Name: 海胆受精卵的高通量显微注射 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-21T21:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 40 s
Description: 学习海胆受精卵的高通量显微注射技术，用于发育生物学研究。该方法可高效递送RNA和蛋白质，实现基因功能分析，为早期胚胎发育机制研究提供可靠工具。

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感谢 Santiago Suarez 对手稿的审阅，以及 Betty Cowgill 在摄影方面的协助。同时感谢匿名审稿人提出的宝贵意见。本工作由特拉华大学研究基金资助。

1. 鱼精蛋白硫酸盐（PS）包被培养皿的制备
<ol>
	<li>将0.5 g硫酸鱼精蛋白（PS）加入50 ml去离子蒸馏水（ddH₂O）中，配制1%的硫酸鱼精蛋白溶液。2在50 ml锥形管中加入O）。在室温下使用台式摇床高速振荡1-2小时，确保PS完全溶解。该溶液可在4 °C保存至少3个月（每次使用前需确保凝胶状沉淀物完全溶解）。3.</li>
	<li>取一套直径60 mm、高度15 mm的聚苯乙烯培养皿，将皿盖和皿底分别平放在实验台上。</li>
	<li>在每个培养皿中加入1% PS溶液（皿底和皿盖均可使用），用量以覆盖表面为宜，静置至少2分钟。剩余的PS溶液在4 °C保存条件下可在3个月内重复使用多次。</li>
	<li>将经 PS 处理的培养皿放入盛有蒸馏水（dH₂O）的烧杯中2O）。将烧杯置于流动的 dH₂O 下冲洗2至少静置 10 分钟。</li>
	<li>PS包被的培养皿可立即使用，或晾干后储存。应加盖以防止灰尘积聚。可在室温下保存1个月。3.</li>
</ol>
2. 获取海胆配子并将卵固定在PS包被的培养皿上以进行显微注射
<ol>
	<li>通过轻轻摇晃海胆或向其体腔内注射不超过 1 ml 的 0.5 % KCl 溶液，诱导平滑肌收缩以排放配子3&#160;（图 2）。</li>
	<li>若动物为雄性（表现为白色精子），将精子直接从个体表面干燥收集至 1.5 ml 离心管中。干燥的精子可在 4 °C 下保存一周，且生物学功能无明显损失。</li>
	<li>若动物为雌性（由于卵黄含量呈现黄色），将生殖孔浸入盛满海水的烧杯中以收集其配子。卵子将从生殖孔释放，并依靠重力沉降到底部。</li>
	<li>使用 80 μm 尼龙滤网过滤卵子，去除如动物棘刺等杂质。若在排卵后 5–7 小时内使用卵子，可获得最佳实验结果。</li>
	<li>去除卵子胶状外膜：
	<ol>
		<li>为约 1 ml 卵子准备 100 ml 酸化海水。使用 0.5 M 柠檬酸将海水 pH 从 8.0 调节至 5.1–5.2。pH 过低会降低受精率，而 pH 过高则会导致卵子无法附着于聚苯乙烯（PS）包被的培养板上。</li>
		<li>将卵子（不超过 1 ml）加入酸化海水中，并在冰上静置 10 分钟使其沉降。或者，在处理过程中可轻轻旋转混匀卵子以促进胶膜去除。采用此方法可在 3–4 分钟内有效去除 S. purpuratus 卵子的胶膜。</li>
		<li>小心倾去酸化海水，加入新鲜海水，并再次将卵子置于冰上静置沉降。去胶膜后的卵子可在冰上保存长达 6 小时，且不会影响后续受精。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 排列卵子
<ol>
	<li>配制 3-氨基-1,2,4-三唑（3-AT，分子量 = 84.08）的 1 M 储存液：将 0.84 g 3-AT 溶解于 10 ml 去离子水（ddH2O）中。该溶液可在 4 °C 下保存最多 6 个月。</li>
	<li>通过将 50 μl 的 1 M 储存液加入 50 ml 预冷的海水，配制 1 mM 的 3-AT 工作液。将溶液置于冰上保存。</li>
	<li>准备口吸管（图 3），用于轻柔操作卵子：
	<ol>
		<li>使用玻璃微量移液管（100&#160;x 外径 1.09 mm）手工拉制移液管尖端。用双手握住移液管，在明火上加热。当玻璃开始熔化时，小心地朝相反方向拉伸移液管两端。</li>
		<li>将一根拉好的移液管连接至一段塑料管（内径 1.14 mm），并用 Parafilm 密封。塑料管长度应约为 50–70 cm。</li>
		<li>在与玻璃管相对的塑料管末端插入一个无菌过滤的 P20 或 P200 吸头，作为口含部分。</li>
		<li>用剪刀剪切玻璃微量移液管的末端，以调节尖端直径。最佳直径略大于卵子直径（80 μm）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>向每个聚苯乙烯（PS）包被的培养皿（底部或盖子）中加入 4 ml 的 1 mM 3-AT 海水溶液。</li>
	<li>取出口吸管，将 P20/P200 吸头放入口中，并用牙齿固定。吸取卵子前，先吸取少量海水。在吸取卵子之前保持一段液柱，有助于最大程度地控制口吸管操作技术。</li>
	<li>将微量移液管尖端靠近卵子，轻柔地吸取数百个卵子进入移液管中，并将卵子限制在玻璃微量移液管内。</li>
	<li>在培养皿中，沿直线排列去胶膜卵子：一边缓慢吹出卵子，一边沿直线移动移液管尖端。应在注射前立即排列卵子，因为长时间暴露于 3-AT 海水中可能导致受精问题3。此外，阳离子粘附剂（如 PS）可能对卵子具有毒性，尤其在已去除受精膜的情况下，不建议长时间将胚胎暴露于此类试剂中。</li>
	<li>使用玻璃移液管在排列卵子的附近划一道划痕。该划痕可用于折断注射针尖，以按需调节溶液流出量。或者，也可在向培养皿中加入 3-AT 海水前预先制作划痕。</li>
</ol>
4. 海胆受精卵的显微注射
<ol>
	<li>打开显微注射工作站。此处我们描述的是使用 FemtoJet 注射系统。</li>
	<li>使用拉针仪制备注射毛细管。一根理想的针尖示例如图4所示。注意：对于 RNA 注射，注射毛细管应预先处理以避免 RNase 污染31：
	<ol>
		<li>将注射毛细管放入 50 ml 锥形管中，并加入 50 ml 过滤的甲醇/盐酸混合液（9:1）。充分震荡后，静置过夜，但不超过 10 小时。</li>
		<li>倒去甲醇/盐酸溶液，并用过滤的甲醇在同一管中冲洗毛细管两次。</li>
		<li>尽可能排尽甲醇，并将毛细管在真空冷冻干燥机中干燥过夜，以确保甲醇完全去除。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>小心地将毛细管安装到上样夹持器上，并使用微量移液吸头加入&#60;0.5 μl 样品溶液。样品溶液通常含有 20% 甘油，具体比例取决于所注射的材料3。</li>
	<li>将装有成列卵子的培养皿放置在显微镜载物台上（通过目镜观察时，卵子应呈垂直排列），并对焦于卵子。</li>
	<li>小心地将已上样的毛细管安装至显微注射夹持器上，并调整针的位置，使针尖在视野中央清晰对焦。</li>
	<li>按下按钮施加最大压力以清洗针头，溶液应从针尖流出。必要时调节压力：注射压力应在 90–360 hPa 范围内，补偿压力约为注射压力的 1/3。</li>
	<li>通过向未受精卵中注射来调节溶液流速。使用操纵杆显微操作器，将注射针尖引导至未受精卵。为便于针头进入，可用螺丝刀等硬物轻轻敲击载物台，使针尖产生轻微颤动。应在卵内观察到注射液团的形成（图5）。</li>
	<li>若未观察到注射液团，可将针尖略为抬高至卵子上方，找到培养皿上的划痕标记，并将其调整至视野中央。轻触针尖至划痕处，以打断注射针尖。调节注射压力和补偿压力，确保注射液团直径不超过卵子直径的 1/5（1–2 pm）。</li>
	<li>完成注射液团校准后，通过加入稀释精子（1:1,000）或 1–2 μl 精子进行卵子受精。轻轻混匀，避免打乱成列的卵子。</li>
	<li>一旦观察到受精膜形成，立即开始注射（图5）。使用载物台控制器沿卵列移动，利用操纵杆显微操作器控制针头穿刺尽可能多的受精卵进行注射。</li>
	<li>10–15 分钟后，新受精的卵子将变硬，无法继续注射。从载物台上取下培养皿，并使用塑料巴氏吸管在 3-AT 海水中小心吸除精子。</li>
	<li>切勿让受精卵干燥。迅速加入新鲜预冷的海水以覆盖培养皿。将胚胎在 15 °C 下孵育。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明&#160;无竞争性财务利益或其他利益冲突。

显微注射是一种强大的技术，可用于将多种物质（如DNA、mRNA、重组蛋白、基因功能缺失和功能获得试剂、染料及其组合）递送至多种生物的卵细胞、胚胎和细胞中1-7。然而，在设计显微注射实验时，应考虑若干重要因素。
必须充分考虑所递送处理物的溶解度以及注射体积。如果显微注射溶液容易形成即使轻微的沉淀，也会导致显微注射针头堵塞。通常建议在将溶液装入针头前，对其进行超过15分钟的离心处理，以确保去除溶液中任何可能的沉淀物3。另一种方法是将溶液通过Millipore离心柱过滤。如果无法避免堵塞，可通过再次轻轻折断针尖来尝试疏通针头，但若针尖过宽，则难以控制溶液的流出量。注射过量溶液可能对胚胎产生毒性；此外，过宽的针尖会导致注入各个胚胎的溶液体积差异增大。向新受精卵中注射的体积也必须进行适当调整。可通过在不同拉制参数下制备针头，并将溶液注入油中形成液滴，从而校准注射体积。该方法可通过测量液滴的直径（进而计算体积）实现定量32。我们发现，在新受精卵中注射的溶液量不应超过合子直径的1/5，如图5所示。...

高效且可重复的处理递送是研究人员面临的主要方法学挑战之一。目前已建立多种方法，用于将处理溶液瞬时递送至卵子、胚胎和细胞中。这些方法包括电穿孔（利用短暂的电脉冲在细胞膜上形成瞬时孔隙）1,2、脂质体转染（通过含处理剂的脂质体与细胞膜融合实现递送）1、微粒轰击法1（将DNA沉淀于微米级金属颗粒表面，随后以高速穿透细胞），以及转导（利用病毒作为外源基因的递送载体）。目前，显微注射是唯一能够以100%效率递送任意溶液且所需试剂最少的方法。此外，单次注射溶液可包含多种处理剂组成的复杂混合物。该技术已成功应用于多种物种的卵子和胚胎显微注射，如海胆3,4、斑马鱼5、小鼠6、青蛙7和牛8，以及组织培养中的单个细胞9。在发育后期阶段对单个卵裂球进行注射也已有报道10-12。
目前的显微注射方法基于Hiramoto最初描述的压力注射法10，但该技术已取得显著优化进展。其他文献中已详细描述了优秀的显微注射技术11，本文则介绍一种目前用于显微注射紫海胆（Strongylocentrotus purpuratus）新受精卵的具体方法。一个多世纪以来，海胆一直是一种重要的实验模型15,16。在进化上，海胆与脊索动物（包括人类）关系密切，对其基因组的分析表明，它们拥有与人类相同的主要基因家族17。海胆可产生大量同步发育且透明的胚胎，易于进行实验操作。利用海胆作为模式生物，科研界已在受精过程18-21、细胞生物学过程22-24以及基因调控网络（GRNs）25-28的研究方面取得了重要进展。
对海胆合子进行显微注射需要多个步骤。首先，在注射前需将卵细胞固定（如下所述）。显微注射培养皿经鱼精蛋白硫酸盐（protamine sulfate, PS）包被处理，形成带正电荷的表面，以便带负电荷的卵细胞能够附着3。通过将卵细胞在酸性海水（pH 5.15）中孵育10分钟以去除胶状层，随后用天然海水或人工海水（pH 8.0）清洗两次。去胶后的卵细胞需在含1 mM 3-氨基三唑（3-aminotriazole, 3-AT）的PS包被培养皿中小心排列成一条直线，3-AT的作用是抑制因受精而从卵细胞皮层颗粒分泌的卵过氧化物酶活性29。此步骤对于防止受精膜硬化、便于显微注射针头穿入至关重要。作为1 mM 3-AT的替代方案，也可使用10 mM对氨基苯甲酸（paraminobenzoic acid, PABA）。将注射溶液使用专用的微量上样吸头装入显微注射针，并安装至连接于显微操作仪和压力装置的针夹上（图1）。每根注射针可在不同实验日多次用于对多个合子进行显微注射。显微注射操作可持续进行10至15分钟，直至合子开始硬化。随后用海水清洗合子，并在15 °C条件下培养。当胚胎发育至孵化囊胚阶段时，会释放孵化酶，降解受精膜的组分30，从而自然脱离PS包被的培养皿。如有需要，可通过口吸管或巴斯德吸管向胚胎轻轻吹入海水，温和地将胚胎从培养皿上分离。该方法可在单个培养皿上高效且可靠地完成对100至400个新受精卵的显微注射，为后续分析提供了高通量的技术手段。

<table><tbody><tr><td>玻璃巴斯德吸管</td><td>VWR</td><td>14673-043</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>倒置显微镜&amp;nbsp; Axiovert 40 &amp;deg;C</td><td>Zeiss</td><td>4109431007990000</td><td>注射显微镜</td></tr><tr><td>微量加样器吸头（Microloader tips）</td><td>Eppendorf</td><td>5242 956.003</td><td>用于加载注射溶液</td></tr><tr><td>尼龙滤网 80&amp;nbsp;&amp;mu;m</td><td>Amazon.com</td><td>03-80-37</td><td>过滤卵以去除碎片</td></tr><tr><td>P20 或 P200 气溶胶阻隔移液器吸头</td><td>Fisher Scientific</td><td>02707432 或 02707430</td><td>口吸移液装置的组成部分</td></tr><tr><td>Parafilm 封口膜</td><td>Fisher Scientific</td><td>13 374 12</td><td>口吸移液装置的组成部分</td></tr><tr><td>聚乙烯管</td><td>Intramedic</td><td>PE-160</td><td>口吸移液装置的组成部分</td></tr><tr><td>硫酸鱼精蛋白</td><td>MP Biomedicals, LLC</td><td>194729</td><td>将去胶膜的卵固定在注射培养皿上</td></tr><tr><td>海胆 &lt;em&gt;S. purpuratus&lt;/em&gt;</td><td>Pt. Loma 海洋无脊椎动物实验室</td><td>N/A</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>海水</td><td>任意宠物商店</td><td>Instant Ocean</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>无菌 60 mm × 15 mm 聚苯乙烯培养皿</td><td>Fisher Scientific</td><td>0875713A</td><td>注射用培养皿</td></tr><tr><td>三轴粗调微操作仪 MMN-1</td><td>Narishige</td><td>9124</td><td>操控注射针</td></tr><tr><td>三轴操纵杆式油压精细微操作仪 MMO-202ND</td><td>Narishige</td><td>9212</td><td>操控注射针</td></tr><tr><td>转移吸管</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-9AM</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>垂直&amp;nbsp; 玻璃微电极拉制仪&amp;nbsp;</td><td>Narishige</td><td>PC-10</td><td>拉制注射针</td></tr></tbody></table>

高通量海胆合子显微注射

High Throughput Microinjections of Sea Urchin Zygotes

向细胞和胚胎中进行显微注射是一种常用的技术，用于研究多种生物学过程。该方法将少量处理溶液装入显微注射针中，通过物理方式直接注射到固定化的单个细胞或胚胎内。尽管该操作需要经过初步培训才能实现高通量递送，但显微注射具有递送效率高、重复性好等优点，可稳定地将多种处理溶液（包括复杂的样品混合物）递送至细胞、卵子或胚胎中。显微注射的应用包括递送DNA构建体、mRNA、重组蛋白，以及实现基因功能获得或功能缺失的试剂。在注射溶液中加入荧光或比色染料，可即时可视化递送效果，并作为准确归一化递送溶液体积的工具。本方法可在10至15分钟内完成100至400个海胆合子的显微注射。

GFP 和 mCherry 报告基因载体 体外 转录后显微注射到新受精的卵中。胚胎在 15 °C 24小时（直至囊胚阶段），并使用Zeiss Observer Z1显微镜进行成像。报告基因构建体的注射未导致任何发育缺陷。图6）。为了定量分析荧光信号，以低倍率（100X）进行图像采集，以最大程度地捕获荧光像素（图6D-F). 使用 Axiovision 4.8.2.0 对荧光信号进行定量分析。在 100–200 个囊胚的群体中，荧光信号强度的标准误差未超过 1.5%（数据未显示）。
<img alt="用于DNA分析的显微镜装置，包括显微镜、显微注射器、控制单元和移液管。" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50841/50841fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
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显微注射是一种常用技术，用于将DNA构建体、mRNA、吗啉代反义寡核苷酸或其他处理物质导入多种物种的卵细胞、胚胎和细胞中。

向细胞和胚胎中进行显微注射是一种常用技术，用于研究多种多样的生物学过程。该方法通过将少量……注入目标细胞或胚胎内，以实现对特定分子、基因或信号通路的功能分析。

本实验的总体目标是对海胆受精卵进行高通量显微注射。为此，首先诱导海胆产卵，并收集雄性和雌性配子。随后使用酸化海水对卵进行去胶膜处理，并将卵固定在培养皿中呈单行排列。随后将精子加入卵子中使其受精，并在显微注射后对目标Mr.N.A进行功能缺失研究，或注射所需试剂或蛋白质。含有精子的三倍A.T.水被更换为新鲜海水。这些胚胎可用于观察其形态特征，以及特定RNA和蛋白质在时间和空间上的表达模式。与现有的电穿孔、脂质体转染、微粒轰击以及转导等方法相比，该技术的主要优势在于能够以100%的效率递送任意溶液，同时使用最少的试剂。该方法可在一次实验中，对单个培养皿中的数千个X高效且可靠地进行100至400次显微注射，为后续分析提供了高通量的解决方案。在开展本实验之前，请准备好所需的所有储备溶液和设备。参见随附文档中的配方，操作卵时需使用口吸移液管以实现轻柔处理。制备方法如下：用双手握住玻璃微量移液管，在明火上加热直至玻璃开始熔化，小心地将移液管两端朝相反方向拉伸，直至移液管断裂为两半。随后，将其中一根拉细的移液管连接至一段长度为 50 至 70 厘米的塑料管上。使用对苯二甲醛（paraform）以形成紧密密封。将无菌的 P20 或 P200 滤芯吸头插入管子的另一端，作为吹嘴使用。最后用剪刀剪断玻璃微量移液管末端，以调节尖端直径，最佳直径应略大于卵子直径，约为 80 微米。接下来，制备硫酸鱼精蛋白包被的培养皿。在实验台上放置 2060 个直径为 15 毫米的聚苯乙烯培养皿，并取下皿盖。这些培养皿也将用于倾注 1% 硫酸鱼精蛋白溶液（下文简称 PS 溶液）。向每个培养皿中加入足量溶液以覆盖表面，孵育至少 2 分钟。孵育结束后进行后续操作。移除 PS 溶液并保存以备后续使用。剩余的 PS 溶液在 4°C 条件下保存时，可在三个月内多次重复使用。将经过 PS 处理的培养皿放入盛有蒸馏水的烧杯中。然后将烧杯置于流动的蒸馏水中冲洗至少10分钟。PS包被的培养皿可立即使用，也可在空气中晾干后储存。应盖好以防止灰尘积聚。它们可在室温下保存长达一个月。使用拉针仪制备注射毛细管。拉针仪的参数设置需根据文中所述通过实验经验确定。为了诱导海胆产卵，使用网具从水箱中取出一只海胆，将其放置在纸巾上。然后拿起海胆并紧紧握住，进行摇晃。或者，按以下步骤进行腹膜内注射。将动物从水箱中取出后，用一只手固定动物，使用连接10毫升注射器的20号针头，向动物唯一的柔软部位——体腔膜内注射1毫升0.5摩尔的氯化钾溶液。注射后1至10分钟内，动物的性别将变得明显。雄性个体将开始释放白色精子，雌性个体将开始释放黄色卵子。若动物为雄性，使用移液器从动物体表直接采集干燥的精子，并转移至1.5毫升离心管中。干燥的精子在4°C条件下可保存一周，且不会显著丧失生物学功能。如果该动物为雌性，将其生殖孔浸入盛满海水的烧杯中，以收集其配

high-throughput-microinjections-of-sea-urchin-zygotes

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

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高通量海胆合子显微注射

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