FtsZ的聚合反应检测:简单的协议和注意事项
2013年11月16日
FtsZ 的聚合对于细菌细胞分裂至关重要。在本报告中，我们详细介绍了监测 FtsZ 聚合活性的简单方案，并讨论了缓冲液组成的影响。这些方案可用于研究 FtsZ 与影响 FtsZ 聚合的调节蛋白或抗菌药物的相互作用。
以下实验的总体目标是使用简单的测定和设备确定研究 FTSZ、聚合和活性的合适条件。这是通过在各种条件下进行 FDSC 聚合物沉降测定以找到 FDSZ 聚合的合适条件来实现的。作为第二步，我们进行光散射测定以实时研究 FDSZ 聚合。
接下来，我们进行 GTP 水解测定以确定 FT SC 的聚合相关 g gtpa 活性。获得的结果表明，哪些条件最适合基于沉淀、光散射和 GTP 水解的特定细菌来源的 FTSC 研究。这里显示的技术在任何实验室中都很容易使用，并且可以快速了解特定 FT a z 的聚合能力。我们发现，在存在其他蛋白质的情况下使用 FTAZ 时，选择正确的缓冲液尤为重要，我实验室的研究生 EVA crawl 将证明该技术。
首先，将 5 微升 100 毫摩尔氯化镁和 12 微摩尔细菌蛋白、FDSC 和/或 SEP F 添加到选定的聚合缓冲液中，该缓冲液具有不同的 pH 值和组成，如随附文本方案中所述。接下来，将试管放入具有摇动功能的培养箱中，并在 30 摄氏度和 300 RPM 的转速下孵育样品 2 分钟。试管充分混合后，从 100 毫摩尔储备液中加入 1 微升 GTP 或 GDP 混合物开始聚合，使最终浓度为 2 毫摩尔。
然后将样品放回振荡培养箱中再放置 20 分钟。接下来，使用 TLA 55 转子或等效的 24， 600 Gs（如果使用其他设备）在室温下以 20， 000 RPM 的速度将试管旋转 15 分钟。离心机完成后，将上清液转移到干净的试管中，并将沉淀保存以备后用。
取 20 微升转移的上清液，将它们与20 微升双倍浓缩样品缓冲液混合在单独的试管中。盖上盖子，将样品在 98 摄氏度下煮沸 10 分钟。接下来，向先前放置的每个沉淀部分中添加 50 微升 2 倍浓缩样品缓冲液，并在 98 摄氏度下将样品煮沸 10 分钟，以悬浮聚合物。
样品煮沸后，向装有沉淀物的试管中额外加入 50 微升软化水。接下来，将每个样品中的 10 微升上清液和沉淀并排加载到 10% SDS 页面凝胶上，并在 150 伏特下运行凝胶。凝胶完成后，取出凝胶并用 kumasi brilliant blue G two 50 染色。
然后对凝胶进行成像，并使用细胞术定量蛋白质，如随附的文本方案中所述。首先打开荧光光谱仪，让灯预热几分钟，以避免热波动。此外，打开循环水浴并将水温设置为 30 摄氏度，以保持 vete 室处于恒定温度。
随着系统预热，定义光谱仪的作参数。将检测器高压设置为 300 伏，将发射和激发波长设置为 350 纳米，狭缝宽度为 4 纳米。然后通过选择持续时间为 3， 600 秒的基于时间的采集来对数据采集协议进行编程。
小心清洁光程为 1 厘米的 200 μL 荧光探针，将其放入水浴中的清洁溶液中 5 分钟。接下来，为随附文本方案中描述的 9 种聚合缓冲液中的每一种制备 294 微升预混液，每种缓冲液含有 10 毫摩尔氯化镁和 12 微摩尔 FDSE 作为计算 300 微升的最终浓度。然后短暂涡旋混合物，将 196 μL 的第一聚合缓冲液转移到兽医中。
将其放入光谱仪中孵育 2 分钟，使样品温度达到 30 摄氏度。两分钟后，开始数据采集并等待 90 秒以验证信号是否稳定。然后加入 4 微升 100 毫摩尔 GTP 或 GDP。
混合样品并继续数据采集整整一小时。对列出的每个缓冲区重复这些步骤。在选定的聚合缓冲液中制备 1.5 毫升 2 毫摩尔 GTP。
此外，在相同的缓冲液中制备 0 至 40 μmol 范围内的磷酸盐标准稀释液。接下来，按照生物测定试剂盒中的说明制备孔雀石绿工作试剂。然后组成四种总体积为 360 μL 的预混液，一种含有来自枯草芽孢杆菌的 FDSZ，第二种预混液含有来自大肠杆菌的 FDSE。
预混液 3 和 4 用作对照，含有 EDTA 而不是氯化镁。接下来移液 20 微升等分试样的预混液和磷酸盐标准品。在 A-Q-P-C-R 96 孔板中，使每种预混液有 16 个孔，磷酸盐标准品的排列如此处所示。
将 180 微升 2 毫摩尔 GTP 原液移液至板的最后一个泳道。然后将板放入 PCR 机器中。运行一个程序，将单个周期设置为 30 摄氏度，持续 40 分钟。
在第二个 96 孔板移液器中，将 20 微升孔雀石绿工作试剂等分试样放入孔中，A 1 到 H 10。然后，在实验要求 A 1 到 H 8 的 60 微升聚合缓冲液中，接下来在 20 微升 2 毫摩尔 GTP 溶液中加入板每个泳道中的孔中。如图所示，以预定的时间间隔进行一次检测，以检查不同时间点的反应。
30 分钟后，从板 1 的泳道 1 开始，将 20 微升从板 1 的泳道 1 转移到板 2 的泳道 1 中，然后上下移液以混合。这是孔雀石绿显色的起点，反应 30 分钟半后，将 20 微升从板 1 的泳道 2 转移到板 2 的泳道 2 中并混合。这是 20 分钟反应中孔雀石绿色显色的起点。
在33 分半钟后，以 20 微升 GTP 对剩余的泳道 3 到 7 重复这些步骤，直到板 1 上的泳道 8 并混合。然后将 20 μL 转移到第二个板上的泳道 8 并混合。这代表零分钟反应，是孔雀石绿色发展的起点。
34 分钟后，从含有磷酸盐标准品的板 1 的第 9 泳道向板 2 的泳道 9 中加入 80 微升，并在 34 分半钟后混合，将 80 微升从第一板泳道 10 中的第二磷酸盐标准品转移到板 2 的泳道 10 并混合。然后去除样品中的所有气泡，并在室温下再孵育板 25 分半钟。孵化后。
从实验开始 60 分钟开始，将板放入 96 孔读板器中。每 30 秒以 630 纳米测量板，持续 5 分钟，以便获取 10 个时间点。第一个板测量值将与泳道 1 相对应，第二个与泳道 2 相对应，因此每个泳道都有完全相同的时间来形成孔雀石绿色。
接下来，使用磷酸盐标准品校准曲线计算每个样品中的游离磷酸盐，并将数据绘制为磷酸盐释放随时间的变化。然后从曲线的线性范围计算 F-D-S-Z-G-T-P 水解活性。此处显示的是样品沉淀中 SEP F 和 FDSZ 的百分比。
只有当样品中同时存在 SEP F 和 GTP 时，才能在高于背景水平的沉淀中回收 FDSZ。这些小管中 SEPPE 和 FDSZ 的确切化学计量尚不清楚，但这些结果表明存在比 FDSZ 更多的 Seppe。此处显示了来自枯草芽孢杆菌和大肠杆菌的 FDSZ 的光散射，它们在 50 毫摩尔氯化钾缓冲液中以两毫摩尔 GTP 存在的方式组装。
F-D-S-E-B-S 的光散射信号比 FDSC EC 高 20 至 40 倍，具体取决于缓冲液的 pH 值。有趣的是，增加缓冲液中的氯化钾浓度并未显著影响 F-D-S-Z-E-C 的光散射信号，但 F-T-S-Z-B-S 信号在 pH 值为 7.5 时降低约 80 倍，在 pH 值为 6.8 时为 30 倍，在 pH 值为 6.5 时为 45 倍，与使用 50 毫摩尔氯化钾的缓冲液相比。使用游离磷酸盐的比色测定法在不同缓冲条件下测量 FDSZ 的 GTP 水解活性。
发现 FT SZ 的 GTPS 活性在每种不同的 pH 条件下都随着氯化钾浓度的增加而增加。在 50 毫摩尔氯化钾时，由于 F-D-S-Z-B-S 细丝在 50 毫摩尔处捆绑，GTPA 活性降低。由于 FDSC EEC 聚合物的分解速度更快，氯化钾 FDSZ EEC 的 GTPS 活性比 F-D-S-Z-B-S 高 3 到 6 倍。
最后，F-D-S-Z-B-S 和 F-D-S-Z-E-C 之间的 GTP 水解活性差异在 300 毫摩尔氯化钾时降低，这可能是由于 F-D-S-Z-B-S 细丝的束缚减少。按照此程序，可以进行其他金属，如电显微镜检查，以回答与样品中 fts 聚合物结构相关的其他问题。
概述
本文介绍了监测FtsZ聚合的协议，这对细菌细胞分裂至关重要。它强调了在研究FtsZ与调控蛋白和抗菌药物相互作用时，缓冲液组成的重要性。
关键研究组成部分
科学领域
- 微生物学
- 细胞生物学
- 生物化学
背景
- FtsZ是参与细菌细胞分裂的关键蛋白。
- 了解FtsZ聚合可以帮助开发抗菌策略。
- 缓冲液组成显著影响FtsZ活性。
- 简单的测定可以用于在各种条件下研究FtsZ。
研究目的
- 确定研究FtsZ聚合的最佳条件。
- 为研究人员提供可访问的协议。
- 探索不同缓冲液对FtsZ活性的影响。
使用的方法
- FDSC聚合物沉降测定以评估聚合。
- 光散射测定用于实时监测FtsZ聚合。
- GTP水解测定以评估聚合活性。
- 凝胶电泳用于蛋白质定量和分析。
主要结果
- 基于沉降和光散射确定了FtsZ聚合的最佳条件。
- 证明了缓冲液组成在FtsZ活性中的关键作用。
- 提供了适用于各种实验室环境的简单方法。
- 结果表明在不同条件下聚合能力存在显著差异。
结论
- 该研究为FtsZ聚合机制提供了宝贵的见解。
- 协议可以促进进一步研究FtsZ与药物的相互作用。
- 了解FtsZ动态可能有助于开发新的抗菌策略。
常见问题
Executive Industry Relevance
FtsZ polymerization assays provide a foundational in vitro platform for evaluating antibacterial compounds that target bacterial cell division. By enabling standardized assessment of FtsZ dynamics under controlled buffer conditions, these methods support early-stage target validation and mechanistic de-risking of antimicrobial candidates. The protocols facilitate reproducible quantification of polymerization, bundling, and GTPase activity, which are critical for structure-activity relationship studies in antibiotic discovery programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of FtsZ as a therapeutic target by measuring polymerization competence and regulatory protein interactions.
- Operational Value: Uses sedimentation and light scattering to distinguish polymerized from soluble FtsZ fractions, supporting target engagement assays.
- Predictive Value: GTP hydrolysis readouts correlate with functional polymerization cycles, offering a biomarker for compound-induced modulation.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Standardized 96-well GTPase protocol allows time-resolved phosphate detection with minimized well-to-well variability.
- Reproducibility: Fixed incubation times and master-mix preparation reduce technical noise in hydrolysis measurements across conditions.
- Scalability: Buffer matrix screening (pH, KCl) identifies optimal environments for FtsZ behavior, enabling assay transfer across bacterial species.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Directly models the bacterial cell division machinery, a validated target for broad-spectrum antibiotic development.
- Mechanistic De-risking: Distinguishes compounds that inhibit polymerization from those that promote aberrant bundling or tubulation.
- Translational Continuity: Sedimentation assays assess interactions with bundling proteins (e.g., SepF), informing combination therapy or resistance mechanism studies.
Pipeline & Workflow Integration
FtsZ polymerization assays sit at the intersection of target validation and lead optimization in antibiotic discovery, bridging biochemical mechanism with phenotypic outcomes.
- Discovery Biology: Sedimentation and light scattering assays confirm whether test compounds alter FtsZ assembly states, supporting target mechanism confirmation.
- Screening: The 96-well GTPase format enables medium-throughput screening of compound libraries for effects on FtsZ catalytic cycle.
- Analytics: Phosphate release over time provides quantitative activity metrics for hit confirmation and SAR development.
- Translational Research: Buffer optimization studies inform physiologically relevant conditions for preclinical efficacy testing.
- Enterprise Reuse: Core protocols (sedimentation, light scattering, GTPase) are modular and adaptable to diverse FtsZ orthologs and regulatory partners.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Direct measurement of FtsZ polymerization and hydrolysis activity enables mechanistic classification of antibacterial compounds.
- Operational Value: Standardized buffer conditions and timed reagent addition improve inter-laboratory reproducibility.
- Strategic Value: Early detection of cytoskeletal disruptors reduces risk of late-stage failure due to off-target cytoskeletal effects.
- Portfolio Impact: Supports go/no-go decisions based on target-specific activity rather than phenotypic screening alone.
Implementation Considerations
- Requires expertise in protein purification and assay optimization for GTPase and sedimentation readouts.
- Dependent on access to ultracentrifugation equipment (e.g., TLA55 rotor) for pelleting polymerized FtsZ.
- Necessitates standardization of buffer composition (especially KCl concentration) across experiments to ensure comparability.
- Adaptation to different bacterial FtsZ orthologs may require re-optimization of protein concentration and incubation time.
- Light scattering measurements require fluorometer calibration and temperature control to avoid artifacts from thermal drift.
