建立抗菌剂对浮游细胞（MBC-P）和生物膜细胞（MBC-B）的最小杀菌浓度

该实验直接比较能够形成生物膜的细菌菌株在浮游状态与生物膜状态下的耐药性。首先，建立生物膜，更换培养基后加入所选抗菌剂的系列稀释液。随后，将细胞转移至新鲜培养基中使其恢复生长。

现在通过在LB琼脂平板上接种来检测细胞的存活率。最终测定浮游状态和生物膜状态下细菌的最小杀菌浓度，以显示生物膜生长所导致的耐药性增强。通常，初次操作此方法的人员可能会遇到困难，例如污染相邻孔位，或未能使多头接种装置的接种针充分冷却，导致细菌被烫死。

在37摄氏度的丰富培养基中培养细菌的野生型和突变株16小时，将过夜饱和培养物稀释至新鲜的M63基本培养基中，培养基需添加镁、硫酸盐和精氨酸。然后每孔加入100 µL。

每种菌株分配24个孔，在37摄氏度下孵育24小时。接着，为7个孔配制抗生素稀释系列的10倍浓缩母液，并置于冰上保存。使用多通道移液器，移除含有浮游细胞的废弃上清液。

然后向所有孔中加入 90 微升 M 63，并向无抗生素对照孔中加入 10 微升相应的抗生素储备溶液。针对每个重复样本和菌株，加入 10 微升水。将微量滴定板在 37 摄氏度下孵育 24 小时。

使用多通道移液器，移除含有浮游细胞的废弃上清液。向所有孔中加入115 µL M63培养基，并在37 °C条件下继续培养24小时。

将一个一磅螺旋板标记为半个96孔微孔板，以对多齿装置进行灭菌：将其浸入100%乙醇中，然后将齿部通过本生灯的明火，稍等片刻使齿部略微冷却。

使用接种环的尖端，将微量滴定板每个孔中的悬浮培养物转移至LB琼脂平板表面。将LB琼脂平板置于37摄氏度培养16小时。

然后通过肉眼确定细菌生长的临界点，作为抗生素的最低杀菌浓度；将野生型和突变型细菌菌株在丰富培养基中于37摄氏度培养16小时，将过夜饱和培养物按1:100稀释至新鲜培养基中，用于抗生素抗性检测，并将稀释液加入96孔微孔板的各个孔中。每孔加入90 µL细菌稀释液。现在使浮游细胞暴露于抗生素的浓度梯度中。

从一系列抗生素（如妥布霉素）的10倍浓缩储备液开始，根据实验设计向各孔中加入10微升抗生素溶液。然后，针对每个重复和菌株，在不含抗生素的对照孔中加入10微升水。

将微孔板在37摄氏度下孵育24小时，以检测活细胞。首先，为96孔微孔板的每一半各标记一个LB琼脂平板。用100%乙醇火焰灭菌多头接种装置。

重复一次。然后使用多头装置，将每个微量滴定板孔中的约三微升浮游培养物转移至LB琼脂平板表面。将平板在37摄氏度下孵育16小时。

然后通过肉眼观察细菌生长的临界点，确定抗生素的最低杀菌浓度。在本实验中，采用两种不同的最低杀菌浓度测定方法，比较PA14野生型菌株与缺乏抗生素抗性基因ndvB的突变株的敏感性。

在此实验中，测定了抗生素妥布霉素对生物膜的最小杀菌浓度。PA14 的生物膜最小杀菌浓度（MBCB）为 100 微克/毫升，而突变株为 12.5 微克/毫升。相比之下，妥布霉素对浮游细胞的最小杀菌浓度在 PA14 野生型和突变株中均为 8 微克/毫升。

一旦掌握，NBCB 操作可在五天内完成，总计约一小时。