使用 Caenorhabditis elegans 作为模式系统研究多细胞生物中的蛋白质稳态

在可进行遗传操作的多细胞生物秀丽隐杆线虫（C. elegans）中，以下实验的总体目标是在三个层面上监测蛋白质错误折叠：个体、细胞和蛋白质层面。行为表型（如运动能力或热抗性）可作为个体水平上蛋白质稳态变化的读出指标，这些表型可能是温度敏感型或自然发生的。利用温度敏感或天然存在的亚稳态蛋白质来追踪蛋白质的错误定位，而错误定位可能与蛋白质错误折叠相关。

一种离体部分消化实验可直接监测蛋白质的稳定性。根据热耐受实验、免疫荧光显微镜和蛋白质印迹分析的结果，可以显示在不同培养温度下蛋白质稳态能力的变化。这些实验操作将由我实验室的研究生进行演示。

行为实验将由 Ishido 演示，Shai 将演示免疫染色和 ANA 荧光检测，Sheron 将演示部分消化实验。本测量温度耐受性的实验方案包含动物同步化的 preparatory 步骤以及运动能力检测，两者均在文本方案中有详细描述。首先收集至少含有 20 只同步化动物的重复样本。

在24个含有450微升热激缓冲液的良好培养孔中，向每孔补充9微升细胞毒素。现在将该培养板转移至加热浴中。

热激的温度和持续时间在很大程度上取决于培养条件。特别是培养温度会影响动物的存活率，可通过监测其对染料的摄取情况来评估。使用配备TXR滤光片的荧光体视显微镜观察，摄取染料的个体即为已死亡动物。

该技术相较于现有方法（如 kine）的主要优势在于，通过人工评分对动物死亡率进行视觉读取，使得本实验更加快速且可重复性更高。在所需阶段，将至少 30 只动物转移至含有 M 九缓冲液的微量离心管中。使用 M 九缓冲液通过数次短暂、低速的离心步骤清洗动物，并将其重悬于 M 九缓冲液中。

然后将试管置于冰上几分钟以冷却。冷却后，去除多余的液体，并将试管在500微升冰冷的4%多聚甲醛中孵育。

每种被检测蛋白质的孵育时间均需进行校准，在室温下通常应为5至30分钟。接下来，用pH值为7.2的PBST缓冲液通过离心方式洗涤固定后的样本动物3次。离心步骤通常均在3000 RPM条件下进行1至2分钟，除非另有说明。

在通风橱中，弃去大部分上清液，将沉淀重悬于 1 毫升含巯基乙醇的溶液中。随后将样品在 37 摄氏度孵育过夜，次日在通风橱中轻轻摇动孵育。用 PBST 缓冲液通过离心和重悬的方式洗涤样品三次。

用 50 至 100 微升 PBST 完成洗涤，再次离心后去除大部分 PBST。接着加入 100 至 150 微升胶原酶溶液，将样品在 37 摄氏度下以强烈振荡条件孵育。可使用恒温混匀仪或摇床培养箱。

五分钟后，开始在体视显微镜下进行定期检查。当五分之一的动物组织已被破碎时，将试管置于冰上以终止反应。此步骤极为敏感。

处理时间取决于固定条件，且不同品系之间可能存在较大差异。过长的孵育时间可能导致动物样本完全降解。每次使用新的酶批次前必须校准条件，并应密切监测降解过程。

接着，用PBST清洗动物样本两次。通过离心收集动物样本，并移除大部分PBST。然后加入1毫升BA溶液，在室温下轻轻摇动孵育1小时。再次通过离心收集动物样本，并将其重悬于200微升的b, A溶液中。现在加入一抗，并在室温下轻轻摇动，开始过夜孵育。

这些参数需要进行校准。接下来，通过离心洗涤动物样本。在 1 毫升的 b、A 中重悬，并在室温下轻轻混匀孵育 15 分钟至 1 小时。

此时，可选择性地加入荧光染料。接下来，用 BA 缓冲液再重复洗涤三次，最后在 100 微升 BA 缓冲液中重悬，其中加入适当的一抗对应的荧光标记二抗，稀释比例为 1:100。将样品在室温下避光、摇动孵育数小时，以完成二抗结合。

用 a、b、a 溶液洗涤三次。然后将动物样本置于载玻片上，首先用 Resus 悬浮于 10 µL 的 a b, a 溶液中，再用宽口移液管吸取一到二微升样品滴加到每张载玻片上，加入等体积的封片介质，并盖上盖玻片。最后用指甲油轻轻封固载玻片。

载玻片可于负20摄氏度长期保存。通常，初次接触该方案的研究人员会遇到困难，因为该方案步骤较长，且包含多个可能影响其效率的环节，导致问题排查较为困难。首先将约1560毫米培养皿中的动物收集至一到两毫升M9缓冲液中。

动物不应过于拥挤。用M9缓冲液通过离心和重悬动物的方式清洗数次。最后一次离心后，将动物重悬于100 µL的M9缓冲液中。

然后将动物快速冷冻，并在冰上使用预冷的研钵和研磨钻头研磨样品。需频繁暂停以检查动物是否已充分研磨。待动物完全破碎后，估算线虫提取物的体积。

然后加入等体积的2×线虫裂解液，将样品置于冰上孵育15分钟。接着通过预冷的离心步骤去除碎片，并将上清液转移至新的微量离心管中。经Bradford法测定后，将样品稀释至每毫升含3至3.5毫克蛋白质。

然后按1:1200的比例加入 freshly prepared chilled camo trypsin 溶液。此时，将样品置于孵育状态1小时。在孵育期间，定期取出20 µL等分试样，立即与SDS缓冲液混合，随后在96 °C下加热5分钟。

上样并运行样品，随后进行Western血液分析，以确定蛋白的相对稳定性。在进行此操作时，需注意切勿向消化样品中添加蛋白酶抑制剂混合物，而应迅速操作并将样品置于冰上。肌肉伴侣蛋白on 45中的E781K ts突变会严重影响肌球蛋白的折叠与组装，从而影响动物的运动能力。

当这些突变体在高于20摄氏度的温度下培养时，它们会完全瘫痪，但在15摄氏度时则不会。野生型动物在25摄氏度下培养后若经历长时间热激，大多数能够存活；而在15至20摄氏度下培养以监测对热激反应的有效修饰因子时，对照应激条件下的野生型动物存活率上升至70%。

将动物置于37摄氏度下进行6小时的热激处理。在成虫期第一天，通过细胞橙摄取实验检测其存活率。死亡的动物用白色箭头标示，存活的动物用黄色箭头标示。

使用特异性抗体对多种亚稳态蛋白的定位进行了可视化观察。例如，在限制性条件下，paramin ts 未定位于肌原纤维的肌节，而是错误定位于多晶聚集体中。同样，在限制性温度下，肌球蛋白 TS 形成的是无序的纤维结构，而非高度有序的丝状结构。

表达多种TS突变蛋白且与myo-3共同表达的动物，其肌球蛋白丝状结构的组织迅速恶化，通过监测GFP在肌球蛋白构象变化中的信号可检测到这一现象，表明肌肉细胞的折叠能力发生了改变。与UNC-45 TS共同表达的肌球蛋白重链的蛋白酶解片段模式，与野生型动物中肌球蛋白的消化谱相比具有明显差异，支持了肌球蛋白的折叠受到UNC-45影响的观点。

功能缺失。尽管该方法可为了解海兔中蛋白质稳态的调控提供见解，也可应用于其他系统，如不同的模式生物。