Name: 使用秀丽隐杆线虫作为模型系统研究多细胞生物中的蛋白质稳态 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-18T14:15:00.000+00:00
Duration: 12 min 38 s
Description: 了解如何使用秀丽隐杆线虫作为模型系统研究多细胞生物中的蛋白质稳态。本方法通过行为学检测、免疫荧光显微镜和蛋白质印迹分析，帮助研究人员在生物体、细胞和蛋白质三个水平上监测蛋白质错误折叠，从而深入理解蛋白质稳态与衰老及神经退行性疾病的关系。

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本研究所使用的所有线虫品系均由由美国国立卫生研究院（NIH）研究资源国家中心（NCRR）资助的秀丽隐杆线虫遗传学中心提供。由H.F. Epstein开发的单克隆抗体购自发育研究杂交瘤库，该库在NICHD的主持下建立，并由爱荷华大学生物学系维护。N. Shemesh获得了Fay和Bert Harbour奖项的支持。A.B.-Z.获得了以色列高等教育委员会Alon奖学金、玛丽·居里国际回归基金以及美国-以色列双边科学基金会和以色列科学基金会（项目编号91/11）资助项目的资助。

利用行为分析法在活体生物中监测蛋白质折叠
1. 行为检测中动物的同步化处理
<ol>
	<li>遵循标准方法进行维护 秀丽隐杆线虫36包括培养基和培养皿的制备、食物制备以及动物生长条件。严格控制培养条件，包括温度（15–25 °C）、种群数量和食物供应。若培养皿出现细菌或真菌污染，应立即弃用。</li>
	<li>挑选15-30个胚胎，转移至新培养板中，在实验所需温度（15-25 °C）下培养至实验结束。或者，将10-20只性成熟雌虫置于培养板上，让其产卵30-60分钟，随后移除成虫。直接挑选胚胎或利用性成熟雌虫产卵所获得的胚胎在年龄上均存在一定变异（±6小时）。为减少此变异，可选择特定发育阶段（如逗号期）的胚胎进行挑选，或选用刚进入产卵期（成虫第2天）的10-20只成虫进行产卵。应尽可能避免使用漂白法同步化，因该处理具有应激性，可能影响蛋白质稳态。</li>
	<li>挑选同步化的动物，转移至检测平板进行评分，然后弃去。</li>
</ol>
2. 运动能力检测
挑选同步发育的动物，转移至洁净培养皿中，并在所需温度（15–25 °C）下放置以进行运动评分。每个生物学重复均需进行评分 &#62;20 只动物，并在每种实验条件下至少重复检测 3 次。使用 Wilcoxon-Mann-Whitney 秩和检验比较两种独立的实验条件。
<ol>
	<li>为检测轻度运动障碍，将5-7只动物置于干净细菌菌苔的中心，让动物在培养皿上移动2分钟。该时间间隔的确定依据是野生型动物中有90%能够离开直径1厘米圆圈所需的时间。</li>
	<li>在2分钟内未能离开直径1厘米圆圈（例如，仍停留在初始放置点1厘米半径范围内的）动物记为运动不协调。</li>
	<li>为检测重度运动障碍，将动物置于干净的细菌菌苔上。</li>
	<li>在时间零点（t=0）拍摄若干动物的照片，5分钟后（t=5）再次拍摄。若动物在5分钟内未移动一个体长，则记为瘫痪。</li>
</ol>
3. 耐热性
<ol>
	<li>挑选 &#62;20 条同步化的动物个体，转移至含有 450 µl 热激（HS）缓冲液（表 1）的 24 孔板中。每个生物学重复需评估 &#62;20 条动物，并在每种实验条件下至少重复检测 4 次。</li>
	<li>将 24 孔板放入预热的水浴中。热激的温度和持续时间强烈依赖于培养条件，尤其是培养温度。</li>
	<li>向热激缓冲液中加入 9 µl SYTOX orange 染料。</li>
	<li>通过荧光体视显微镜配合 TXR 滤光片观察染料摄入情况，以评估动物存活状态。摄入染料的个体视为死亡。使用 Wilcoxon-Mann-Whitney 秩和检验来比较两个独立的实验条件。</li>
</ol>
利用免疫染色和标记蛋白来监测特定细胞中的蛋白质折叠
4. 通过免疫染色监测蛋白质的定位
<ol>
	<li>在所需阶段，将至少30只动物转移至含有M9缓冲液的Eppendorf管中36.</li>
	<li>用M9缓冲液对动物进行数次清洗，每次清洗时进行短时低速离心（3,000 rpm/900 x g，2 min），然后重新悬浮。</li>
	<li>将试管置于冰上几分钟以冷却。</li>
	<li>去除多余液体，加入 500 µl 冰冷的 4% 多聚甲醛溶液，孵育表 2孵育时间需针对每种检测的蛋白质进行校准，通常在室温下约为5-30分钟。也可在4 °C下延长孵育时间，但可能会影响样本的通透性。</li>
	<li>用 PBS-Tween（pH 7.2）缓冲液通过离心（3,000 rpm，1–2 分钟）洗涤固定后的动物样本 3 次。 动物在此阶段可在 4 °C 下保存数周。</li>
	<li>通过离心收集动物样本（3,000 rpm，1–2 分钟）。</li>
	<li>在通风橱中，除去大部分上清液，并将沉淀重悬于 1 ml β-巯基乙醇（β-ME）溶液中（表2).</li>
	<li>在37 °C下孵育过夜，同时在旋转摇床（nutator）上轻轻摇动。</li>
	<li>在通风橱中，用 PBS-Tween（pH 7.2）缓冲液将样品洗涤 3 次。</li>
	<li>将动物重悬于50-100 µl中&#160;PBS-吐温（pH 7.2） 动物在此阶段可在 4 °C 下保存数周。</li>
	<li>通过离心（3,000 rpm，1–2 分钟）收集动物样本，并移除大部分 PBS-Tween 缓冲液。</li>
	<li>加入 100–150 µl&#160;向每管中加入胶原酶溶液，并在37 °C下剧烈振荡孵育（使用Thermo-mixer或摇床培养箱）。</li>
	<li>从孵育5分钟后开始，定期在体视显微镜下观察动物。当20%的动物发生破裂时，将试管置于冰上以终止反应。 此步骤极为敏感！处理时间取决于固定条件，且不同品系间可能存在较大差异。孵育时间过长可能导致动物样本完全降解。必须针对每批使用的酶进行条件优化，并密切监测降解情况。</li>
	<li>用 PBS-Tween（pH 7.2）洗涤动物样本两次，然后通过离心（3,000 rpm，1–2 分钟）收集样本，并移除大部分 PBS-Tween 缓冲液。</li>
	<li>加入 1 ml&#160;AbA 溶液（表 2）并在室温下轻轻振荡孵育1小时。 动物在此阶段可在 4 °C 下保存数周。</li>
	<li>通过离心（3,000 rpm，1–2 min）收集动物，并重悬于 200 μl 中&#160;AbA</li>
	<li>加入用 AbA 溶液按 1:100–1:1,000 稀释的一抗，轻轻振荡孵育。孵育的温度和时间因抗体而异，应针对每种检测的蛋白进行优化。我们通常在室温下孵育过夜。</li>
	<li>通过离心（3,000 rpm，1–2 分钟）洗涤动物样品。</li>
	<li>加入AbA缓冲液（1 ml），室温下轻柔混匀孵育15–60分钟。 动物在此阶段可在 4 °C 下保存数周。</li>
	<li>可选： 样品也可用荧光染料染色。操作时，加入染料（例如 DAPI（2 mg/ml）或鬼笔环肽（Phalloidin，1:100）加入至200 μl AbA中，轻轻振荡孵育最长1小时。此步骤可在洗涤二抗的某个步骤期间进行。</li>
	<li>用步骤 4.18–4.19 重复洗涤动物 3 次。</li>
	<li>加入 100 μl&#160;AbA 与相应荧光标记的二抗按 1:100 稀释。</li>
	<li>保持样品避光（或置于暗管中），室温下振荡孵育数小时。</li>
	<li>用 AbA 缓冲液（1 ml）在室温下轻柔混匀孵育 15–60 分钟，随后离心（3,000 rpm，1–2 分钟），重复洗涤动物 3 次。 动物在此阶段可在 4 °C 下保存数周。</li>
	<li>将动物样本从液体中取出，去除所有液体后，重悬于 10 μl 溶液中&#160;相同的缓冲液。</li>
	<li>剪切移液器吸头末端，以避免损伤动物，转移 1-2 μl&#160;将样品加到载玻片上。</li>
	<li>以1:1的比例加入封片介质。</li>
	<li>盖上盖玻片 轻柔地 用盖玻片封片，并用指甲油密封。如果玻片不能立即观察，应将 载玻片可在 -20 °C 长期保存.</li>
</ol>
5. 监测标记蛋白的定位
<ol>
	<li>在所需阶段，将至少15只动物收集到载玻片上10 ml&#160;的M9缓冲液液滴中。</li>
	<li>使用&#34;线虫挑取工具&#34;，将动物转移至10 ml&#160;的4% 甲醛溶液液滴中（表2），并等待所有动物停止活动（约&#160;5分钟）。</li>
	<li>使用&#34;线虫挑取工具&#34;，将动物转移至2 ml&#160;的M9缓冲液与封片介质（1:1）混合液滴中（表2）。</li>
	<li>轻轻盖上盖玻片，并用指甲油密封。</li>
</ol>
利用离体实验监测蛋白质折叠与稳定性
6. 部分消化
<ol>
	<li>用1-2 ml液体洗涤15个培养皿（60 mm）中的样品&#160;在微量离心管中加入M9缓冲液。请注意，实验过程中应避免动物过于拥挤，并确保始终提供充足的食物。</li>
	<li>用M9缓冲液将动物洗涤数次，每次通过离心（3,000 rpm，2 min）并重悬动物。</li>
	<li>最后一次离心后，将动物重悬于100 μl M9缓冲液中。</li>
	<li>液氮速冻2. 样品可在 -80 °C 下保存。</li>
	<li>使用预冷的研钵和电动钻（也可使用手持式组织培养钻）研磨样品。 将样品置于冰上保存，并避免过热.</li>
	<li>经常在体视显微镜下检查动物，以确定研磨是否完全。若仍有完整的动物个体，需重复该步骤。</li>
	<li>通过移液法估测线虫提取物体积。</li>
	<li>加入等体积的（2倍浓度）线虫裂解液（表3). 不要使用任何类型的蛋白酶抑制剂。</li>
	<li>冰上孵育15分钟。</li>
	<li>在预冷的离心机（4 °C）中离心去除碎片（1,000 x g，2 分钟）。</li>
	<li>将上清液转移至干净的微量离心管中。 样品可直接使用或于 -80 °C 保存。</li>
	<li>制备胰凝乳蛋白酶溶液（表3）并置于冰上保存直至使用。</li>
	<li>使用Bradford法测定总蛋白浓度。</li>
	<li>必要时稀释样品，使总蛋白浓度为3-3.5 mg/ml。</li>
	<li>将胰蛋白酶溶液按1:1,200的比例加入总蛋白裂解液中。</li>
	<li>为确定孵育时间，将样品与胰凝乳蛋白酶共同孵育60分钟。在不同时间点从样品中取出20 μl等分试样（例如 0、5、20、40 和 60 分钟），立即与 SDS 样品缓冲液混合，并在 96 °C 下煮沸 5 分钟。*或者，将样品与不同浓度的胰凝乳蛋白酶孵育，并在特定时间后加入 SDS 样品缓冲液，于 96 °C 煮沸 5 分钟以终止反应。</li>
	<li>在SDS-PAGE凝胶上电泳样品。</li>
	<li>使用适当的抗体进行蛋白质印迹分析，以确定该蛋白质的相对稳定性。</li>
	<li>确定能够显示样本间显著差异的最优条件（胰凝乳蛋白酶浓度和消化时间），并在后续实验中采用这些条件。</li>
	<li>使用密度测定软件（如 NIH Image 凝胶分析模块）确定不同消化产物（较低分子量片段）的强度。</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

对细胞蛋白质稳态能力的探针必须对折叠环境的变化高度敏感，并且易于监测，以便实时评估蛋白质折叠质量控制能力。我们利用亚稳态蛋白质作为蛋白质稳态能力的探针，监测了表型、亚细胞蛋白质定位以及蛋白质构象的变化。&#160;本文所介绍的实验方案主要聚焦于与肌肉蛋白质相关的表型，包括运动能力、肌丝结构组织以及肌球蛋白的稳定性。然而，这些方案也可经修改后用于监测其他折叠传感器。对于行为学表型，重要的是设计一种简单且稳健的检测方法，以在整体生物水平上确定蛋白质功能。例如，dyn-1 基因的温度敏感突变（ts突变）在限制性条件下会导致内吞作用和突触小泡循环的迅速丧失。因此，可通过检测体腔液中分泌的GFP的摄取情况，或通过检测与GFP标记的突触蛋白SNB-1::GFP（synaptobrevin-1）的定位，分别监测dynamin在体腔细胞和神经元中的功能28。同样，通过监测线虫对乙醇的敏感性，可评估线粒体复合物I蛋白GAS-1的功能28。在C. elegans中，许多基因根据其表型进行分类，并与简单的行为学读数相关联，这些读数易于观察。然而，识别基因在何时何地表达至关重要，因...

mRNA转录、加工和翻译，以及蛋白质折叠、转运和组装/解聚等蛋白质生物合成各步骤之间的相互作用，决定了依赖细胞蛋白质质量控制机制才能发挥功能的不稳定蛋白质的负荷水平1。因此，蛋白质质量控制机制的缺失或功能障碍可能导致多种细胞机器功能下降，并引发蛋白质错误折叠相关疾病2-7。当蛋白质折叠与清除机制的能力与不稳定蛋白质的负荷达到平衡时，即可实现蛋白质稳态（proteostasis），这种状态最终可防止错误折叠蛋白在细胞内积聚和形成聚集体6。错误折叠蛋白的积聚被认为是一种激活应激诱导型转录因子（如热休克因子HSF-1）的信号，并由此引发细胞保护性应激反应6,8。
我们对多细胞动物中蛋白质稳态网络功能的理解主要来源于 体外 重组研究以及利用组织培养细胞和单细胞生物所进行的观察9例如，关于可防止和修复蛋白质损伤的分子伴侣的研究，主要集中于分子伴侣介导的蛋白质折叠、去聚集及转位机制的生物化学与细胞生物学研究10-13相比之下，关于多细胞动物不同细胞和组织中各种蛋白质稳态组分的整合功能，目前可获得的信息仍然十分有限 &#34;正常&#34; 生长条件及应激反应11. 在发现 秀丽隐杆线虫， 细胞蛋白质质量控制也可通过非细胞自主的方式进行调控，这一点在实验中得到体现：感知温度的两个神经元发生突变时，可阻断热休克反应的激活并降低耐热性，表明有必要在多细胞生物体中研究蛋白质稳态的调控机制14-17然而，目前尚缺乏一个整体性的图景，来阐明蛋白质稳态网络（如各种分子伴侣家族）在完整多细胞动物组织中的功能机制，以及这些网络在发育和衰老过程中的动态变化。为实现这一目标，需要可靠的传感器来监测活体动物中的蛋白质组维持情况，从而确定多细胞生物在发育和衰老过程中不同细胞的蛋白质稳态能力。
一种蛋白质若要作为细胞蛋白质稳态的传感器，必须能够响应细胞折叠环境的变化，同时对细胞内无关蛋白质的折叠过程产生尽可能小的干扰。为了研究活体生物中细胞蛋白质稳态的维持与恢复，可采用两种依赖于折叠传感器的互补方法。第一种方法基于设计的折叠传感器，这些传感器来源于实验鉴定出的不稳定蛋白，已知其依赖于蛋白质稳态调控系统，例如萤火虫荧光素酶18-20或带有降解子标签的GFP21-24。第二种方法则是追踪内源性的不稳定蛋白，例如对细胞环境渐变响应的温度敏感型（ts）蛋白或随年龄增长而聚集的蛋白25-27。设计的折叠传感器本身不具备重要的生物学功能，但其优势在于可通过强大的报告检测手段（如GFP标记蛋白）进行检测，并可广泛应用于多种不同的细胞和动物模型18。然而，由于引入单一外源蛋白可能影响细胞的折叠环境27，这类多肽可能加重细胞蛋白质稳态系统的负担。此外，非细胞天然存在的设计型折叠传感器可能无法反映细胞蛋白质稳态能力的真实变化。例如，一种GFP标记的蛋白酶体报告底物需要抑制约90%的蛋白酶体活性才能观察到表型变化23。相比之下，依赖细胞自身蛋白质稳态系统的内源性不稳定蛋白具有更符合细胞敏感范围的优势。但此类蛋白发生错误折叠所导致的功能丧失也可能影响细胞功能和生物体的存活能力。本文将重点介绍内源性C. elegans折叠传感器的应用。
C. elegans 是研究发育和衰老的成熟多细胞动物模型，其利用多种保守的生物学通路，可通过细胞生物学、生物化学和遗传学方法相结合的方式，在细胞内追踪蛋白质折叠过程。我们采用亚稳态蛋白质作为探针，通过监测其表型、定位和稳定性的变化，来评估蛋白质稳态能力。此外，通过简单的动物行为分析，还可研究多种蛋白质功能。同样，当细胞内的蛋白质质量控制网络无法适应细胞需求时，会发生显著的蛋白质错误定位。利用荧光标记蛋白或免疫染色技术，可轻松在活体动物的细胞中实现蛋白质的可视化观察。最后，通过ex vivo（离体）方法，能够监测蛋白质的表达水平和稳定性。这使得行为学和生理学变化的快速、简便筛选成为可能，并可进一步深入分析蛋白质的定位与稳定性，从而实现对蛋白质稳态调节因子的监测。通过整合这些不同方法，可以获得关于细胞内蛋白质折叠环境的全面视图。事实上，该策略已成功应用于监测C. elegans、酵母、组织培养细胞及细菌中的蛋白质稳态紊乱15,25-35。

<table><tbody><tr><td>抗体染色与固定</td><td>多聚甲醛</td><td>Merc</td><td>8187151000</td></tr><tr><td>Tween-20&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1706531</td><td></td></tr><tr><td>胶原酶</td><td>Sigma</td><td>C5138-100MG</td><td></td></tr><tr><td>DABCO</td><td>Merc</td><td>8034560100</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Alfa Aesar</td><td>A16046</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-ME</td><td>Sigma</td><td>8057400250</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Di Cam</td><td>000-40-100</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;部分消化&amp;nbsp;</td><td>胰凝乳蛋白酶</td><td>Sigma</td><td>C4129-250MG</td></tr><tr><td>耐热性检测</td><td>SYTOX Orange</td><td>Invitrogen</td><td>S11368</td></tr><tr><td>胆固醇</td><td>Amaresco</td><td>0433-250G</td><td></td></tr><tr><td>仪器设备</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>M165 FC 荧光体视显微镜</td><td>Leica</td><td></td><td>TXR 滤光片</td></tr><tr><td>EXi Blue 荧光显微成像相机</td><td>QImaging</td><td>EXI-BLU-R-F-M-14-C</td><td></td></tr><tr><td>ConfoCor 3/510 META 共聚焦显微镜</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>研磨杵</td><td>Sigma</td><td>Z359947-100EA</td><td></td></tr><tr><td>无绳电动研磨杵马达</td><td>Kontes</td><td>K749540-0000</td><td></td></tr><tr><td>MicroCL 17 微型离心机系列</td><td>Thermo</td><td>75002455</td><td>制冷型，230 V 50/60 Hz，配备 24×1.5/2.0 ml 转子及 ClickSeal 生物密封盖</td></tr></tbody></table>

使用 caenorhabditis elegans 作为模式系统研究多细胞生物中的蛋白质稳态

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

蛋白质的折叠与组装对于蛋白质功能、细胞的长期健康以及生物体的寿命至关重要。历史上，蛋白质折叠的功能与调控主要在体外（in vitro）、分离的组织培养细胞以及单细胞生物中进行研究。近年来的研究揭示了蛋白质稳态（蛋白质稳态，proteostasis）、代谢、发育、衰老以及温度感知之间的关联。这些发现推动了用于监测模式多细胞生物秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）中蛋白质折叠的新工具的发展。在我们的实验室中，我们结合行为学检测、成像技术和生化方法，利用温度敏感型或天然存在的亚稳态蛋白质作为折叠环境的传感器，来监测蛋白质的错误折叠。与特定蛋白质错误折叠相关的行为学检测提供了简单而强大的读出方式，可用于快速筛选调控折叠的基因和条件。同样，此类错误折叠可能伴随蛋白质在细胞内的异常定位。因此，监测蛋白质定位可以揭示不同组织、发育各个阶段以及环境条件变化时细胞折叠能力的变化。最后，通过在离体（ex vivo）条件下使用生化工具，我们可以直接监测蛋白质的稳定性和构象。因此，通过结合行为学检测、成像技术和生化技术，我们能够分别在生物体、细胞和蛋白质水平上对蛋白质错误折叠进行监测。

折叠环境的受损可能导致蛋白质错误折叠和聚集。蛋白质错误折叠与构象改变相关，并导致蛋白质功能的丧失。我们采用互补的方法来监测完整动物、特定细胞及蛋白质提取物中的蛋白质折叠与功能。基于已知的不稳定突变所引起的显著行为和细胞表型，合理选择折叠传感器，可用于监测蛋白质折叠环境的变化。一个内源性温度敏感型突变蛋白的例子是粗肌丝蛋白副肌球蛋白（C. elegans UNC-15）中的L799F突变37。该错义突变影响卷曲螺旋相互作用，导致副肌球蛋白(ts)在限制性温度下错误折叠，并错误定位至旁晶状结构，而非正常定位于肌节。这种错误定位会破坏粗肌丝的形成，导致温度依赖性的胚胎和早期幼虫致死，以及成虫运动缺陷27。同样，表达内吞蛋白动力蛋白（C. elegans DYN-1）P70S突变的动物，在多种细胞类型中表现出温度依赖性的内吞缺陷，这与突变蛋白的错误折叠相关28,38。因此，我们可以通过监测不稳定蛋白质的功能、定位和构象来评估蛋白质稳态调控的变化。
利用行为分析法在活体生物中监测蛋白质折叠...

为了研究蛋白质稳态、应激与衰老之间的关系，我们利用遗传操作简便的多细胞生物秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）作为模式系统，在个体、细胞和蛋白质水平上，通过监测蛋白质功能障碍、细胞内蛋白质定位以及蛋白质稳定性，来追踪蛋白质折叠状态的变化。

使用 Caenorhabditis elegans 作为模式系统研究多细胞生物中的蛋白质稳态

蛋白质的折叠与组装对于蛋白质功能、细胞的长期健康以及生物体的寿命至关重要。历史上，……

在可进行遗传操作的多细胞生物秀丽隐杆线虫（C. elegans）中，以下实验的总体目标是在三个层面上监测蛋白质错误折叠：个体、细胞和蛋白质层面。行为表型（如运动能力或热抗性）可作为个体水平上蛋白质稳态变化的读出指标，这些表型可能是温度敏感型或自然发生的。利用温度敏感或天然存在的亚稳态蛋白质来追踪蛋白质的错误定位，而错误定位可能与蛋白质错误折叠相关。一种离体部分消化实验可直接监测蛋白质的稳定性。根据热耐受实验、免疫荧光显微镜和蛋白质印迹分析的结果，可以显示在不同培养温度下蛋白质稳态能力的变化。这些实验操作将由我实验室的研究生进行演示。行为实验将由 Ishido 演示，Shai 将演示免疫染色和 ANA 荧光检测，Sheron 将演示部分消化实验。本测量温度耐受性的实验方案包含动物同步化的 preparatory 步骤以及运动能力检测，两者均在文本方案中有详细描述。首先收集至少含有 20 只同步化动物的重复样本。在24个含有450微升热激缓冲液的良好培养孔中，向每孔补充9微升细胞毒素。现在将该培养板转移至加热浴中。热激的温度和持续时间在很大程度上取决于培养条件。特别是培养温度会影响动物的存活率，可通过监测其对染料的摄取情况来评估。使用配备TXR滤光片的荧光体视显微镜观察，摄取染料的个体即为已死亡动物。该技术相较于现有方法（如 kine）的主要优势在于，通过人工评分对动物死亡率进行视觉读取，使得本实验更加快速且可重复性更高。在所需阶段，将至少 30 只动物转移至含有 M 九缓冲液的微量离心管中。使用 M 九缓冲液通过数次短暂、低速的离心步骤清洗动物，并将其重悬于 M 九缓冲液中。然后将试管置于冰上几分钟以冷却。冷却后，去除多余的液体，并将试管在500微升冰冷的4%多聚甲醛中孵育。每种被检测蛋白质的孵育时间均需进行校准，在室温下通常应为5至30分钟。接下来，用pH值为7.2的PBST缓冲液通过离心方式洗涤固定后的样本动物3次。离心步骤通常均在3000 RPM条件下进行1至2分钟，除非另有说明。在通风橱中，弃去大部分上清液，将沉淀重悬于 1 毫升含巯基乙醇的溶液中。随后将样品在 37 摄氏度孵育过夜，次日在通风橱中轻轻摇动孵育。用 PBST 缓冲液通过离心和重悬的方式洗涤样品三次。用 50 至 100 微升 PBST 完成洗涤，再次离心后去除大部分 PBST。接着加入 100 至 150 微升胶原酶溶液，将样品在 37 摄氏度下以强烈振荡条件孵育。可使用恒温混匀仪或摇床培养箱。五分钟后，开始在体视显微镜下进行定期检查。当五分之一的动物组织已被破碎时，将试管置于冰上以终止反应。此步骤极为敏感。处理时间取决于固定条件，且不同品系之间可能存在较大差异。过长的孵育时间可能导致动物样本完全降解。每次使用新的酶批次前必须校准条件，并应密切监测降解过程。接着，用PBST清洗动物样本两次。通过离心收集动物样本，并移除大部分PBST。然后加入1毫升BA溶液，在室温下轻轻摇动孵育1小时。再次通过离心收集动物样本，并将其重悬于200微升的b, A溶液中。现在加入一抗，并在室温下轻轻摇动，开始过夜孵育。这些参数需要进行校准。接下来，通过离心洗涤动物样本。在 1 毫升的 b、A 中重悬，并在室温下轻轻混匀孵育 15 分钟至 1 小时。此时，可选择性地加入荧光染料。接下来，用 BA 缓冲液再重复洗涤三次，最后在 100 微升 BA 缓冲液中重悬，其中加入适当的一抗对应的荧光标记二抗，稀释比例为 1:100。将样品在室温下避光、摇动孵育数小时，以完成二抗结合。用 a、b、a 溶液洗涤三次。然后将动物样本置于载玻片上，首先用 Resus 悬浮于 10 µL 的 a b, a 溶液中，再用宽口移液管吸取一到二微升样品滴加到每张载玻片上，加入等体积的封片介质，并盖上盖玻片。最后用指甲油轻轻封固载玻片。载玻片可于负20摄氏度长期保存。通常，初次接触该方案的研究人员会遇到困难，因为该方案步骤较长，且包含多个可能影响其效率的环节，导致问题排查较为困难。首先将约1560毫米培养皿中的动物收集至一到两毫升M9缓冲液中。动物不应过于拥挤。用M9缓冲液通过离心和重悬动物的方式清洗数次。最后一次离心后，将动物重悬于100 µL的M9缓冲液中。然后将动物快速冷冻，并在冰上使用预冷的研钵和研磨钻头研磨样品。需频繁暂停以检查动物是否已充分研磨。待动物完全破碎后，估算线虫提取物的体积。然后加入等体积的2×线虫裂解液，将样品置于冰上孵育15分钟。接着通过预冷的离心步骤去除碎片，并将上清液转移至新的微量离心管中。经Bradford法测定后，将样品稀释至每毫升含3至3.5毫克蛋白质。然后按1:1200的比例加入 freshly prepared chilled camo trypsin 溶液。此时，将样品置于孵育状态1小时。在孵育期间，定期取出20 µL等分试样，立即与SDS缓冲液混合，随后在96 °C下加热5分钟。上样并运行样品，随后进行Western血液分析，以确定蛋白的相对稳定性。在进行此操作时，需注意切勿向消化样品中添加蛋白酶抑制剂混合物，而应迅速操作并将样品置于冰上。肌肉伴侣蛋白on 45中的E781K ts突变会严重影响肌球蛋白的折叠与组装，从而影响动物的运动能力。当这些突变体在高于20摄氏度的温度下培养时，它们会完全瘫痪，但在15摄氏度时则不会。野生型动物在25摄氏度下培养后若经历长时间热激，大多数能够存活；而在15至20摄氏度下培养以监测对热激反应的有效修饰因子时，对照应激条件下的野生型动物存活率上升至70%。将动物置于37摄氏度下进行6小时的热激处理。在成虫期第一天，通过细胞橙摄取实验检测其存活率。死亡的动物用白色箭头标示，存活的动物用黄色箭头标示。使用特异性抗体对多种亚稳态蛋白的定位进行了可视化观察。例如，在限制性条件下，paramin ts 未定位于肌原纤维的肌节，而是错误定位于多晶聚集体中。同样，在限制性温度下，肌球蛋白 TS 形成的是无序的纤维结构，而非高度有序的丝状结构。表达多种TS突变蛋白且与myo-3共同表达的动物，其肌球蛋白丝状结构的组织迅速恶化，通过监测GFP在肌球蛋白构象变化中的信号可检测到这一现象，表明肌肉细胞的折叠能力发生了改变。与UNC-45 TS共同表达的肌球蛋白重链的蛋白酶解片段模式，与野生型动物中肌球蛋白的消化谱相比具有明显差异，支持了肌球蛋白的折叠受到UNC-45影响的观点。功能缺失。尽管该方法可为了解海兔中蛋白质稳态的调控提供见解，也可应用于其他系统，如不同的模式生物。

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使用秀丽隐杆线虫作为模型系统研究多细胞生物中的蛋白质稳态

基础 Caenorhabditis elegans 实验方法：同步化与观察

我们介绍了在秀丽隐杆线虫（C.

一种用于淀粉样病变研究的 Caenorhabditis elegans 模式系统

我们在此介绍一种用于大规模培养胚胎的改进方案 秀丽隐杆线虫 细胞。胚胎 秀丽隐杆线虫 培养的细胞 体外 使用该方法，似乎能够以细胞特异性的方式分化并重现基因的表达。可对其他组织中特定细胞类型进行直接访问或分离的技术可应用于 秀丽隐杆线虫...

一种培养胚胎期 C. elegans 细胞的方法

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秀丽隐杆线虫——一种多功能的模式生物 体内 研究宿主-微生物相互作用的模型

本研究概述了利用免费提供的图像处理工具，对C. elegans中的突触大小与定位、肌肉形态以及线粒体形态进行定量测量的方法。该方法可使未来在 C.

用于研究细胞结构与细胞器形态的定量方法 秀丽隐杆线虫

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霍乱弧菌：研究细菌致病机制的模式生物——访谈

了解如何使用秀丽隐杆线虫作为模型系统研究多细胞生物中的蛋白质稳态。本方法通过行为学检测、免疫荧光显微镜和蛋白质印迹分析，帮助研究人员在生物体、细胞和蛋白质三个水平上监测蛋白质错误折叠，从而深入理解蛋白质稳态与衰老及神经退行性疾病的关系。

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