非复制型犬腺病毒2型载体的制备与纯化

本实验的总体目标是构建、生产并纯化来源于犬腺病毒2型的载体。首先将目的基因克隆至穿梭质粒中，以实现该目标；第二步通过同源重组获得重组基因组质粒。

接下来，利用转反式互补细胞系产生并扩增重组缺陷型犊牛病毒。最后一步是纯化并浓缩所获得的重组病毒，用于体内和体外的多种应用。最终，通过免疫荧光共聚焦显微镜展示重组病毒在啮齿类动物脑组织中转导的实例。

这些技术相较于现有方法（例如源自人腺病毒的载体）的主要优势在于，人群中不存在针对牛腺病毒2型的预先免疫。因此，该方法有助于回答疫苗接种或基因治疗领域中的关键问题，例如评估在特定脑区表达的蛋白质所起的作用。演示本实验操作的将是May KY和Corin Bergeron。

我们实验室的两名博士后研究人员在转染前一天为此实验做准备：将DKE one细胞接种于六孔板中，在含有高浓度葡萄糖的DMEM培养基中培养细胞，培养基中需添加7%经热灭活的胎牛血清、丙酮酸钠、青霉素和链霉素，于37摄氏度、5% CO2条件下培养。次日，细胞应达到70%至80%融合度以进行转染。用ASC one酶切2微克pCal GOI重组Cav2基因组质粒，以去除质粒中的非病毒序列。通过0.8%琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，应得到一个约31千碱基对的片段（包含重组基因组）和一个2千碱基对的片段（对应质粒骨架）。将酶切后的DNA与200微升Jet Prime缓冲液混合，涡旋振荡10秒。

加入4 µL的jet prime，涡旋振荡10秒以混匀。短暂离心以去除液滴，室温孵育10分钟。将转染混合物逐滴加入DKE one细胞中。

轻轻摇动培养板以均匀分散混合物，并在37摄氏度下孵育。转染后一周，收集细胞和培养基至15毫升聚丙烯管中。通过三次冻融循环裂解细胞。

将裂解液在1,800 × g条件下离心10分钟以澄清。收集上清液，并于-20 °C保存，用于后续病毒扩增。取0.5 mL含病毒的上清液接种于六孔板中一个孔内已长至80%~90%汇合度的DKE-1细胞单层，以感染细胞。在37 °C温和振荡条件下孵育1小时。1小时后，吸除接种液，更换为1.5 mL含5%热灭活胎牛血清的完全DMEM培养基，在37 °C继续孵育细胞3至4天。

应每天观察细胞是否出现细胞病变效应（CPE）。若未见明显细胞病变效应，则在培养四天后收获细胞，并在大多数细胞出现明显细胞病变效应时重复病毒扩增。

通常在经过两到四轮病毒扩增后，收集细胞及其培养基，并按前述方法反复冻融三次。当细胞融合度达到80%至90%时进行感染。在细胞病变效应（CPE）完全出现后的三到四天，使用每皿1.5毫升含病毒的上清液，对生长于三皿直径10厘米组织培养皿中的DKE one细胞进行感染。

从这些直径为10厘米的培养皿中收获细胞，通过三次冻融循环裂解细胞，并在1,800 × g 条件下离心10分钟以澄清裂解液。收集上清液并储存在-20°C。为进行大规模Cav-2扩增，开始放大操作：将含有病毒的上清液0.1毫升用不含FCS的完全DMEM 1毫升稀释，接种至40个直径10厘米的组织培养皿中80%至90%汇合的DKE-1细胞单层中（每个培养皿使用一份稀释液），在37°C、轻度振荡条件下孵育3至4小时。3至4小时后，每皿加入5毫升含5% FCS的完全DMEM，继续孵育3天。

三天后，从40个10厘米培养皿中收集感染的细胞至50毫升聚丙烯管中，在4°C下以1,200 × g离心10分钟，沉淀细胞。用15毫升DMEM培养基重悬细胞，通过三次冻融循环裂解细胞。在4°C下以1,800 × g离心10分钟，去除细胞碎片。

在纯化病毒颗粒之前，将上清液于-20°C保存。在14毫升UltraClear离心管中制备不连续的氯化铯梯度。首先，将2毫升高密度氯化铯溶液加入离心管底部。

然后缓慢地将两毫升低密度氯化铯溶液加在第一层溶液之上。小心地将病毒上清液加在氯化铯梯度溶液上方。用矿物油填充离心管，至管顶下方两到三毫米处，在SW 40摆动转子中于130,000 × g、18 °C条件下离心1小时30分钟。

在两层氯化铯溶液的界面处可清晰观察到两条白色条带。使用21号针头和注射器，通过侧向穿刺收集含有成熟cav-2病毒颗粒的下层条带。应尽可能避免收集对应于空病毒颗粒的上层条带。

在14毫升透明离心管中，将收集的病毒颗粒与氯化铯溶液混合，制备连续的氯化铯梯度。用矿物油填充离心管至距离管口2到3毫米处，在SW 40摆动转子中以130,000 × g离心18小时，温度为18°C。离心结束后，用注射器通过侧面穿刺收集含有白色条带的组分，操作方法如前所述。

同样，尽量避免收集剩余的上层条带。在该连续梯度中，两条带的分离效果更好，因此操作应更为容易。收集的悬液总体积不应超过 2 毫升。

接下来，用 30 毫升 PBS 平衡 Cidex G 25 PD 10 柱。将病毒悬液上样至柱中，弃去穿流液，用 PBS 以 500 微升的洗脱组分进行洗脱，收集第 5 至第 7 组分，这些组分通常含有去盐的 Cav-2 病毒颗粒。含有病毒的组分很容易识别，因为其具有特殊气味。

最后，向1.5毫升CAV-2悬液中加入150微升甘油，于Eloqua中保存在-80摄氏度，通过终点稀释法滴定CAV-2。将一份纯化的病毒样品置于冰上解冻，并用无血清DMEM进行10倍系列稀释，稀释范围从10⁻²至10⁻¹²。将每种病毒稀释液各50微升加入96孔板中的5个孔中，每孔接种1.5×10⁴个DKE-1细胞，将培养板置于37摄氏度、5% CO₂条件下培养5天。感染后第5天，通过显微镜观察监测细胞病变效应（CPE）的出现情况。

在病毒载体生产之前，采用 Reed-Muench 统计法测定感染滴度，以确定半数组织培养物感染剂量。利用标准分子生物学技术构建携带目的基因表达盒的重组 CAV-2 基因组。首先，将目的基因克隆至穿梭质粒中，形成包含巨细胞病毒早期启动子和多聚腺苷酸化信号的表达盒，该表达盒两侧分别为来源于 CAV-2 的上游和下游重组靶序列。

第二步，通过同源重组将表达盒从穿梭质粒插入到 CAV 两个基因组中。目的基因（GOI）表达盒的插入将导致重组基因组中的 EA 基因及部分 E 一 B 基因被删除。一旦获得重组基因组质粒，便利用可互补 CAV 两个 E 一基因的 DKE 一细胞来产生病毒颗粒。

由于感染细胞中产生大量病毒颗粒，可通过明场显微镜观察或通过报告基因表达直观地看到明显的细胞病变效应。此例为表达绿色荧光蛋白（GFP）的鸡贫血病毒（CAV）二型载体。使用新鲜的DKE1细胞经过多轮病毒扩增后，通过在氯化铯梯度中进行超速离心纯化病毒颗粒。

浓缩的病毒颗粒在铯梯度中呈现为两条乳白色条带。下层条带对应成熟的重组cav-2，应收集该条带；而上层条带含有空壳的非感染性颗粒，应避免收集。

所获得的重组犊牛二型病毒载体可用于在体外或体内转导多种物种的几乎所有细胞类型。图中展示了一个应用实例，即通过立体定位将表达绿色荧光蛋白（GFP）的CAV-2注射到小鼠中枢神经系统的不同区域。由于本方案可产生高滴度且高纯度的病毒储备液，因此在齿状回（DG）中注射低至一微升的磷酸盐缓冲液（PBS）稀释的表达GFP的CAV-2载体，即可实现40%至50%的神经元转导。

此外，由于CAV-2具有在轴突中逆行运输的能力，在纹状体内注射两微升用PBS稀释的表达GFP的CAV-2载体，可在其发育后实现对黑质致密部中约80%的黑质纹状体神经元的转导。这些技术为疫苗学或神经科学领域的研究人员探索多种不同动物模型大脑中的新抗原和基因功能开辟了道路。因此，请务必注意，操作CAV-2衍生载体可能具有极高危险性，进行该实验时必须采取谨慎的防护措施，例如适当的 containment 措施和废物处理程序，包括使用个人防护装备，并在生物安全二级（BSL-2）实验室的层流罩内操作。