a> Gene. 108, 193-199 (1991).</li>
<li>Moss, B., Elroy-Stein, O., Mizukami, T., Alexander, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Product+review.+New+mammalian+expression+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Product review. New mammalian expression vectors.</a> Nature. 348, 91-92 (1990).</li>
<li>Conzelmann, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+genetics+of+mononegavirales%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Top.+Microbiol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Reverse genetics of mononegavirales.</a> Curr. Top. Microbiol. Immunol. 283, 1-41 (2004).</li>
</ol>

Adolfo García-Sastre 是拥有多项关于重组新城病病毒专利的发明人，这些专利归属于西奈山伊坎医学院。

为了成功拯救新城疫病毒（NDV），需要考虑多个因素以获得良好的结果。首先，所使用的全长cDNA构建体必须经过合理设计，以确保外源基因/修饰能够功能性地整合到NDV基因组中。这意味着，如上所述：（i）在必要时需添加适当的基因终止（GE）、基因间区（IG）和基因起始（GS）序列；（ii）外源基因内部不应含有潜在的GE或GS序列；（iii）全长重组基因组必须符合&#34;六的规则&#34;。
在拯救过程中，质粒制备的质量、MVA-T7 病毒储备液以及细胞的正常培养至关重要。大多数情况下，使用标准的质粒大提纯化方法即可满足要求，但对于因转基因片段过大或性质特殊而导致较难克隆和拯救的情况，可通过氯化铯密度梯度离心法进一步纯化DNA以提高效率。使用Lipofectamine进行转染通常足以实现成功的病毒拯救，尽管也可采用其他转染方法如核转染。无论采用何种方法，不同质粒之间的转染比例必须严格保持（NP、P、L、pNDV的比例分别为0.4:0.2:0.2:1）。由于病毒拯救过程较为繁琐且具有一定的随机性，每种待拯救的构建体应至少转染2-4个不同的孔，并应对同一构建体的不同克隆进行检测分析。...

新城疫病毒（Newcastle disease virus, NDV）是一种属于Avulavirus属的禽副黏病毒1，是一种具有重要经济意义的人畜共患病原体，因此在全球范围内受到广泛研究和监测，可对世界各地的家禽养殖业造成严重影响。尽管NDV并非人类致病原，但它在兽医学领域之外也得到了深入研究，既作为副黏病毒的模型，也因其显著且天然的溶瘤特性而备受关注6。对NDV的研究极大地受益于单股不分节段负链RNA病毒反向遗传学技术的发展，该技术最初由Conzelmann及其同事在狂犬病病毒中首次报道2。自那时以来，多种携带外源基因或对其野生型基因组进行修饰的基因改造NDV已被广泛研究。这些重组病毒的研究对于鉴定NDV以及其他重要人类病原体（如甲型流感病毒7或新发的尼帕病毒8）的不同毒力因子至关重要。此外，已有大量研究探索利用这些技术增强NDV固有的抗肿瘤活性6,9,10，主要是通过提高病毒的免疫刺激特性来实现。重组NDV的另一重要研究方向是开发针对其他病毒性疾病的疫苗候选物，例如流感5,11,12、HIV13、麻疹14、SARS15以及呼吸道合胞病毒（RSV）引起的疾病16。NDV具备多种显著优势，包括人类群体中无预先存在的免疫力、外源基因插入片段的稳定性、缺乏重组活性，以及总体较高的安全性，再加上前述的天然免疫刺激特性17。值得注意的是，重组二价疫苗在家禽中的潜在应用可同时预防NDV和高致病性禽流感病毒11,12，这可能是减少后者从野生动物传播至家养动物的有效途径，从而也有助于防止令人担忧的禽流感发生跨物种传播至人类。最后，表达报告基因的NDV已被用于评估先天免疫反应，以及鉴定多种病毒编码的干扰素拮抗蛋白18-27。
重组非分段负链RNA病毒的拯救过程，其基本原理是通过将编码最小感染性分子机器（即核糖核蛋白复合物，RNP）的cDNA转染至生产细胞中，人为强制启动病毒的复制周期（图2）。RNP由病毒聚合酶（P蛋白和L蛋白）、核蛋白（NP）以及病毒全长的抗基因组RNA组成。这种RNA+抗基因组是生成互补RNA-基因组所需的模板，后者与RNP中的其他蛋白结合后，可重构出与天然病毒在感染时释放到细胞质中的具有相同感染能力的复合物（图2A）。自此步骤之后，病毒生命周期可自然进行，从而产生包裹了修饰后基因组的重组病毒颗粒（图2B）。值得注意的是，若转染的是基因组cDNA而非抗基因组cDNA，病毒拯救效率将显著降低甚至完全丧失2,28-30。即使转染抗基因组cDNA，重组RNA在转染细胞中被包装进RNP的效率也可能非常低。因此，新城疫病毒（NDV）的拯救方案通常包括多个扩增步骤，即将最初转染细胞释放的少量病毒颗粒与易感细胞共培养，和/或接种于鸡胚中进行增殖，以实现病毒扩增。
在拯救病毒之前，可以通过标准的克隆操作对cDNA进行改造，以产生所需的修饰。虽然通过这种方法可直接实现对病毒不同基因产物及调控序列的特异性突变，但许多已发表的涉及重组新城疫病毒（NDV）的研究都需要向NDV基因组中插入一个新的转录单元。与其他副黏病毒科成员类似，NDV基因组将八种不同的蛋白质编码在六个转录单元中，这些转录单元的表达水平取决于其相对于3'端的位置，呈递减梯度分布，这对病毒生命周期至关重要1。因此，必须谨慎选择新转录单元在基因组中的插入位置，以在转基因表达水平与病毒复制能力受损之间达到平衡。目前最常用的插入位点位于P基因和M基因之间，尽管其他位点也已被尝试过13,31。
无论插入片段为何，将片段克隆至NDV cDNA中均需遵循若干规则，以构建可拯救的重组病毒：（i）任何拟插入NDV基因组的新基因，必须置于病毒RNA依赖性RNA聚合酶识别的适当信号控制之下。这些序列需添加至新的开放阅读框（ORF）上游，以便聚合酶识别前一个基因的终止信号（GE）和新转基因的起始信号（GS），二者之间由单个核苷酸的基因间区（IG）分隔。建议同时添加有效的Kozak（K）序列，以增强真核核糖体的翻译效率，从而提高外源蛋白的表达水平32；（ii）与大多数副黏病毒科（Paramyxoviridae）成员相似，NDV的有效复制依赖于其基因组长度为6的倍数33；因此，对NDV的任何插入均须遵循这一&#34;六倍规则&#34;。如有必要，可在新ORF下游添加所需的额外核苷酸；（iii）应检查转基因序列中是否存在类似GE和GS的序列，此类序列可能影响病毒拯救效率、转基因表达和/或病毒活性。若存在此类序列，须通过沉默突变予以去除。按照上述规则构建全长重组cDNA，是高效制备基因修饰NDV的第一步，具体步骤如下所述。
该系统中所有DNA构建体均由T7 RNA聚合酶启动子控制（图3）。这种细胞质聚合酶通过共感染重组改良安卡拉痘苗病毒（MVA-T7）以反式方式提供34。图3A显示pNDV-B1质粒，其编码全长抗基因组cDNA5。图3B显示编码NP、P和L开放阅读框（ORFs）的pTM1质粒。作为对照，使用pCITE-GFP质粒，其在T7启动子下编码绿色荧光蛋白（Green Fluorescent Protein, GFP）；以及pCAGGs GFP18质粒，其在鸡β-肌动蛋白启动子下编码相同的开放阅读框35。本方案中，我们展示了从弱毒株NDV Hitchner B1的cDNA中拯救重组NDV的实验流程5（图4）。

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>CORNING Cellgro</td><td>10-013-CV</td><td>任何供应商</td></tr><tr><td>OptiMEM</td><td>GIBCO</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 (LPF2000)</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>35% 牛血清白蛋白（BA）</td><td>Sigma</td><td>232-936-2</td><td>任何供应商</td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA</td><td>CORNING Cellgro</td><td>25-052-CI</td><td>任何供应商</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素（PS）100倍浓缩液</td><td>CORNING Cellgro</td><td>30-002-CI</td><td>任何供应商</td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Hyclone</td><td>SH30070.03</td><td>任何供应商</td></tr><tr><td colspan="4"> &lt;p&gt;&lt;strong&gt;细胞系&lt;/strong&gt;&lt;br/&gt; A549 细胞（目录号 CRL-185）、HEp-2 细胞（目录号 CRL-185）、鸡胚成纤维细胞（目录号 CRL-12203）和鸭胚成纤维细胞（目录号 CCL-141）可从美国模式培养物集存库（ATCC，10801 University Boulevard, Manassas, VA. 20110-2209 USA）获得。所有细胞系均在 37 &amp;deg;C 含 5% CO₂ 的培养箱&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 在含10% FBS、1% PS的DMEM中&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;鸡胚蛋&lt;/strong&gt;&lt;br/&gt; 受精鸡胚可从美国康涅狄格州北富兰克林诺斯富兰克林32号公路106号富兰克林公地（邮编06254）查尔斯河实验室公司特定病原体阴性禽类供应部（SPAFAS）禽类产品与服务部获取，并于37 &amp;deg;C. 使用照蛋器评估胚胎的存活情况。当鸡蛋发育至8-10日龄时进行感染。感染及收获尿囊液均在无菌条件下进行。所有鸡蛋在实验结束后均按照标准实验室生物安全规程进行高压灭菌后丢弃。&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;鸡红细胞（RBC）&lt;/strong&gt;&lt;br/&gt; 鸡红细胞可从 Truslow Farms（201 Valley Road, Chestertown, Md 21620, USA）购买，并在 4 ℃ 保存 &amp;deg;C. 准备血凝（HA）试验用红细胞（RBC）：取5 ml商品化红细胞储备液，加入45 ml 1×磷酸盐缓冲液（PBS），于50 ml锥形管中混匀。在1,000 rpm转速下离心5分钟，小心弃去上清液。将沉淀的红细胞用1×PBS按1:1,000比例稀释，终浓度为0.5–1.0%。洗涤后的红细胞可于4℃保存 &amp;deg;持续数天。&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;质粒&lt;/strong&gt;&lt;br/&gt; 质粒制备采用任何市售的质粒大提试剂盒，按照生产商提供的说明进行&amp;#039;s 指示，用 ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;0 至最终浓度为 1 &amp;mu;克/&amp;mu;l，并于 -20 保存 &amp;deg;C. 通过在260 nm和280 nm处进行分光光度法测定DNA浓度和纯度。260/280比值高于1.8的样品被视为符合拯救实验的质量要求。质粒DNA的质量还常规通过琼脂糖凝胶电泳进行二次验证。&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;病毒&lt;/strong&gt;&lt;br/&gt; 用于拯救 lentogenic 型新城疫病毒株 Hitchner B1 的所述方案可在生物安全等级（BSL）2 条件下进行。表达 T7 RNA 聚合酶的修饰安卡拉痘苗病毒（MVA-T7）已有描述&lt;sup&gt;34&lt;/sup&gt; 并由 Bernard Moss 博士提供。该病毒在鸡胚成纤维细胞融合单层中培养，并在哺乳动物（A549 或 HEp-2）细胞中进行滴定。NDV 毒种在受精鸡胚中增殖，通过免疫荧光法（IFA）使用针对纯化病毒颗粒制备的多克隆血清进行滴定。所有受污染的材料应按照标准生物安全程序进行安全灭菌和处理。&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;组织培养基与溶液：&lt;/strong&gt;&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;DMEM 10% FBS 1% PS：&lt;/strong&gt; 杜尔贝科&amp;#039;改良的伊格尔&amp;#039;s 培养基（DMEM），添加 10% 胎牛血清（FBS）和青霉素/链霉素（P/S）：445 ml DMEM，50 ml 热灭活 FBS，5 ml 100 倍浓度的商品化 P/S 溶液。4 ℃ 保存 &amp;deg;C.&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;10倍磷酸盐缓冲液（PBS）：&lt;/strong&gt; 80 g NaCl，2 g KCl，11.5 g Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;高通量筛选&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;.7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, 2 g KH₂PO₄&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;. 加入ddH₂O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;加水至1 L，调节pH至7.3，高压灭菌，室温保存。&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;1× PBS：&lt;/strong&gt; 用 ddH₂O 将 10x PBS 按 1:10 比例稀释&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O. 高压灭菌，室温保存。&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;100x Ca/Mg：&lt;/strong&gt; 1.327 g CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;0.2小时&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O，2.133 g MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;.6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O并加入ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;最多至 100 ml。高压灭菌后室温保存。&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;1x PBS/BA/PS：&lt;/strong&gt; 50 ml 10x 磷酸盐缓冲液（PBS）加入 437 ml ddH₂O 中&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O. 高压灭菌，冷却至室温后，加入 5 ml 100x 青霉素/链霉素、3 ml 35% 牛血清和 5 ml 100x 钙/镁溶液。4 ℃ 保存 &amp;deg;C.&lt;/p&gt; </td></tr></tbody></table>

从cdna拯救重组新城疫病毒

Rescue of Recombinant Newcastle Disease Virus from cDNA

新城病毒（Newcastle disease virus，NDV）是副黏病毒科（Paramyxoviridae）Avulavirus 属的代表种1，是一种非分段、负链、单股、有包膜的RNA病毒（图1），具有作为疫苗载体以及人类疾病治疗载体的潜力。只有在建立了反向遗传学技术以从编码其完整基因组cDNA的质粒中拯救出重组病毒之后2-5，对这些应用的深入探索才成为可能。通过标准的克隆方法，可在体外（in vitro）方便地对病毒cDNA进行修饰，以改变病毒的基因型和/或插入新的转录单元。拯救此类基因修饰病毒为研究影响感染多个阶段的因素提供了有力工具，同时也促进了用于抗原表达与递送的疫苗和治疗载体的开发与优化。本文中，我们描述了一种拯救重组NDV的实验方案。

新城疫病毒（NDV）的拯救是一种成熟且常规的技术，通常在具备病毒完整cDNA的实验室中进行。然而，该方法本身具有随机性，因此难以实现100%的拯救效率。监测该过程的早期步骤，特别是转染效率以及MVA-T7的感染情况，有助于识别潜在问题。图5A展示了足以成功拯救NDV的标准转染效率及转染/感染效率。在禽-哺乳动物共培养体系和鸡胚中经过多轮扩增后，可通过血凝（HA）试验中出现阳性孔来检测拯救病毒的存在。NDV通过连接红细胞引起血凝，从而阻止红细胞沉降到V型孔底部。因此，缺乏血凝活性时可在孔底观察到红色圆形红细胞沉淀，易于识别（图5B）。HA试验结果呈阴性可能是由于羊水中病毒滴度不足：通常需要至少约106 pfu/ml的最低滴度才能获得阳性HA结果。对于较低的病毒滴度，可使用特异性抗NDV抗体通过免疫荧光试验（IFA）进行检测。在此类情况下，建议将首次接种鸡蛋中含有的病毒再次接种鸡胚进行传代扩增。
<img alt="RNA...

近年来，为了开发新的疫苗和治疗载体等应用，人们对新城疫病毒（NDV）进行了广泛研究。这些研究得以实现，得益于从cDNA中拯救重组病毒的技术，例如本文所描述的方法。

从cDNA拯救重组新城疫病毒

新城病毒（Newcastle disease virus，NDV）是副黏病毒科（Paramyxoviridae）腮腺炎病毒属（Avulavirus）的代表种1，为非分段、负链、...

本实验的总体目标是从克隆的DNA中拯救出重组新城疫病毒（Newcastle disease virus, NDV）。首先，用携带T7聚合酶的辅助病毒感染哺乳动物细胞，然后将含有病毒最小复制装置编码序列的质粒转染入这些细胞，这些质粒的表达由T7启动子驱动。第二步是将转染后的哺乳动物细胞与禽类细胞共培养，后者是该病毒的自然宿主来源细胞。从哺乳动物细胞新产生的病毒将感染禽类细胞，进行第一轮扩增。随后，将共培养物的上清液接种至鸡胚中，以进一步扩增 rescued 病毒，最后一步是从接种后的鸡胚中收集 LAN toic 液体。最终，通过简单的血凝试验检测 LAN toic 液体中是否存在 NDV，以验证病毒拯救过程的成功。通过该方法拯救的重组病毒可帮助研究影响感染的各种因素，也可用作递送抗原的载体，用于疫苗接种和抗肿瘤治疗。为开始分裂哺乳动物HEP2或A549细胞，在转染前一天将细胞接种于6孔板中，次日细胞密度应达到80%至90%汇合度。每种待拯救的病毒需设置2至4个不同的孔。另设两个额外的孔用于对照PCAs、GFP和pite、GFP，分别用于监测转染效率和MVA T7病毒感染效率。用一毫升预热的PBS洗涤细胞两次，然后以每细胞一个PFU的感染复数，用MVA T7病毒对培养的哺乳动物细胞进行感染。在200微升PBS终体积中，于室温孵育一小时进行病毒感染；在此孵育期间，按照书面文本所述配制转染混合物，即在脂质体优化溶液配制并预孵育五分钟之后进行。向DNA管中加入250微升溶液，在室温下孵育20至30分钟。在与MVAT七孵育后，通过抽吸去除病毒接种物，并替换为DNA脂质体转染混合物。每皿加入1毫升DMEM含10%FBS。将感染并转染的细胞在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育6至8小时。然后在转染后24小时，用1.5毫升新鲜的DMEM 10%FBS替换转染培养基。此时可将对照孔置于荧光显微镜下观察，以评估转染效率和T7聚合酶活性，然后再进行感染并转染的哺乳动物细胞与禽类成纤维细胞的共培养。通常每两个转染孔需使用一个汇合的100毫米组织培养皿的鸡或鸭胚胎成纤维细胞。请务必提前准备好足够的材料。每次进行病毒有效拯救实验时，需准备100毫米的禽类细胞培养皿。DMEM 10%FBS培养基需添加5%鸡胚尿囊液和30毫摩尔氯化镁。用预热的1×PBS洗涤哺乳动物细胞两次后，加入0.2毫升EDTA胰蛋白酶消化细胞，直至细胞脱落。将细胞重悬于1毫升添加了补剂的DMEM培养基中，并转移至含有3毫升相同培养基的100毫米组织培养皿中。用预热的1×PBS洗涤禽类细胞两次后，加入1毫升EDTA-胰蛋白酶溶液，37°C孵育1至2分钟，直至细胞脱落。通过加入8毫升制备好的培养基重悬禽类细胞。然后将4毫升胰蛋白酶消化的禽类细胞加入共培养的100毫米组织培养皿中的哺乳动物细胞中，总体积为8毫升。轻轻摇动10

rescue-of-recombinant-newcastle-disease-virus-from-cdna

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科研

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Immunology and Infection

免疫学与感染

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