生产的非复制型犬2型腺病毒衍生载体与纯化

在过去的 15 年里，2 型犬腺病毒 （CAV2） 衍生的载体已经证明了它们在体外和体内转导细胞的效率，并广泛用于疫苗接种和基因治疗。在这里，我们描述了一种构建、生产和纯化 CAV2 载体的程序，从而产生高滴度病毒悬浮液。

该程序的总体目标是构建、生产和纯化犬腺病毒 2 型衍生载体。这是通过首先将目标基因克隆到穿梭质粒中来实现的。第二步是通过同源重组获得重组基因组质粒。

接下来，重组缺陷小牛，在反式互补细胞系中产生和扩增两种病毒。最后一步是纯化和浓缩所得重组病毒，用于体内和体外的各种应用。最终，免疫荧光共聚焦显微镜用于显示啮齿动物大脑中病毒转导的例子。

与现有方法（例如源自人类神经官能症的载体）相比，这些技术的主要优点是，在人类群体中没有预先存在的针对小牛 2 的免疫力。因此，这种方法可以帮助回答疫苗接种或基因治疗领域的关键问题，例如评估在特定大脑区域表达的蛋白质的作用。因此，演示此程序的可能是 KY 和 Corin Bergeron。

我们实验室的两名博士后研究人员在转染前一天准备该程序，方法是将 DKE 一个细胞接种在六孔板上，在 37 摄氏度和 5%CO2 的 DMEM 中培养细胞，含有 7% 热量的高葡萄糖、灭活胎牛、血清钠、丙酮酸、青霉素和链霉素。第二天，细胞应达到 70% 至 80% 汇合度，用于转染消化 2 μg pcal GOI，重组 cav 两个基因组质粒与 ASC 一个释放质粒的非病毒序列，通过 0.8%Agro 凝胶电泳消化检查所得限制模式，应产生一个包含重组基因组的约 31 kb 碱基对片段和一个对应于质粒骨架的 2 kb 对片段。将消化的 DNA 与 200 μL Jet Prime 缓冲液混合，涡旋 10 秒。

加入 4 μL Jet Prime，涡旋混合 10 秒钟。短暂旋转以去除液滴并孵育 10 分钟。在室温下，将转染混合物逐滴添加到 DKE one 细胞上。

轻轻摇动板子，使混合物均匀分布，并在 37 摄氏度下孵育。转染后 1 周，将细胞和培养基收集在 15 mL 聚丙烯管中。通过三个冻结思维周期破坏细胞。

以 1， 800 次离心 10 分钟澄清裂解物 G.收集上清液并储存在零下 20 度，以便随后病毒繁殖以传播病毒感染 80% 至 90% 汇合的 DKE 单层细胞，在含有 0.5 毫升病毒的上清液的六孔板的一个孔中生长。在 37 摄氏度下轻度搅拌孵育 1 小时后 1 小时。取出接种物，用 1.5 毫升含有 5% 热灭活 FCS 的完整 DMEM 替换它，在 37 摄氏度下孵育细胞 3 到 4 天。

应每天监测细胞是否出现细胞病变效应或 CPE。如果看不到清晰的 CPE。培养四天后收获细胞，当明确的 CPE 影响大多数细胞时重复病毒扩增。

通常在 2 到 4 轮病毒扩增后，用培养基收集细胞并冷冻解冻 3 次，如前所述。感染 80% 至 90% 汇合处。CPE 完成后 3 至 4 天后，每个培养皿使用 1.5 毫升含病毒的上清液，在三个直径为 10 厘米的组织培养皿中培养一个细胞。

从这些直径为 10 厘米的培养皿中收获细胞，通过三个自由式循环破坏它们，并通过离心 10 分钟清除裂解物 1， 800 次。G 收集上清液并储存在零下 20 度用于大规模 Cav 2 扩增以开始放大程序，感染 80% 至 90% 汇合的 DKE 单层细胞，在 40 个 10 厘米直径的组织培养皿中生长，每个培养皿使用 0.1 毫升含有病毒的上清液，稀释在 1 毫升不含 FCS 的完整 DMEM 中，在 37 摄氏度下孵育细胞 3 至 4 小时轻度搅拌。3 到 4 小时后，加入 5 毫升补充有 5% FCS 的完整 DMEM，并孵育 3 天。

三天后，从 40 个 10 厘米的培养皿中收获 50 毫升聚丙烯管中的受感染细胞，在 4 摄氏度下以 1， 200 倍 G 沉淀细胞 10 分钟。Resus 将它们悬浮在 15 毫升 DMEM 培养基中，通过三个冻融循环破坏细胞。以 1， 800 倍 G 离心 10 分钟，去除细胞碎片。

纯化病毒颗粒之前，将上清液储存在零下 20 度以纯化病毒颗粒。在 14 mL UltraClear 试管中制备不连续的氯化铯梯度。首先，将 2 毫升更高密度的氯化铯溶液倒入试管底部。

然后在第一种溶液上缓慢加入 2 毫升低密度氯化铯溶液。小心地将病毒上清液加载到氯化铯梯度的顶部。离心后，在摆动的 SW 40 转子中，用矿物油从顶部离心机中注入离心管 2 到 3 毫米处，以 130， 000 倍 g 和 18 摄氏度的速度填充 1 小时 30 分钟。

在两个氯化铯溶液层之间的界面处清晰可见两条白色条带。使用 21 号针头和注射器收集侧穿刺含有成熟腔两个颗粒的下带。尽量避免收集与空病毒颗粒相对应的上带。

通过将集体病毒颗粒与氯化铯溶液混合，在 14 毫升透明管中制备连续的氯化铯梯度。在摆动的 SW 40 转子中，从顶部离心机向试管中注入矿物油，直至 2 到 3 毫米，在 130， 000 倍 G 和 18 度下填充 18 小时。离心后，如前所述，用注射器侧面穿刺收集白色小牛 2 个含有条带。

同样，尽量避免收集剩余的上带。在这个连续梯度中，这应该更容易，因为它可以更好地分离两个波段。收集的悬浮液总体积不应超过 2 毫升。

接下来，用 30 ml PBS 平衡 cidex G 25 PD 10 柱。将病毒悬浮液加载到色谱柱上，丢弃流过的洗脱液，用 500 μL PBS 馏分收集馏分 5 至 7，其中通常包含脱盐的 cav 2 颗粒。含有病毒的组分很容易识别，因为有气味祝福。

最后，在 1.5 毫升 CAV 2 悬浮液中加入 150 微升甘油，并储存在零下 80 摄氏度的 Eloqua 中，以通过终点稀释滴定 Cav Two，在冰上解冻等分试样的纯化病毒，并在无血清 DMEM 中进行 10 倍连续稀释，范围从 10 到负 2 到 10 到负 12。将 50 微升每种病毒稀释液加入 96 孔板的 5 个孔中，向第四个 DKE 中加入 1.5 乘以 10 个细胞，向每个孔中加入一个细胞，在 37 摄氏度和 5% CO 2 下孵育板，第 5 天。感染后通过显微镜观察监测 CPE 外观。

生产病毒载体之前，使用 read 和 men 统计方法将感染滴度确定为组织中位培养感染剂量。使用标准分子生物学技术构建带有转基因表达盒的重组 CAV 2 基因组。首先，将目的基因克隆在穿梭质粒中作为表达盒，具有一个巨细胞病毒早期启动子和一个多聚腺苷酸化信号，两侧是两个 CAV，两个衍生的基因组序列，代表上游和下游重组靶序列。

在第二步中，通过同源重组将表达盒从穿梭质粒插入 CAV 2 基因组中。插入 GOI 表达盒将导致重组基因组中 EA 和部分 E one B 基因的缺失。获得重组基因组质粒后，使用 CAV two E one 互补 DKE one 细胞生产病毒颗粒。

由于感染细胞中产生的大量病毒颗粒，明显的细胞病变效应可以很容易地通过明场显微镜或转基因表达观察到。这个例子是表达 CAV 两个向量的 A GFP。使用新鲜 DKE one 细胞进行几轮病毒扩增后，通过氯化铯梯度超速离心纯化病毒颗粒。

浓缩的病毒颗粒在铯梯度内表现为两个乳白色条带。下条带对应于应收集的成熟重组 cav 2。而上带包含应避免的空非感染性颗粒。

所得重组 calf two 载体可用于在体外或体内转导多种物种的几乎所有细胞类型。这里显示的一个应用示例，其中表达 CAV 2 的 GFP 通过立体出租车注射到小鼠中枢神经系统的不同区域。由于该方案产生高滴度和纯度、纯病毒储液，因此在齿状回或 DG 中注射低至 1 微升表达 CAV 二载体的 PBS 稀释的 GFP 会导致 40% 至 50% 的神经元转导。

此外，由于 C 二在轴突中逆行转运的能力，在纹状体中注射两微升 PBS 稀释的 GFP 表达 CAV 二载体，能够在亚中转导近 80% 的黑人 stri AAL 神经元，黑质致密部 a 在其发展之后。这些技术为该领域或疫苗学或神经科学的研究人员在许多不同的动物模型中探索大脑中的新抗原和基因功能铺平了道路。因此，不要忘记使用 CAF 两个衍生载体可能是极其危险和谨慎的，例如在执行此程序时应始终采取适当的遏制和废物处理措施，包括个人防护设备和在 BSL 两个实验室的层流罩中工作。