Name: 可视化细胞质流动过程中单细胞伤口愈合蓝斑宏声 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-19T13:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: 了解单细胞伤口愈合过程中细胞质流动的测量方法。本研究使用Stentor coeruleus作为模型生物，结合定制显微镜系统和粒子图像测速软件进行计算分析，揭示细胞在损伤后的主动响应机制。

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本工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目支持&#160;R01 GM090305（WFM）&#160;本文所述实验流程是在2012年夏季于海洋生物实验室生理学课程期间开发完成的，我们感谢学生、指导教师及课程负责人所提出的诸多有益且富有启发性的讨论。

1. 细胞培养与收集
<ol>
	<li>获取 喇叭虫 coeruleus 来自自然池塘的细胞，如 Tartar 所述7 或从商业供应商处获取（参见试剂）。</li>
	<li>在20 ºC避光条件下培养以维持培养物 喇叭虫 培养基（MSM），其配方改良自 Tartar 所描述的方法7 和 De Terra12 含 0.75 mM Na2CO3，0.15 mM KHCO₃3，0.15 mM NaNO3，0.15 mM KH2PO4，0.15 mM MgSO₄4，0.5 mM CaCl2，以及 1.47 mM NaCl。</li>
	<li>在MSM培养基中加入活体猎物作为碳源。培养菌液。 莱茵衣藻 采用标准培养方法的TAP培养基13喂食前，清洗 衣藻 MSM 中的细胞。添加 300 ml 培养基&#160;喇叭虫 培养物约 3 × 107 莱茵衣藻 细胞每2-3次&#160;周</li>
	<li>收集 喇叭虫 使用移液管将细胞用于手术。 喇叭虫 倾向于贴附在培养皿底部和侧壁，因此收集细胞时，需通过移液管尖吹入气泡，轻轻搅动培养液，直至细胞开始脱落并自由游动。</li>
	<li>使用带有宽口吸头的移液器捕获游动的细胞，以避免对细胞造成剪切损伤。</li>
	<li>用新鲜的MSM洗涤收集的细胞。</li>
</ol>
2. 显微外科手术器械的准备
<ol>
	<li>将两根玻璃搅拌棒置于本生灯或其他火焰上加热，直至末端开始熔化。</li>
	<li>将两根搅拌棒的熔融端相互接触，使熔融玻璃融合在一起。</li>
	<li>当两根搅拌棒之间形成一小滴熔融玻璃后，将其移离火焰，冷却1-2秒，然后迅速拉开，使其干净断裂。理想情况下，玻璃在冷却过程中会拉伸出细丝并平滑断裂，形成一根长约1-2 cm、末端具精细尖端的玻璃针（图2）。</li>
	<li>若所得玻璃针不理想，可将尖端折断并弃入玻璃废料容器中，搅拌棒可重复使用。</li>
</ol>
3. 显微手术与观察用细胞的制备（常规手术）
<ol>
	<li>使用涂有凡士林的方形橡胶印章在玻璃盖玻片上压出一个方形的凡士林围栏，制备成方形的凡士林腔室。</li>
	<li>向该方形凡士林腔室内加入含2%甲基纤维素的MSM培养基。</li>
	<li>将盖玻片放入塑料适配器中，使盖玻片可安装在配有标准载物片夹持器的显微镜上（图3）。</li>
	<li>将步骤1.6中洗涤后的细胞加入含甲基纤维素的MSM中，以减缓喇叭虫（Stentor）细胞的运动，使其在手术过程中保持固定位置。</li>
	<li>在甲基纤维素中调整细胞分布，使其均匀间隔，并推动细胞靠近盖玻片表面，以便成像时处于焦平面内。</li>
</ol>
4. 活体伤口愈合的高分辨率成像 喇叭虫
为了在低倍镜下对 Stentor 细胞进行手术切割的同时，以高分辨率对其进行成像，可构建一个&#34;双层&#34;显微镜系统，将解剖显微镜连接至倒置显微镜的目镜镜筒上，使解剖显微镜聚焦于载玻片上表面，而倒置显微镜则从载玻片下方进行聚焦。
<ol>
	<li>将载玻片置于倒置显微镜上（可使用蔡司Axiovert 200M或奥林巴斯IX80）。</li>
	<li>从支架上取下体视显微镜主体，确定其在倒置显微镜目镜上方的合适位置，以便通过体视显微镜以低倍率观察载玻片。</li>
	<li>改造一个纸板箱，使其厚度等于倒置显微镜目镜筒与体视显微镜之间的所需间距，然后使用实验室胶带将其固定在倒置显微镜上，实验结束后可轻松移除。根据倒置显微镜目镜头的具体结构和体视显微镜的尺寸调整纸板箱的厚度，确保样品位于视野范围内，且在安装后无需移动体视显微镜。</li>
	<li>将体视显微镜紧贴纸板箱并移动至载玻片成像清晰，再用实验室胶带将其固定在纸板箱上。最终装置如图4所示。</li>
	<li>使用微分干涉差（DIC）光学系统和20倍物镜通过倒置显微镜观察细胞。采用长工作距离DIC聚光镜，以便从上方留出足够空间进行显微手术操作。</li>
	<li>使用512 x 512 CCD相机以每秒2帧的速率采集图像&#160;。</li>
	<li>在开始切割细胞前即启动图像采集，以记录初始的胞质流动模式，并观察损伤及伤口愈合过程的各个阶段。</li>
	<li>当细胞恢复正常的形态和/或活跃运动能力时停止采集，以便可视化并测量整个再生过程中的胞质运动。</li>
</ol>
5. 分析伤口愈合过程中的胞质流动
使用粒子图像测速法（PIV）测量胞质流动。该技术在流体动力学研究中已常规应用，能够在流体中不存在可单独追踪的颗粒时生成流动场。PIV 已被用于通过透射光显微镜成像细胞质中可见的亚细胞囊泡及其他结构，进而测量胞质流动14。
<ol>
	<li>从网站 <a href="http://pivlab.blogspot.com/">http://pivlab.blogspot.com/</a> 下载用于粒子图像测速（PIV）的 MATLAB 软件包 PIVLab。</li>
	<li>在 MATLAB 中的 PIV 程序内加载每个视频序列的 tiff 图像栈。</li>
	<li>为每个图像栈手动生成掩膜，以遮蔽 Stentor 体外原始数据中的区域。</li>
	<li>将 PIVLab 设置为使用快速傅里叶变换模式，并将像素分块大小设为 64&#160;× 64&#160;像素，从而将每帧中的像素合并为更大的方形像素块。</li>
	<li>运行 PIVLab，计算每帧中像素与下一帧中邻近像素之间的互相关，从而得到以每个像素块为中心、时间分辨率为原始数据水平的时变流速矢量。</li>
	<li>对生成的矢量场输出结果进行时间平均，以生成流线图，用于比较切割前及伤口愈合过程中 Stentor 的数据，并计算流速直方图（用于研究流动强度）以及特定像素处流速随时间的变化（用于研究流动波动）。</li>
	<li>对于被切成两半且胞质明显泄漏至周围缓冲液中的 Stentor 图像序列，通过将平均流速乘以胞外胞质泡基部的横截面积，计算胞质回流至细胞主体的总通量。</li>
</ol>

<ol><li>Sonnemann, K. J., Bement, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+repair%3A+toward+understanding+and+integration+of+single-cell+and+multicellular+wound+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Wound repair: toward understanding and integration of single-cell and multicellular wound responses.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 27, 237-264 (2011).</li>
<li>Idone, V., Tam, C., Andrews, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-way+traffic+on+the+road+to+plasma+membrane+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Two-way traffic on the road to plasma membrane repair.</a> Trends Cell Biol. 18 (11), 552-559 (2008).</li>
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<li>Foissner, I., Wastenays, G. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+characean+internodal+cell+as+a+model+system+for+studying+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">The characean internodal cell as a model system for studying wound healing.</a> J. Microsc. 247 (1), 10-12 (2012).</li>
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<li>Vallotton, P., Ponti, A., Waterman-Storer, C. M., Salmon, E. D., Danuser, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery%2C+visualization%2C+and+analysis+of+actin+and+tubulin+polymer+flow+in+live+cells%3A+a+fluorescent+speckle+microscopy+study%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Recovery, visualization, and analysis of actin and tubulin polymer flow in live cells: a fluorescent speckle microscopy study.</a> Biophys. J. 85 (2), 1289-1306 (2003).</li>
<li>Miyake, A., Harumoto, T., Iio, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defence+function+of+pigment+granules+in+Stentor+coeruleus%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Protistol%22%5BJournal%5D)">Defence function of pigment granules in Stentor coeruleus.</a> Eur. J. Protistol. 37 (1), 7-88 (2001).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

该方法最重要的应用将是利用它来确定在喇叭虫（Stentor）伤口愈合过程中调控胞质流动的分子通路。目前已有大量化学抑制剂可用于靶向运动蛋白以及细胞骨架的组分，钙信号通路的抑制剂也可能成为候选药物。此外，研究去除或减少含有蓝色色素喇叭虫素（Stentorin）的色素颗粒（即胞吐颗粒）也将具有重要意义，因为这些颗粒在细胞受到应激时会被释放，可进一步探究Stentorin的胞吐释放如何影响邻近胞质的流动。色素颗粒可通过简单的漂白处理15进行耗竭，该处理可在切割前立即进行。由于细胞需要逐个进行切割和成像，目前似乎没有简单的方法可并行开展伤口愈合实验。因此，使用一台显微镜，操作和测量细胞的速度大约为每0.5小时1个细胞，在单日工作中即可获得足够数量的数据点，以判断某种化合物是否对该过程产生具有统计学意义的影响。尽管该方法在任何意义上都不属于高通量方法，但针对少数精心选定的靶向通路，筛选一组特定候选化合物仍是完全可行的。
当前方法的一个主要局限在于组装双层显微镜的方式相对粗糙。假设用于成像的倒置显微镜是一台通用仪器，其他研究人员还需将其用于其他用途，那么装置能否方便地拆卸和重新组装便成为一个重要的考虑因素。尽管目前使用实验室胶带的方法确实快速且易于拆卸，但在每次组装时都需要用户仔细进行对准。因此，一个重要的改进方案是设计一个可定制的、可拆卸的支架，带有用于倒置显微镜目镜头和解剖显微镜机身的插槽。利用现代3D打印技术，该支架应易于制造。
该方法的第二个局限性在于依赖微分干涉差（DIC）成像来观察细胞内细胞器作为流动的标记物。由于目前尚不清楚显微镜下观察到的这些细胞器的具体身份，因此无法获知它们的大小或其与其他细胞组分之间可能存在的相互作用。因此，引入外源性示踪剂（如荧光微珠）并利用其追踪流动可能更具优势。然而，这种方法需要在实验前额外增加一步微注射操作，从而进一步延长实验耗时。
最后一个关键局限是数据采集依赖于单一图像平面。本实验方法的主要意义在于，它不仅能够判断伤口是否愈合，还能获得流动模式的详细分析结果。在这方面，将成像技术扩展至三维成像显得尤为重要。当前方法仅对单一焦平面进行成像，因此在进行PIV分析时，所得结果仅为完整三维流场的一个切片。这一信息虽具价值，但并不完整。若能在每个时间点获取三维图像，则有望获得完整的三维流场数据。这对于精确观察细胞质在伤口周围区域的运动方式尤为关键。

再生与伤口愈合是重要的生物学过程，其机制仍是当前活跃的研究领域。事实上，愈合伤口和再生受损部分的能力是生命体区别于无生命物体的特征之一。通常认为，再生过程由干细胞分化为重建受损或断裂的生物体部分所需的多种细胞类型所介导，而伤口愈合则表现为新细胞侵入伤口以重建完整的上皮层。因此，这两个过程似乎均由单个细胞的群体活动所介导，因而属于典型的多细胞过程。因此，在某些情况下，单个细胞能够修复伤口并再生缺失组分，这一现象可能令人意外1。单个细胞内的伤口愈合可涉及多种途径，包括伤口周围肌动蛋白-肌球蛋白束的收缩作用以及通过胞吐囊泡的快速融合实现膜的修补1-3。尽管许多细胞类型均具备一定程度的伤口愈合能力4-6，但最显著的例子或许是巨型纤毛虫Stentor coeruelus7，如图1所示。Stentor单个细胞长达1 mm，表面覆盖成排的纤毛。Stentor细胞呈圆锥形，一端具有由数千根纤毛组成的口器结构，另一端则为狭窄的固着结构。Stentor曾是研究再生的经典模式生物，因为其细胞的任何部分被切除后均能实现再生7。例如，在一系列经典实验中，Thomas Hunt Morgan8证明，将一个Stentor细胞切成两半后，每一半均能在数小时内再生为比例正常的完整细胞8。然而，Stentor中负责再生的分子通路至今完全未知。
能力 喇叭虫 细胞作为再生模型系统依赖于这些细胞在被切割后能够自我修复的惊人能力。为什么细胞质在被切割后不会 喇叭虫 细胞被切割时会发生泄漏吗？伤口愈合并非由细胞皮层立即收缩引起，因为可以将两个 喇叭虫 细胞，切割它们，然后以不同的构型将两个被切割的细胞连接在一起7在进行此类移植实验时，两个细胞的细胞质必须保持暴露状态，因为当细胞被推到一起时，细胞质会发生融合。某种情况下，细胞质暴露于周围培养基的程度足以允许移植操作，但又不会从细胞中流出。那么，细胞质是否 喇叭虫 具有足够的弹性，以至于即使细胞膜上出现较大的孔洞，细胞质也无法流出？细胞是否会通过增加伤口周围细胞质的黏度来防止其外流？细胞质是一种高度复杂的活性物质9-11，以及 喇叭虫 伤口愈合反应为研究单细胞伤口愈合过程中的细胞质流动和力学特性提供了一个独特的机会。然而，使用手术方法在 喇叭虫 提出了一个技术难题。为了使用玻璃针这种传统手术方法切割一个1毫米长的细胞，必须在低倍率和长工作距离的条件下进行操作。在这样的成像条件下，无法追踪细胞质的流动情况，只能判断细胞质是否保留在细胞内。而我们真正希望探究的问题是：在切割和愈合过程中，细胞质的运动性和黏度可能发生怎样的变化。这需要高分辨率成像。本文介绍了一种对Tartar切割方案的改进方法 喇叭虫7 可在较低放大倍数的光学条件下进行切割，以便观察整个细胞 同时以高分辨率观察细胞质流动，使该系统可作为研究单细胞伤口愈合机制的平台。

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;Stentor coeruleus&lt;/em&gt; 活体培养</td><td>卡罗来纳生物公司</td><td>131598</td><td></td></tr><tr><td>甲基纤维素，1,500 cP</td><td>Sigma</td><td>M0387</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_step">设备：&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td>材料名称</td><td>公司</td><td>目录编号</td><td></td></tr><tr><td>5 英寸长软质玻璃搅拌棒</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-380A</td><td></td></tr><tr><td>培养皿 4.5 英寸，250 毫升&amp;nbsp;玻璃</td><td>卡罗来纳生物公司</td><td>741004</td><td></td></tr><tr><td>IX81 倒置显微镜</td><td>奥林巴斯</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axiovert 200M 倒置显微镜</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stemi 2000 体视显微镜</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Evolve 512 x 512 EMCCD 相机</td><td>Photometrics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plan Apo 20倍物镜</td><td>Olympus</td><td>UPLSAPO</td><td></td></tr></tbody></table>

可视化单细胞伤口愈合过程中喇叭虫（stentor coeruleus）的胞质流动

Visualizing Cytoplasmic Flow During Single-cell Wound Healing in Stentor coeruleus

尽管伤口愈合通常是在组织整体水平上进行研究的，但在许多情况下，单个细胞自身也能够实现伤口修复，在细胞内容物泄漏之前重新修复破裂的细胞膜。Stentor coeruleus 是一种巨型单细胞生物，其细胞大小可超过一毫米，长期以来被用作研究单细胞伤口愈合的经典模式生物。Stentor 细胞即使被切成两半也不会丧失活力，甚至可以被切割后重新嫁接。然而，这种对切割的极高耐受性引发了一个问题：为何细胞质不会从切口处直接流出？本文介绍了一种在切割 Stentor 细胞的同时，以高空间和时间分辨率成像切口附近细胞质运动的方法。本方法的关键在于采用一种“双层”（&#34;double decker&#34;）显微镜配置，即在解剖显微镜下进行手术操作，该显微镜聚焦于一个样品腔，而同一腔体同时通过倒置显微镜配合高数值孔径（NA）镜头从下方进行高分辨率观察。该装置可在精确控制手术过程的同时，实现对细胞质动态的高分辨率追踪。

通过采用上述描述的方案，研究发现Stentor的细胞质在切割前后均表现出显著的动态性。视频1展示了未切割细胞中存在的强烈细胞质流动。尽管我们最初预期Stentor能够耐受切割可能涉及细胞质的硬化或凝胶化，但实际上，当以足够剧烈的方式切割Stentor细胞并使细胞质被拉出细胞时，细胞质仍保持高度动态，并能够以高度定向的方式回流至细胞内（视频2）。
除了揭示伤口愈合过程中此前未被察觉的细胞质运动程度外，该检测方法的高分辨率成像还可用于通过粒子图像测速技术定量分析流动速率。实现此类测量的能力将有助于严格检验化学抑制剂的作用效果。
<img alt="浮游植物显微镜图像，显示绿色细胞结构，海洋生物学研究。" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50848/50848fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50848/50848fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 活体Stentor细胞的形态学特征。 暗视野显微图像显示一个活体Stentor细胞，该细胞已按步骤1.3所述喂食Chlamydomonas，绿色物质可见于食物泡内。细胞摄食所用的口器在图像顶部可见，表现为一圈纤毛。
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50848/50848fig1highres.jpg" target="_blank">点击此处查看高分辨率图像</a>。
<img alt="显微镜下的微移液管尖端；精密微加工；比例尺 500μm；光学研究。" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50848/50848fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50848/50848fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 手术用玻璃针的制备。 (A) 从实心玻璃棒末端拉制针头。(B) 针尖的高倍放大图像，显示手术所需的长度和锐利度。
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50848/50848fig2highres.jpg" target="_blank">点击此处查看高清图像</a>。
<img alt="用于光谱实验中光学激发的显微镜载玻片支架。" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50848/50848fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50848/50848fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 3"> 
图 3. 用于显微手术的定制盖玻片支架。 为在允许开放手术操作的同时实现最佳成像条件，细胞被置于盖玻片上，而非较厚的载玻片上。为使盖玻片能够适配显微镜载物台，可使用 3D 打印机加工制作一个塑料支架。该支架外形尺寸与标准显微镜载玻片相同，其中央凹槽与盖玻片尺寸相匹配。支架一角设有孔洞，便于将盖玻片从支架中取出。
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50848/50848fig3highres.jpg" target="_blank">点击此处查看高清图像</a>。
<img alt="共聚焦显微镜装置；荧光成像；光学激发；显微镜设备。" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50848/50848fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50848/50848fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 4"> 
图 4. 双层显微镜配置。 解剖显微镜的镜筒安装在倒置显微镜目镜筒的上方。实验结束后，使用实验室胶带可快速拆卸和组装该装置。
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50848/50848fig4highres.jpg" target="_blank">点击此处查看大图</a>。
视频 1. 活体Stentor细胞中观察到的胞质流动示例。 使用10倍物镜配合暗场光学系统成像，成像速率为每秒2帧。
视频 2。利用玻璃针切割并破坏 Stentor 细胞的成像过程。切割后，大量细胞质被拉出主细胞体，但很快迅速回流至细胞内。

大型纤毛虫Stentor coeruleus是研究单细胞再生与伤口愈合的经典体系。&#160;通过同时在低倍和高倍镜下对Stentor细胞进行成像，可测量损伤前、损伤中及损伤后的胞质流动。

可视化单细胞伤口愈合过程中喇叭虫（Stentor coeruleus）的胞质流动

尽管伤口愈合通常是在组织整体水平上进行研究，但在许多情况下，单个细胞能够实现自身的伤口修复，……

本实验的总体目标是测量单个细胞在伤口愈合过程中细胞质的流动情况。首先，通过获取活体的stent细胞或SEIUs细胞，作为细胞损伤的模型系统；第二步是制备用于切割细胞的玻璃工具。接下来，在定制的显微镜装置上切开萨里乌斯支架细胞，该装置可同时实现低倍手术操作和高分辨率成像。最后一步是利用粒子图像测速软件对细胞质流动进行计算分析。最终，通过细胞质的高分辨率成像来展示细胞在伤口愈合过程中的主动响应。该方法可用于解答有关细胞伤口愈合的关键问题，例如细胞质在切口区域周围是否会形成凝胶状结构，以防止内容物泄漏到周围培养基中。本方法的可视化演示至关重要，因为细胞操作工具的制备和切割步骤较难掌握，需要熟练的手动操作技巧。首先，从天然泉眼（如 Tartar 所述）或商业供应商处获取 Stent 或 Sirius 细胞，加入 300 毫升经改良的 Stent 培养基（培养基配方根据 Tartar 和 Deter 在配套文字方案中所述方法进行调整）。在20摄氏度避光条件下培养以维持藻种。接下来，在三羟甲基氨基甲烷乙酸盐磷酸盐培养基中培养莱茵衣藻。在饲喂前，采用标准培养方法，通过轻柔离心沉淀莱茵衣藻细胞，弃去上清液，并将其重悬于改良的斯滕特培养基或培养液中。根据需要，每周两到三次向 300 毫升支架或 Sarius 培养物中添加约 3000 万 CHM 细胞进行喂养。收集支架或细胞用于手术。开始时，通过移液管尖端通入空气轻轻搅动培养物，直至细胞开始脱离并自由游动。然后使用带有宽口吸头的1毫升移液器捕获游动的细胞，以避免剪切损伤细胞。收集后，让细胞自然沉降。随后缓慢吸去上层培养基，并加入新鲜的改良Stent培养基或培养液。通过将两根玻璃搅拌棒置于火焰上加热，直至末端开始熔化，来制备用于切割支架细胞的玻璃针。然后将两根棒的末端接触在一起，使熔融的玻璃融合。融合后，立即将其移离火焰，并静置冷却一到两秒钟。然后缓慢地将它们拉开，以形成整齐的断裂。理想情况下，这将产生一根长约一到两厘米、末端尖细的针。如果得到的针不理想，可将针尖折断至玻璃腰部，并重复使用玻璃棒。接下来，使用涂有凡士林的方形橡胶印章，在玻璃盖玻片上压出一个方形凡士林壁腔室。然后向该凡士林围成的方格中加入 100 µL 含 2% 甲基纤维素的改良支架或培养基。将制备好的盖玻片放入塑料适配器中，随后将洗涤后的支架细胞加入盖玻片上。最后，将细胞在甲基纤维素中排列，使其均匀分布，并推至靠近盖玻片表面的位置，以便成像时处于焦平面内。首先，将载玻片放置在倒置显微镜的载物台上。然后，将解剖显微镜的镜体从支架上取下，确定其大致放置位置，以便从上方以低倍镜观察载玻片。接下来，通过添加一个纸箱来构建双层显微镜系统，使倒置显微镜的目镜与解剖显微镜之间保持所需的间距。使用实验室胶带将纸箱固定到位，以便实验结束后可轻松移除。确保样品在连接完成后位于解剖显微镜的视野范围内且处于焦平面，无需移动解剖显微镜即可观察。将解剖显微镜紧贴纸箱放置后，使用实验室胶带将其固定在纸箱上。随后，通过安装20倍空气物镜，使用微分干涉差（DIC）光学系统设置倒置显微镜。此外，务必使用长工作距离的微分干涉差（DIC）聚光镜，以提供足够的空间从上方进行显微手术。然后在两侧均已准备就绪并聚焦的情况下，利用倒置显微镜将细胞调至焦点。使用512×512的CCD相机，以每秒两帧的速率开始采集图像。然后用玻璃针切割细胞。捕捉初始的胞质流动模式，并观察损伤及伤口愈合过程的各个阶段。当细胞恢复正常的形态或重新开始活跃运动时，终止图像采集。首先，下载PIV Lab，这是一个MATLAB软件包，用于通过粒子图像测速技术测量细胞质流动。接着，按照MATLAB手册中的说明，将每个视频序列的TIFF图像序列加载到粒子图像测速程序中。然后，为每个图像序列手动生成掩膜，以屏蔽支架本体以外区域的原始数据。然后将PIV实验室软件设置为使用快速傅里叶变换模式，并将像素分块大小设为64×64像素，这会将每帧中的像素合并为更大的方形像素块。接下来运行PIV实验室软件，计算每帧中各像素与邻近像素之间的互相关。在下一帧中，这将生成以每个弯曲像素为中心的时间依赖性流速矢量，其时间分辨率与原始数据相同。然后计算所得矢量场输出的时间平均值，以比较放置支架后切割前及伤口愈合过程中的数据。同时，计算流速的直方图，以研究给定像素处随时间变化的流动强度和速度变化，从而分析流动波动情况。在对支架或细胞被切割成两半的成像序列进行分析时，通过将平均流速乘以外部细胞质气泡基部的横截面积，计算细胞质回流至细胞主体的总通量。此处展示的是使用玻璃针切割并破坏支架或细胞时的活体成像。切割后，大量细胞质被拉出细胞主体，但迅速回流至细胞内。在此操作后，可加入化学抑制剂，以回答进一步的问题，例如在支架或伤口愈合过程中，哪些细胞骨架组分可能参与了细胞质的运动。观看本视频后，您应该能够很好地掌握如何准备用于切割细胞内支架的工具，以及如何对单个巨大细胞内切割和伤口愈合过程中细胞质流动进行成像。

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了解单细胞伤口愈合过程中细胞质流动的测量方法。本研究使用Stentor coeruleus作为模型生物，结合定制显微镜系统和粒子图像测速软件进行计算分析，揭示细胞在损伤后的主动响应机制。

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