远程磁控微米级探针 原位 细菌生物膜物理特性的三维映射

以下实验的总体目标是在 C 中对细菌生物膜的局部物理特性进行两次微米尺度的测量。为此，将磁性颗粒引入生长中的生物膜，作为可在不干扰生物膜结构特性的前提下进行远程操控的探针。随后使用专用的磁镊对每个颗粒施加特定的力。

在生物膜内部，通过磁力牵引引起的颗粒位移被视频显微技术监测，以推导局部的黏弹性参数，并提供生物膜机械性能的三维空间分布。所得结果揭示了大肠杆菌生物膜机械性能的异质性，并为哪些生物膜组分支撑其物理特性提供了线索。因此，该技术相较于现有方法（如显微镜、流变学或整体生物群落分析）的主要优势在于，能够在不破坏材料原始结构的前提下，原位报告其机械性能的空间分布。

为准备本方案所需的磁性颗粒，首先涡旋震荡盛有2.8微米颗粒的原液小瓶以重悬颗粒。然后取10微升转移至一微量离心管中。接着，加入190微升最低培养基以洗涤颗粒，轻轻摇动试管混匀，将试管置于磁性样品架上，待颗粒形成沉淀后，吸除上清液。

重复此洗涤步骤两次，然后将磁珠重悬于190微升的最低培养基中。接下来，向50微升洗涤后的磁珠溶液中加入950微升含0.4%葡萄糖的M63B1培养基，以调节颗粒浓度至每毫升约500万个磁珠。为准备通道，使用金刚石玻璃切割器将两根10厘米长的正方形硼硅酸盐玻璃毛细管切割，得到两段8厘米长的毛细管。

使用玻璃切割器将载玻片切成两半。然后使用快速固化的氰基丙烯酸酯胶水或强力胶，按照示意图所示，将两段毛细管分别粘附在两片载玻片上，两段之间相距2厘米，两端各留1厘米的悬空部分。将整个装置及所需的导管一起进行高压灭菌。

为进一步连接通道，请在超净工作台内准备好以下无菌材料：安装好的通道管路及连接器、两个儿科用气泡过滤器或气泡捕获装置、两个夹子、装有 M 63 B、1.4%葡萄糖的 30 毫升注射器，以及废液瓶。

以相同方式连接两根毛细管。使用其中一根管子，将废液瓶连接至一根毛细管的一端。

然后使用诱饵锁连接器作为连接点，将毛细管的另一端连接到自制的气泡捕集器或捕集器一，再将捕集器一连接至捕集器二。接着将30毫升M 63 B1注射器连接到捕集器二。随后用含0.4%葡萄糖的无菌M 63 B1溶液填充整个装置。

将注射器安装到注射泵上，并以比实验流速约高5毫升/小时的速率启动注射泵。必要时仔细追踪并清除管路中的所有气泡。在执行此操作时，断开并重新连接管路。

在将细胞颗粒混合物引入管路之前和过程中，务必小心去除所有气泡，可将废液管置于毛细管上方，这有助于生物膜的持续生长。让培养基在系统中流动10至15分钟。在此期间，取一个微量离心管，加入1毫升光密度为0.5的细菌悬液与1毫升先前制备的洗涤后微珠溶液，混匀。

关闭流体，重新连接管路，然后关闭夹具。接下来，用一毫升注射器吸取细菌珠混合物，并将其注入毛细管中。经过自制的气泡捕获装置后，将装置转移至显微镜下进行观察。

将毛细管安装在显微镜载物台上，并将废液容器置于稍高的位置。将注射泵放置在显微镜旁的实验台面上。让装置静置15至20分钟，使细菌沉降并附着在毛细管表面。

细菌附着到毛细管后，打开夹具，调节注射泵的流速并开始流动。在24至48小时的过程中，毛细管表面将形成生物膜，聚焦于毛细管底面并开始对样品图像进行延时记录。通常每分钟采集两幅图像的频率足以充分反映生物膜的生长情况。

该视频展示了接种细胞颗粒混合物后生物膜的初始阶段。在毛细管图像采集过程中，采集频率为每秒1帧，视频以每秒10帧的速度播放。经过4小时生长后，颗粒逐渐从表面脱离并分布到生物膜内部。

蓝色箭头标记了脱离事件。此处，采集频率为每分钟两幅图像，视频以每秒15帧的速度播放。经过20小时生长后，可在焦平面上监测到约十几个均匀分布的颗粒。

该视频拍摄于毛细管底部上方20微米的中间平面。每分钟采集两幅图像。视频以每秒15帧的速度播放。

当接种了磁性颗粒的生物膜开始手动生长后，将磁力镊子旋紧到显微镜载物台上。为确保在观察区域产生适当的磁场梯度，请将镊子按图示位置放置，其中红色标示的测量区域位于磁力镊子左右两极沿Y轴方向边缘外侧300微米处。毛细管底部位于磁力镊子底部下方200微米处。

为完成此步骤，使用显微镜载物台的 XY 方向移动控制，将左侧磁极边缘与毛细管的左侧边缘置于同一视野中。通过镊子左侧微操纵器的 x 调节旋钮，调整磁极位置，使其距离毛细管边缘 300 µm。在右侧同样执行此操作。

然后沿 Z 轴方向调整镊子相对于毛细管底部的位置。首先，将电极底部与毛细管底部对齐，再将电极向上移动 200 微米。

使用显微操作仪的 Z 轴调节功能，将函数发生器的参数设置为 24 秒零信号和 16 秒 4 安培的直流电，并带有触发信号。在 20 秒后发送至明场光源快门。

为实现信号同步，通过功率放大器将镊子连接至函数发生器。注意正确串联连接电极，以获取空间分布的蠕变曲线。设定空间原点，将 Z 轴原点定于毛细管内底部。

记录显微镜 Z 轴控制位置。然后找到 x 轴和 Y 轴的交点，其中 x 轴由毛细管边缘定义，Y 轴由极片边缘定义。该交点即为分析原点。

记录下坐标。后续所有坐标均以该原点为参考。生物膜生长完成后，使用微调焦旋钮调节毛细管的垂直位置，使第一成像平面位于毛细管底部上方4至7微米处。

该切片对应于生物膜切片，其中空间参照系的原点位于左上角。然后打开电流发生器，并手动触发图像采集序列。为启动第42个事件序列，此处采集的图像流对应于特定的平面和XY视野。

序列捕获完成后，移动毛细管以采集新视野的视频。持续重复此过程，以获取分析数据所需的所有视频。在 ImageJ 或同等功能的颗粒追踪软件中打开所有采集的颗粒堆栈图像。

通过追踪颗粒位移将图像转换为文本文件。接下来，使用数据处理软件绘制位移曲线，并将位移曲线转换为柔量曲线，其中根据此处所示的柔量公式计算材料的总柔量 JFT 随时间的变化。该公式描述了施加的应力与材料应变之间的关系，适用于嵌入在黏弹性且不可压缩介质中的红色颗粒（历史粒子），如先前由他及其同事所建立的模型。通过对蠕变柔量曲线与黏弹性材料的广义 Burgers 模型进行拟合，获得黏弹性参数 J₀、J₁、τ₀ 和 τ₁′，从而提供生物膜黏弹性特性的空间分布。在生物膜微体积（约 200 × 200 × 40 立方微米）的不同深度处采集了蠕变曲线。典型结果如图所示。

J 零值，即弹性柔量，以沿生物膜深度方向的 Z 轴和沿侧向维度的 Y 轴为函数给出。每个点对应一个微珠，其蠕变曲线分析提供了相应的 J 零值。数据表明，局部柔量在生物膜深度方向上的变化跨越了近三个数量级。

此外，在所有生物膜高度上均出现了显著的横向异质性。这些数据还提供了顺应性值的分布情况，其分布呈现广泛且不对称的形态。将这些结果与先前在其他生物大分子上获得的结果进行比较表明，生物膜的力学特性由高度交联的聚合物凝胶所支撑。

在C组中，在不同环境条件下（例如此处所示的较低流速）也进行了生物膜的局部特性测量。在0.1毫升/小时流速下培养的生物膜，其力学性能仍表现出高度异质性；但在1毫升/小时流速下培养的生物膜中所观察到的生物膜刚度随Z深度的明显依赖性已消失。

这些结果表明外部条件对生物膜结构具有显著影响。观看视频后，您应充分了解如何在完全可控的生长条件下测定生物膜的黏弹性特性。