可视化单细胞伤口愈合过程中喇叭虫（Stentor coeruleus）的胞质流动

本实验的总体目标是测量单个细胞在伤口愈合过程中细胞质的流动情况。首先，通过获取活体的stent细胞或SEIUs细胞，作为细胞损伤的模型系统；第二步是制备用于切割细胞的玻璃工具。

接下来，在定制的显微镜装置上切开萨里乌斯支架细胞，该装置可同时实现低倍手术操作和高分辨率成像。最后一步是利用粒子图像测速软件对细胞质流动进行计算分析。最终，通过细胞质的高分辨率成像来展示细胞在伤口愈合过程中的主动响应。

该方法可用于解答有关细胞伤口愈合的关键问题，例如细胞质在切口区域周围是否会形成凝胶状结构，以防止内容物泄漏到周围培养基中。本方法的可视化演示至关重要，因为细胞操作工具的制备和切割步骤较难掌握，需要熟练的手动操作技巧。首先，从天然泉眼（如 Tartar 所述）或商业供应商处获取 Stent 或 Sirius 细胞，加入 300 毫升经改良的 Stent 培养基（培养基配方根据 Tartar 和 Deter 在配套文字方案中所述方法进行调整）。

在20摄氏度避光条件下培养以维持藻种。接下来，在三羟甲基氨基甲烷乙酸盐磷酸盐培养基中培养莱茵衣藻。在饲喂前，采用标准培养方法，通过轻柔离心沉淀莱茵衣藻细胞，弃去上清液，并将其重悬于改良的斯滕特培养基或培养液中。

根据需要，每周两到三次向 300 毫升支架或 Sarius 培养物中添加约 3000 万 CHM 细胞进行喂养。收集支架或细胞用于手术。开始时，通过移液管尖端通入空气轻轻搅动培养物，直至细胞开始脱离并自由游动。

然后使用带有宽口吸头的1毫升移液器捕获游动的细胞，以避免剪切损伤细胞。收集后，让细胞自然沉降。随后缓慢吸去上层培养基，并加入新鲜的改良Stent培养基或培养液。

通过将两根玻璃搅拌棒置于火焰上加热，直至末端开始熔化，来制备用于切割支架细胞的玻璃针。然后将两根棒的末端接触在一起，使熔融的玻璃融合。融合后，立即将其移离火焰，并静置冷却一到两秒钟。

然后缓慢地将它们拉开，以形成整齐的断裂。理想情况下，这将产生一根长约一到两厘米、末端尖细的针。如果得到的针不理想，可将针尖折断至玻璃腰部，并重复使用玻璃棒。

接下来，使用涂有凡士林的方形橡胶印章，在玻璃盖玻片上压出一个方形凡士林壁腔室。然后向该凡士林围成的方格中加入 100 µL 含 2% 甲基纤维素的改良支架或培养基。将制备好的盖玻片放入塑料适配器中，随后将洗涤后的支架细胞加入盖玻片上。

最后，将细胞在甲基纤维素中排列，使其均匀分布，并推至靠近盖玻片表面的位置，以便成像时处于焦平面内。首先，将载玻片放置在倒置显微镜的载物台上。然后，将解剖显微镜的镜体从支架上取下，确定其大致放置位置，以便从上方以低倍镜观察载玻片。

接下来，通过添加一个纸箱来构建双层显微镜系统，使倒置显微镜的目镜与解剖显微镜之间保持所需的间距。使用实验室胶带将纸箱固定到位，以便实验结束后可轻松移除。确保样品在连接完成后位于解剖显微镜的视野范围内且处于焦平面，无需移动解剖显微镜即可观察。将解剖显微镜紧贴纸箱放置后，使用实验室胶带将其固定在纸箱上。随后，通过安装20倍空气物镜，使用微分干涉差（DIC）光学系统设置倒置显微镜。

此外，务必使用长工作距离的微分干涉差（DIC）聚光镜，以提供足够的空间从上方进行显微手术。然后在两侧均已准备就绪并聚焦的情况下，利用倒置显微镜将细胞调至焦点。使用512×512的CCD相机，以每秒两帧的速率开始采集图像。

然后用玻璃针切割细胞。捕捉初始的胞质流动模式，并观察损伤及伤口愈合过程的各个阶段。当细胞恢复正常的形态或重新开始活跃运动时，终止图像采集。

首先，下载PIV Lab，这是一个MATLAB软件包，用于通过粒子图像测速技术测量细胞质流动。接着，按照MATLAB手册中的说明，将每个视频序列的TIFF图像序列加载到粒子图像测速程序中。然后，为每个图像序列手动生成掩膜，以屏蔽支架本体以外区域的原始数据。

然后将PIV实验室软件设置为使用快速傅里叶变换模式，并将像素分块大小设为64×64像素，这会将每帧中的像素合并为更大的方形像素块。接下来运行PIV实验室软件，计算每帧中各像素与邻近像素之间的互相关。在下一帧中，这将生成以每个弯曲像素为中心的时间依赖性流速矢量，其时间分辨率与原始数据相同。

然后计算所得矢量场输出的时间平均值，以比较放置支架后切割前及伤口愈合过程中的数据。同时，计算流速的直方图，以研究给定像素处随时间变化的流动强度和速度变化，从而分析流动波动情况。在对支架或细胞被切割成两半的成像序列进行分析时，通过将平均流速乘以外部细胞质气泡基部的横截面积，计算细胞质回流至细胞主体的总通量。

此处展示的是使用玻璃针切割并破坏支架或细胞时的活体成像。切割后，大量细胞质被拉出细胞主体，但迅速回流至细胞内。在此操作后，可加入化学抑制剂，以回答进一步的问题，例如在支架或伤口愈合过程中，哪些细胞骨架组分可能参与了细胞质的运动。

观看本视频后，您应该能够很好地掌握如何准备用于切割细胞内支架的工具，以及如何对单个巨大细胞内切割和伤口愈合过程中细胞质流动进行成像。