使用十字型荧光探针定性鉴定羧酸、硼酸和胺

本实验的总体目标是利用基于所谓十字形几何结构的小分子荧光探针，对多种化合物类别中的分析物进行分析并实现定性区分。首先，将这些十字形传感器溶解于多种不同溶剂中，配制成溶液，从而利用其发射光谱对溶剂高度依赖的特性。第二步是将这些溶液暴露于目标分析物中，包括羧酸、无机酸或有机胺类物质，这些分析物可以以固体形式或溶液形式加入。

接下来，将混合的传感器-分析物溶液在365纳米的紫外光下照射，使其在可见光区域发光。使用标准的数码摄影装置对这些发射光的颜色进行拍摄。最后一步是生成发射光颜色图谱，用于检测不同分析物溶液发光特性的定性差异。

最终，这种荧光方法将有助于快速鉴定制药和食品工业中的常见分析物。与色谱等现有方法相比，该技术的主要优势在于能够直接分析高极性分析物，而无需进行衍生化处理。该方法可用于解答常规质量控制领域中的关键问题，例如快速判断特定组分是否真实可靠，或是否已被篡改。

该方法的可视化演示至关重要，因为该方法本身采用光学检测，且其最终应用将涉及非专业操作人员。本次演示将由来自海德堡Buns实验室的Abel以及来自休斯顿大学实验室的Rio Color Lire进行。两位研究生首先配制浓度为50毫克/10毫升的氯仿一、二、三号新鲜储备溶液，并放置备用。

称取500毫克羧酸分析物，分别加入六个16毫升的DR小瓶中，然后向每个小瓶中加入16毫升二氯甲烷、乙酸乙酯、乙腈、N,N-二甲基甲酰胺、异丙醇或甲醇。接着，向每个小瓶中加入20微升十字形探针储备溶液，若混合物不均一，则振荡小瓶并静置使其相应溶液澄清。将未加盖的小瓶置于紫外灯下的玻璃板上，确保相机镜头与样品小瓶之间的距离为60厘米。

打开紫外灯并关闭室内光源。对每种溶液分别以0.25至15秒的曝光时间拍摄照片，以获得反映其返色现象颜色的图像。随后，配制1.0 × 10⁻⁴ M的cruciform four二氯甲烷溶液，并置于一旁备用。

接下来，通过将每种离子酸分析物各50毫克分别溶解于3毫升乙腈、1,2,4-三氯苯、二氯甲烷、环己烷和氯苯中，制备五种独立的分析物溶液。将每种分析物溶液各1.8毫升转移至五个独立的10×10毫米石英比色皿中。

然后将20 µL先前配制的十字形结构溶液加入五个比色皿中的每一个，并混合两种溶液以使其均匀。如果观察到任何沉淀，让相应的溶液静置沉降。将所有五个Q比色皿置于玻璃板上，并从顶部进行照射。

使用手持式365纳米紫外灯，确保环境黑暗，立即用数码相机拍摄溶液的发射颜色，相机镜头与比色皿之间的距离为45厘米，曝光时间为0.5秒。接下来，分别准备80毫升以上的浓度为1.0 × 10⁻⁶ 摩尔的十字形分子四在乙腈、1,2,4-三氯苯、环己烷、二氯甲烷和氯仿中的溶液。将152.6毫克的2,6-二氯苯甲酸分别溶解于每种十字形分子溶液40毫升中。另将97.6毫克苯甲酸分别溶解于每种十字形分子溶液40毫升中。

然后将40毫克目标胺类分析物分别溶解于2毫升的二氯草酸十字形溶液中。针对每种胺类分析物，分别制备五份添加了2,6-二氯草酸的溶液和五份添加苯基草酸的溶液。将制备好的10种溶液各取等分试样，分别转移至10个独立的石英比色皿中。

将两组五个小瓶置于玻璃板上，使用手持式紫外灯在365纳米波长下照射，并立即采用前文所述设置，通过图像处理程序进行拍照。从每个小瓶发射颜色的数字照片中裁剪出具有代表性的方形区域。然后将这些裁剪出的图像按类似本图所示的方式排列成图版。

若需对发射光颜色的差异进行定量分析，可从图中提取红、绿、蓝值，随后进行统计处理，以获得一种分析物相对于另一种分析物的发射光颜色的相对标准偏差。使用以下公式。最后，利用该公式鉴定未知的羧酸分析物，并通过在六种不同溶剂中使用十字型荧光探针一至三，确定未知分析物与校准数据集中所有物质之间的偏差。实验发现，荧光响应依赖于羧酸的浓度及其结构特征。

以下是所有植物与四种溶剂中羧酸组合的数字记录发射颜色。该阵列对每种分析物呈现出18种特征性发射颜色，可通过发射颜色的红绿蓝（RGB）值来唯一表征分析物。所有分析物均可相对于羧酸A1至A10进行区分，并如图中所示通过完全类似的方法在自相关图中加以识别。

通过十字型分子四号，可以轻松区分B1至B9九种羧酸，如本图所示的发射颜色图谱及相关性图表所示。利用十字型分子四号与过量羧酸添加剂（2,6-二氯苯基羧酸和苯基羧酸）原位形成的复合物二号，可实现对胺类物质的分析。这些复合物的发光颜色不同于纯十字型分子，能够以两种方式响应胺类分析物。

一种碱性更强的物质能够取代嘌呤与离子酸加合物中的十字架分子四号的结合，从而恢复纯的未结合状态十字架分子四号的发光颜色。另一方面，碱性较弱的物种似乎在不破坏十字架离子酸复合物的前提下与其结合，这一过程导致复合物荧光发射的调制。因此，间接传感方法具有“平顶效应”特征，即当分析物的碱性超过某一阈值后，彼此之间便无法再被区分。一旦掌握，若操作得当，该技术可在数小时内完成。

观看本视频后，您应能够充分理解如何利用一套简单的装置，通过十字形荧光法在多种不同溶剂中分析羧酸和巴罗尼酸。请注意，使用有机溶剂和紫外灯时存在潜在危险，因此在进行该实验操作时，必须采取适当的预防措施，例如在通风良好的环境中操作，并始终佩戴护目镜。