使用秀丽隐杆线虫作为模型系统研究多细胞生物中的蛋白质稳态

在遗传易处理的后生动物 CENO R elegance 中，以下实验的总体目标是监测三个水平的蛋白质错误折叠，即生物体、细胞和蛋白质。行为表型（如运动或耐热性）可作为生物体水平、温度敏感或自然发生的蛋白质稳态变化的读数。元稳定蛋白用于跟踪蛋白质错误定位，这可能与蛋白质错误折叠有关。

离体部分消化测定直接监测蛋白质稳定性。基于热电阻测定、免疫荧光显微镜和蛋白质血液分析，结果可以显示不同培养温度下蛋白质稳态能力的变化。这些程序将由我实验室的研究生演示。

行为测定将由 ish ido 演示，Shai 将演示免疫染色和 ANA 失败，sheron 将演示部分消化。该测量耐温性的方案伴随着同步动物和运动测定的准备步骤。文本协议中描述了两者，首先收集包含至少 20 个同步动物的重复。

在 24 个含有 450 微升热休克缓冲液的 Well-Play 孔中。在每个孔中补充 9 μL 细胞毒素。现在将板转移到加热的浴槽中。

热休克、温度和持续时间在很大程度上取决于生长条件。特别是，培养温度通过监测动物的死亡摄取来对动物的存活率进行评分。使用带有 TXR 滤光片的荧光立体镜，占据骰子的动物已经死亡。

这种技术的主要优点是现有方法（如 kine）的主要优点，即手动评分的耐受性是使用动物死亡率的视觉读数，这使得这篇文章更快、更可重复。在所需的阶段，将至少 30 只动物转移到含有 M nine 缓冲液的微量离心管中。通过执行短而低速的离心步骤，用 M nine 清洗动物几次，然后 Resus 将它们悬浮在 M nine 中。

然后将试管放在冰上几分钟冷却。冷却后，去除多余的液体并孵育试管。在 500 微升冰冷的 4% 多聚甲醛中。

需要针对检查的每种蛋白质校准孵育时间，在室温下应约为 5 至 30 分钟。现在，通过离心，用 pH 值为 7.2 的 PBS 吐温洗涤固定的动物 3 次。除非另有说明，否则始终以 3000 RPM 的转速离心 1 或 2 分钟。

在通风橱中，去除大部分上清液，并将沉淀重悬于 1 mL 束生硫醇溶液中。然后将动物在 37 摄氏度下孵育过夜，第二天在引擎盖中轻轻摇晃。通过离心和 Resus 用 PBST 洗涤动物 3 次。

用 50 至 100 微升 PBST 完成洗涤，并在再次离心后去除大部分 PBST。接下来，加入 100 至 150 微升胶原酶溶液，并在 37 摄氏度下以强烈搅拌孵育动物。使用热混合器或振荡培养箱。

五分钟后，开始在立体显微镜下进行定期检查。当五分之一的动物坏掉时，将试管放在冰上以停止反应。此步骤高度敏感。

治疗的持续时间取决于固定条件，并且在不同菌株之间可能会有很大变化。长时间的孵育可能导致动物完全降解。在每个酶批次之前，必须校准条件，并应仔细监测降解。

接下来，在 PBST 中洗涤动物两次。通过离心收集动物并去除大部分 PBST。然后加入 1 毫升 BA 溶液，然后在室温下轻轻摇动孵育一小时，离心收集动物，并将它们重悬于 200 微升 a b，A.现在加入一抗，并在室温下轻轻摇动开始过夜孵育。

这些参数确实需要校准。接下来，通过离心洗涤动物。将它们重悬于一毫升 a、b、A 中，并在室温下轻轻混合孵育 15 分钟至一小时。

此时，可以选择添加荧光染料。接下来，再重复 a BA 缓冲液洗涤 3 次，并通过 Resus 悬浮在 100 微升 BA 中和适当的荧光标记二抗以 1 比 100 稀释来完成洗涤。将样品在室温下摇动孵育数小时，避光以清除二级化合物。

用 a、b、a 进行三次洗涤。然后首先通过 Resus 将动物安装在载玻片上，将它们悬浮在 10 微升的 a b、a 中，然后使用宽口径移液器将 1 或 2 微升样品转移到每个载玻片上，加入等体积的安装介质并覆盖载玻片。用指甲油轻轻密封载玻片。

载玻片可以在零下 20 摄氏度下长时间存放。通常，刚接触该协议的人会很挣扎，因为该协议很长，并且包含许多可能影响其效率的步骤，使故障排除变得困难。首先将动物从约 1560 毫米板收集到 1 或 2 毫升 M 9 缓冲液中。

动物不应该过度拥挤。用 M nine 缓冲液离心和复苏悬浮动物，将动物洗涤几次。最后一次旋转后，复苏将动物悬浮在 100 微升 M 9 缓冲液中。

然后快速冷冻动物，使用冷冻的研杵和钻孔，在冰上研磨样品。经常停下来检查动物是否被充分研磨。一旦动物完全粉碎，估计蠕虫提取物的体积。

然后加入等体积的 2 x 蠕虫裂解液，并将样品在冰上孵育 15 分钟。接下来，通过冷却的离心循环去除碎片，并将上清液转移到干净的微量离心管中。Bradford 测定后，将样品稀释至每毫升 3 至 3.5 毫克蛋白质。

然后以 1 比 1200 的比例加入新鲜制备的冷藏迷彩胰蛋白酶溶液。此时，将样品设置为孵育一小时。在孵育过程中，定期取 20 微升等分试样，立即与 SDS 缓冲液混合，然后在 96 摄氏度下混合 5 分钟。

用完样品，然后进行蛋白质免疫印迹血液分析，以确定蛋白质的相对稳定性。在尝试此程序时，请务必记住不要将蛋白酶抑制剂混合物添加到消化样品中，而是快速将样品保存在冰上。45 上肌肉伴侣中的 E 781 K ts 突变强烈影响肌球蛋白折叠和组装，从而影响动物的运动。

当这些突变体在 20 摄氏度以上的温度下生长时，它们完全瘫痪，但在 15 摄氏度时却没有。当在 25 摄氏度下饲养的野生动物受到长时间的热休克时，大多数动物都存活了下来。如果在 15 至 20 摄氏度下饲养以监测对热休克反应的有效调节剂，则只有 30% 的存活率，而野生型动物的控制应激条件则提高到 70% 的存活率。

动物暴露在 37 摄氏度的热休克下 6 小时。在成年的第一天，通过细胞橙摄取测定来测定生存率。死去的动物用白色箭头表示，活的动物用黄色箭头表示。

使用特异性抗体观察几种元稳定蛋白的定位。例如，在限制性条件下，paramin ts mis 定位于多晶组件而不是肌肉肌节。同样，肌球蛋白 TS 在限制温度下形成杂乱无章的细丝，而不是高度有序的细丝结构。

表达与 myo three 共表达的各种 TS 突变蛋白的动物。通过监测肌球蛋白确认中的 GFP 变化检测到的 GFP 显示肌丝组织的快速恶化，可以反映肌肉细胞折叠能力的变化。与 UNC 45 Ts 共表达的肌球蛋白重链的蛋白水解断裂模式与野生型动物的肌球蛋白消化曲线相比显示出明显的特征，支持肌球蛋白折叠受 UNC 45 影响的说法。

功能丧失。虽然这种方法可以深入了解 Sea Elegance 中蛋白质稳态的调节，但它也可以应用于其他系统，例如不同的模式生物。