Name: 膜下丘脑腹内侧神经元的电位染料成像从成年小鼠为研究葡萄糖传感 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-27T22:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 10 s
Description: 学习膜电位敏感染料成像技术，用于评估成年小鼠腹内侧下丘脑神经元对葡萄糖变化的反应活性。该方法有助于研究代谢调控与神经科学中的葡萄糖感应机制。

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NIH R01 DK55619，NIH R21 CA139063

1. 动物
<ol>
	<li>所有实验程序均经新泽西州医科大学机构动物照护与使用委员会批准。</li>
	<li>将雄性C57BL/6小鼠按群体饲养，置于12小时光照/12小时黑暗循环环境中，并允许 随意摄取 可自由获取水和食物。在4至5月龄时处死动物。&#160;对小鼠实施安乐死时，采用外科麻醉深度并结合第二种安乐死方法（即&#160;通过膈肌进行胸腔穿透性切口）。这与美国兽医协会（AVMA）的安乐死指南一致。</li>
</ol>
2. 灌流液、盖玻片、玻璃移液管和培养基的制备
<ol>
	<li>配制1升灌流液，包含2.5 mM KCl、7 mM MgCl₂、1.25 mM NaH₂PO₄、26 mM NaHCO₃、10 mM葡萄糖、92 mM蔗糖、30 mM HEPES和119 mM NaCl2，1.25 mM NaH2PO4，28 mM NaHCO₃3，0.5 mM CaCl2，7 mM 葡萄糖，1 mM 抗坏血酸，3 mM 丙酮酸，溶于蒸馏水 dH2O. 使用约 80 g/L 蔗糖将渗透压调节至约 300 mOsm。用 95% O₂2 /5% CO₂2 并调节pH至7.4。每次实验大约需要200 ml&#160;灌流液。分装后可在 -20 °C 保存长达 2 个月。</li>
	<li>制备 250 ml&#160;不含葡萄糖的Neurobasal培养基，含2.5 mM葡萄糖和100 U/ml&#160;青霉素-链霉素。使用蔗糖将Neurobasal储存液的渗透压调节至280 mOsm。配制500 ml&#160;含无葡萄糖的Hibernate-A培养基、2.5 mM葡萄糖和100 U/ml&#160;青霉素-链霉素</li>
	<li>充分混匀两种储备液，使用 Stericup 真空滤器进行过滤除菌。注意避免通过玻璃器皿或搅拌子引入葡萄糖或其他污染物。用铝箔包裹瓶体，避光保存于 4 °C，可存放长达 2 个月。</li>
	<li>将4根已灭菌的玻璃移液管（9英寸）的管尖进行火焰抛光，使其管口不再锋利，开口直径分别为大（~0.9 mm）、中大（~0.7 mm）、中（~0.5 mm）和小（~0.3 mm）。最大开口应仅轻微抛光，最小开口直径约为最大的三分之一。</li>
	<li>在收获神经元的前一天，使用70%乙醇清洁四片25 mm玻璃盖玻片，并通过本生灯火焰灼烧。将每片盖玻片放入无菌的35 mm培养皿中，各加入2 ml&#160;无菌 1% 聚-D-赖氨酸溶液（dH₂O 配制）2O. 将培养皿放入培养箱（37 °C）中孵育过夜。次日，用无菌 dH₂O 洗涤2O 3x，让盖玻片完全干燥。</li>
	<li>将1 M乳酸分装为75 µl每份，GlutaMAX分装为200 µl每份；储存于-20 °C。使用前将乳酸和GlutaMAX分装样品完全解冻，以确保均匀性。</li>
	<li>收获神经元当天，制备30 ml&#160;由Hibernate-A原液配制的新鲜培养基，其中含1 mM乳酸、0.5 mM GlutaMAX和2%不含胰岛素的B27。涡旋混匀后，用1 N NaOH调节pH至7.4。</li>
	<li>加入10 ml&#160;在冰上将2 ml培养基加入60 mm玻璃培养皿中&#160;在15 ml&#160;将锥形管置于冰上，并将剩余培养基置于室温保存。</li>
	<li>在收获神经元当天，配制25 ml&#160;由含有1 mM乳酸、0.5 mM GlutaMAX和2%不含胰岛素B27的Neurobasal培养基组成的 fresh growth media。涡旋混匀后，使用1 N NaOH调节pH至7.4。将新鲜培养基置于培养箱中（37 °C，5% CO₂）平衡2至少 30 分钟。</li>
</ol>
3. 心脏灌注
<ol>
	<li>将 200 ml&#160;灌注液完全解冻，并在冰上用 95% O2/5% CO2 气体氧合至少 15 分钟。</li>
	<li>用丙酮、70% 乙醇和 dH2O 清洗振动切片机刀片，并将其安装至振动切片机中。</li>
	<li>用 dH2O 冲洗振动切片机冷却室和灌注管路。向冷却室（4 °C）中加入灌注液并持续氧合。</li>
	<li>通过腹腔注射稀释 1:1 的戊巴比妥钠（50 mg/ml）麻醉小鼠。通过夹捏尾巴并确认无反应来验证小鼠已完全麻醉。</li>
	<li>在解剖前，将冷的灌注液倒入灌注储液器和管路中。保留 20–30 ml&#160;用于脑组织解剖，并继续在冰上保持氧合。通过置于高处的 60 ml&#160;注射器，利用重力经管路和 20 G 针头实现灌注，此方式可提供足够的流速。让液体持续流动直至排出气泡。继续氧合灌注液。</li>
	<li>剪开小鼠肋骨上方的皮肤。抬起肋骨，小心地在横膈膜上做一水平切口。沿肋骨两侧向上肢方向做两个侧向切口，以暴露心脏。使用镊子将肋骨撑开。</li>
	<li>在右心房做一个约 2 mm 的小切口，作为血管系统中血液流出的出口。</li>
	<li>用灌注针穿刺左心室，深度以刚好插入针孔为宜。一只手固定针头位置，另一只手启动灌注液流速。灌注 10–15 ml&#160;后，血液应已被完全冲洗干净，流出液将变得澄清。</li>
</ol>
4. 脑切片与解剖
<ol>
	<li>心脏灌注后，在使用前将充氧的冷灌注液转移至冰上的培养皿中。</li>
	<li>迅速断头，取出脑组织并将其放入灌注液中。取脑方法如下：将皮肤向前拉，沿中线在颅骨上做切口至眼眶，再向两侧眼眶方向各做一条横向切口，用镊子将颅骨两侧掀开，于两眼眶之间做冠状切口，然后用解剖刀轻轻将脑组织推入灌注液中。如有必要，可用剪刀剪断视束。切勿触碰下丘脑区域，也不要牵拉视束，以免对正中隆起及下方的下丘脑组织造成过大压力。</li>
	<li>将脑组织浸没于液体中，使用剃须刀片和针头从下丘脑前后约3 mm处进行侧向修剪（前囟点 -3.52 mm）。尤其要注意前侧切面保持水平，以便脑组织在振动切片机夹具上放置平稳。</li>
	<li>将剩余脑组织从溶液中取出，并用滤纸吸除固定脑片表面的多余液体。</li>
	<li>在振动切片机夹具上滴一滴瞬干胶，将胶水涂抹至与脑组织大小相当。将脑组织置于胶水上，前侧朝下，下丘脑朝向刀片。吸除多余胶水后，将夹具放入振动切片机的冷却室中。注意不要使用过多胶水，否则当夹具浸入溶液时胶水会产生气泡。</li>
	<li>将振动切片机调至低速（2级）和高振幅（9级），切去300–500 µm厚的组织切片，直至到达下丘脑区域。随后从后向前切出100 µm厚的薄片。可参考以下视觉标志：在下丘脑后方，第三脑室非常小（前囟点 -2.70 至 -2.30 mm）；在前囟点 -2.30 mm处，冠状切面上第三脑室分为背侧和腹侧两部分。</li>
	<li>当第三脑室的切面融合后，连续切下两片500 µm厚的切片，其中将包含正确的腹内侧下丘脑（VMH）区域（前囟点 -2.18 至 -1.22 mm）。在VMH前方，第三脑室不再延伸至脑的腹侧底部（前囟点 -1.06 至 -0.82）8。</li>
	<li>将这些切片转移至盛有培养基并置于冰上的培养皿中。按照图1所示分离腹内侧下丘脑（VMN + ARC）。用移液器将VMH组织块在2 ml&#160;冷培养基中轻柔转移。</li>
</ol>
5. 解离与培养
<ol>
	<li>将VMH从冰上取出，置于室温下。加入20 U/ml&#160;木瓜蛋白酶至 4 ml&#160;培养基。颠倒混匀后置于34 °C水浴中。每隔1分钟颠倒混匀并观察，直至消化液不再浑浊。用0.22 μm滤器过滤至无菌烧瓶中，将组织转移至消化液中。</li>
	<li>在34 °C、100 rpm条件下振荡消化组织30分钟。</li>
	<li>准备 1 ml&#160;含8%牛血清白蛋白（BSA）的培养基中进行消化。将80 mg BSA溶解于1 ml&#160;培养基和滤器（0.22 μm）过滤至锥形管中。</li>
	<li>将组织转移至 5 ml 中进行洗涤&#160;在锥形管中将培养基缓慢倒置一次。</li>
	<li>加入30 µl DNase酶至6 ml&#160;培养基并混合制成吹打培养基。吸除洗涤液，加入3 ml&#160;研磨介质的</li>
	<li>使用玻璃移液管按从大到小的顺序进行吹打。轻柔吹打10次后，静置4分钟。&#160;待较大碎片沉降后，用第二支移液器转移上层2 ml&#160;加入2 ml解离的细胞悬液至新的锥形管中。加入2 ml&#160;加入 trituration 培养基，吹打 10 次，静置 3 分钟。用第三支移液枪转移上层 2 ml&#160;加入1毫升至细胞悬液中。&#160;加入消化液，吹打5次，静置2分钟。用第四个移液器转移上层2 ml&#160;加入细胞悬液中。</li>
	<li>将解离的细胞悬液小心地铺在8% BSA上层，避免混合。以1,000 rpm离心5分钟。</li>
	<li>将已灭菌的6 mm × 8 mm克隆环置于每张盖玻片中央。盖玻片必须完全干燥。吸除上清，将沉淀重悬于440 µl预热的生长培养基中。用神经元悬液填充克隆环，放入培养箱孵育20分钟。</li>
	<li>移除克隆环，并非常轻柔地冲洗掉碎片。每皿加入 2 ml&#160;培养基。在进行任何检测之前，让细胞恢复至少1小时。</li>
</ol>
6. MPD 成像的准备工作
<ol>
	<li>配制记录液，包含 121 mM NaCl、4.7 mM KCl、2 mM CaCl2、0.1 mM MgCl2、1.2 mM MgSO4、0.97 mM K2HPO4、0.23 mM KH2PO4、5 mM NaHCO3 和 25 mM HEPES。将 pH 调整至 7.4。</li>
	<li>加入葡萄糖以配制所需低葡萄糖测试溶液（0.1–2.0 mM 葡萄糖）。充分混匀，并保留 400 ml&#160;低葡萄糖记录液。向剩余的 600 ml&#160;溶液中加入葡萄糖，配制成 2.5 mM 葡萄糖记录液，并充分混匀。</li>
	<li>应尽可能避免染料暴露于光线下。向一个蓝色 MPD 小瓶中加入 4 ml 室温缓冲液。充分混匀后，按每毫升&#160;记录液加入 5 µl 染料的比例添加。在不同溶液之间用移液器混合，以保持溶液均匀。该染料包含可随细胞去极化进入细胞的荧光分子，以及无法穿过细胞膜的淬灭分子。分装后可于 -20 °C 保存，并在 4 天内使用。避免反复冻融。</li>
	<li>将细胞在 2 ml&#160;含染料的 2.5 mM 葡萄糖记录液中于 34 °C 孵育 30 分钟。可使用干式加热块。注意避光。</li>
	<li>使用含染料的 2.5 mM 和 0.1 mM 记录液准备注射泵和灌流系统。60 ml&#160;注射器的管路应连接至多通管。</li>
	<li>停止任何泵后，应在切换多通管处的溶液前等待约 10 秒&#160;，以防止注射器内压力积聚。压力变化会改变向含神经元的密闭腔室输送的液体流量，导致实验过程中显微镜焦点偏移和图像失真。</li>
	<li>多通管的输出管路应连接至在线加热器，再连接聚乙烯管，最终接入密闭腔室。应清除气泡，并将灌流速率设定为 0.5 ml/min。注意避光。</li>
	<li>将带有贴壁神经元的 25 mm 盖玻片小心转移至密闭腔室，注意避免盖玻片干燥或引入气泡。将盖玻片对准底部组件的凹槽，沿两侧滴加数滴记录液，然后轻轻安装顶部组件以固定盖玻片。</li>
	<li>使用滴管将记录液注入腔室，然后在其上方放置一片 18 mm 盖玻片。将白色环轻轻嵌入腔室以固定较小的盖玻片。应缓慢轻压，防止向密闭腔室内引入气泡。</li>
	<li>启动 2.5 mM 葡萄糖记录液的注射泵，压下白色环，并将管路连接至密闭腔室。缓慢释放白色环上的压力，并将出口管路连接至废液容器。</li>
</ol>
7. MPD 成像
<ol>
	<li>使用低亮度明场光将神经元居中。尽量减少细胞暴露于光照下的时间。</li>
	<li>让灌流系统运行 10 min&#160;，以使温度、焦距和染料达到平衡状态。</li>
	<li>在平衡期间，打开 MetaMorph 程序，对神经元拍摄一张明场图像（10X）。使用自动对焦功能，采集三组荧光图像（150 msec，Narrow Cy3 滤光片，10X），并确定在 5 μm 范围内的最佳焦平面。在 10 min&#160;平衡期结束时，再次检查焦距。</li>
	<li>开始每 30 sec&#160;采集一次荧光图像，持续 40 min。首先在 2.5 mM 葡萄糖条件下建立 10 min 的基线，随后降低葡萄糖浓度维持 15 min，最后恢复至 2.5 mM 葡萄糖浓度持续 15 min。溶液更换方法为：停止注射泵，等待 10 sec，切换多通阀的通道，再启动另一注射泵。根据多通阀与细胞之间的延迟时间，应在目标时间点之前完成溶液切换。</li>
	<li>完成所有荧光图像采集后，对神经元拍摄一张明场图像。</li>
</ol>
8. MPD 成像分析
<ol>
	<li>使用 MetaMorph 软件在实验结束时采集的明场图像中为每个细胞创建椭圆形区域。所选区域应略大于每个神经元，并可设置为超出细胞暗边缘1个像素。避免选择不健康、相互重叠或靠近碎片的细胞。不健康的细胞通常呈现较暗的外观。最后，在无细胞或碎片的区域创建5个较大的椭圆形区域，用于背景测量。</li>
	<li>将选定区域转移至所有荧光图像，并检查以确认未发生任何移动或偏移。使用“测量”功能记录每个区域在所有图像中的荧光强度，并将数据保存至 Excel 文件。建议使用 Metamorph 软件中的“期刊”（Journals）功能。</li>
	<li>在 Excel 中，对每张荧光图像的 5 个背景区域取平均值，该值代表每个时间点的平均背景值。对于每张图像/时间点，从所有区域的测量值中减去该背景值。此后，经背景校正的荧光强度将简称为“强度”。</li>
	<li>对每个细胞，计算记录开始后第2至8分钟的平均荧光强度。该值代表细胞在2.5 mM葡萄糖条件下的基础水平。每次处理前后均设置2分钟的缓冲期，以尽量减少噪声干扰。</li>
	<li>对于每个细胞，计算其相对于基线的百分比变化：(强度 - 基线) / 基线</li>
	<li>创建一个以基线变化百分比为纵轴、时间为横轴的折线图。</li>
	<li>计算第18至23分钟期间相对于基线的平均百分比变化。计算第35至40分钟期间相对于基线的平均百分比变化。尽管未使用图像处理技术，但通过在每个细胞区域内对强度进行平均、背景扣除以及对5分钟内的区域强度进行平均，从而降低了噪声。&#160;或更长时间。</li>
	<li>对照实验需将2.5 mM葡萄糖记录液更换为新的2.5 mM葡萄糖记录液，以确定噪声阈值。计算至少6个培养皿来自3只小鼠在第18至23分钟期间相对于基线的平均百分比变化。计算这些数值的均值和标准差。</li>
	<li>将阳性去极化反应的阈值设定为均值加2个标准差。均值加2个标准差对应的差异具有 p < 0.05 的统计学意义。&#60;0.05。我们的对照实验显示，相较于基线值，10% 的变化是合适的阈值。</li>
	<li>针对每个细胞，根据以下两个标准评估其可逆性去极化反应。第一，第18至23分钟期间相对于基线的平均百分比变化必须大于10%，该阈值为前一步骤中确定。第二，第35至40分钟期间相对于基线的平均百分比变化必须小于第18至23分钟期间相对于基线平均百分比变化的一半。选择第二个标准是因为其被发现比谷氨酸或KCl刺激更为严格。不健康的神经元常常会对谷氨酸或KCl刺激产生反应，即使其在葡萄糖浓度降低时的反应不可逆。</li>
	<li>对于每个培养皿，计算去极化神经元的百分比。该数值用于量化不同处理组中胃肠道神经元的百分比。</li>
</ol>

<ol><li>Routh, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose-sensing+neurons%3A+are+they+physiologically+relevant%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Behav%22%5BJournal%5D)">Glucose-sensing neurons: are they physiologically relevant?</a> Physiol. Behav. 76, 403-413 (2002).</li>
<li>Canabal, D. D., Potian, J. G., Duran, R. G., McArdle, J. J., Routh, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperglycemia+impairs+glucose+and+insulin+regulation+of+nitric+oxide+production+in+glucose-inhibited+neurons+in+the+ventromedial+hypothalamus%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Hyperglycemia impairs glucose and insulin regulation of nitric oxide production in glucose-inhibited neurons in the ventromedial hypothalamus.</a> Am. J. Physiol. 293, 592-600 (2007).</li>
<li>Canabal, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose%2C+insulin%2C+and+leptin+signaling+pathways+modulate+nitric+oxide+synthesis+in+glucose-inhibited+neurons+in+the+ventromedial+hypothalamus%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+physiology.+Reg.+Integr.+Comp.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Glucose, insulin, and leptin signaling pathways modulate nitric oxide synthesis in glucose-inhibited neurons in the ventromedial hypothalamus.</a> American journal of physiology. Reg. Integr. Comp. Physiol. 292, 1418-1428 (2007).</li>
<li>Murphy, B. A., Fakira, K. A., Song, Z., Beuve, A., Routh, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AMP-activated+protein+kinase+and+nitric+oxide+regulate+the+glucose+sensitivity+of+ventromedial+hypothalamic+glucose-inhibited+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">AMP-activated protein kinase and nitric oxide regulate the glucose sensitivity of ventromedial hypothalamic glucose-inhibited neurons.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 297, C750-C758 (2009).</li>
<li>Murphy, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fasting+enhances+the+response+of+arcuate+neuropeptide+Y-glucose-inhibited+neurons+to+decreased+extracellular+glucose%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Fasting enhances the response of arcuate neuropeptide Y-glucose-inhibited neurons to decreased extracellular glucose.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 296, C746-C756 (2009).</li>
<li>Kang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucokinase+is+a+critical+regulator+of+ventromedial+hypothalamic+neuronal+glucosensing%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Glucokinase is a critical regulator of ventromedial hypothalamic neuronal glucosensing.</a> Diabetes. 55, 412-420 (2006).</li>
<li>Kang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prior+hypoglycemia+enhances+glucose+responsiveness+in+some+ventromedial+hypothalamic+glucosensing+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Reg.+Integr.+Comp.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Prior hypoglycemia enhances glucose responsiveness in some ventromedial hypothalamic glucosensing neurons.</a> Reg. Integr. Comp. Physiol. 294, R784-R792 (2008).</li>
<li>Paxinos, G., Franklin, K. B. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+Mouse+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates%22">The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates</a>. , Academic Press. (2004).</li>
<li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+Rat+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates%22">The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates</a>. , 4th edn, Academic Press. (1998).</li>
<li>Song, Z., Levin, B. E., McArdle, J. J., Bakhos, N., Routh, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Convergence+of+pre-+and+postsynaptic+influences+on+glucosensing+neurons+in+the+ventromedial+hypothalamic+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Convergence of pre- and postsynaptic influences on glucosensing neurons in the ventromedial hypothalamic nucleus.</a> Diabetes. 50, 2673-2681 (2001).</li>
<li>Song, Z., Routh, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+glucose+and+lactate+on+glucosensing+neurons+in+the+ventromedial+hypothalamic+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Differential effects of glucose and lactate on glucosensing neurons in the ventromedial hypothalamic nucleus.</a> Diabetes. 54, 15-22 (2005).</li>
</ol>

我们没有需要披露的内容。

能够研究成年小鼠神经元活性的关键在于获得健康的离散神经元。与幼年小鼠相比，从成年小鼠分离下丘脑神经元在实验方案的多个关键步骤上更为困难。我们已通过多种方式克服了这一问题。制备较厚的500 µm脑切片，相较于通常用于幼鼠脑组织的250–350 µm切片，可显著减少对神经元的机械损伤。然而，较厚的切片需要更加注意心脏灌注以及脑组织的木瓜蛋白酶（papain）消化。若在脑组织上观察到血液残留，应评估右心房切口位置及左心室插针的准确性。灌注液的流速和用量也可相应调整。充分的灌注至关重要，因为血液对神经元具有毒性，会导致健康神经元得率降低。木瓜蛋白酶的消化必须足够充分，以实现轻柔的吹打操作，并使单个细胞易于从脑组织中释放。若消化结束时腹内侧下丘脑（VMH）组织迅速沉降，或在第二次吹打时仍存在较大组织块，则提示木瓜蛋白酶消化不充分。在消化良好的情况下，第三次吹打时肉眼几乎无法察觉组织碎片。若吹打操作不够轻柔，将损害神经元的健康状态。若怀疑木瓜蛋白酶消化不充分，可将木瓜蛋白酶浓度提高5 U/ml&#160;，或更换新瓶木瓜蛋白酶。但木瓜蛋白酶浓度不应超过30 U/ml&#160;，否则可能损害神经元健康。
<p class="jove_con...

大脑通过神经内分泌系统和自主神经系统调节能量稳态。腹内侧下丘脑（VMH）由腹内侧核（VMN）和弓状核（ARC）组成，在能量稳态的中枢调控中具有重要作用。VMH内的特化葡萄糖感应神经元将神经元活动与外周葡萄糖稳态相联系1。葡萄糖感应神经元分为两种类型：当细胞外葡萄糖浓度升高时，葡萄糖兴奋性（GE）神经元的活动增强，而葡萄糖抑制性（GI）神经元的活动减弱。通常采用电生理学或钙离子/膜电位敏感性染料成像技术来研究VMH中的葡萄糖感应神经元。
膜片钳电生理技术被认为是研究离子通道功能的金标准 离体 神经元活动。该技术通过高阻抗（GΩ）封接将玻璃微电极贴附于细胞膜上。膜片钳电极可实时记录单个神经元的动作电位频率（电流钳）或离子电导（电压钳）的变化。尽管膜片钳技术能够提供关于特定离子通道电导变化的详细信息，但其主要局限在于每次只能观察一个神经元。整个过程大约需要30–45分钟&#160;记录以验证在开始任何特定实验处理之前，是否正在记录葡萄糖感应神经元。此外，GI 和 GE 神经元包括 &#60;下丘脑腹内侧核（VMH）神经元群体的20%。更为复杂的是，许多情况下缺乏可用于识别这些神经元的特异性细胞标记物。因此，尽管膜片钳技术能够提供其他方法无法获得的宝贵电生理信息，但其操作繁琐、耗时较长且产出率低。
对分离的腹内侧下丘脑（VMH）神经元进行荧光成像，可实现同时研究数百个神经元。利用钙敏感性染料可检测细胞内钙离子浓度的变化，该变化间接反映神经元活动的改变。膜电位敏感性染料则用于监测膜电位的变化。相较于细胞内钙离子水平的变化，细胞膜电位的测量是评估神经元活动更为直接的指标。此外，膜电位染料（MPD）成像技术有可能检测到更微小的膜电位变化，这些变化可能不足以引发动作电位的发放，也不会引起细胞内钙离子水平的明显改变。这两种荧光成像技术均已用于研究来自幼年小鼠的VMH葡萄糖感受神经元2-7。尽管其结果的精细程度不及膜片钳电生理记录，但成像实验的优势在于能够同时评估大量细胞群体，其中不可避免地包含相当数量的葡萄糖感受神经元。MPD成像在研究GI神经元方面尤为有用，因为GI神经元在整個VMH区域中的分布较为均匀，因此在分离的VMH组织中可提供足够数量的样本用于研究（约占15% GI）。相比之下，GE神经元虽密集分布于腹外侧VMN区以及弓状核（ARC）与VMN之间的细胞稀疏区域，但在VMH整体神经元中所占比例极小（&#60;1% GE）。此外，通过研究分离的神经元，可消除星形胶质细胞及突触前效应的影响。这在研究初级神经元效应时具有优势，但同时也存在劣势，即生理性的连接和过程因此丢失。
在膜片钳电生理学和MPD/钙离子染料成像技术中，一个限制性因素是必须使用较年轻的动物（例如&#160;小鼠或大鼠，年龄&#60;8周）。这主要是由于随着年龄增长，结缔组织增多，同时神经元存活能力下降。在脑片电生理研究中，增多的结缔组织使得神经元更难被观察到。此外，结缔组织增加也使得难以分离出大量健康的神经元用于成像研究。而且，来自较年轻动物的神经元在膜片钳记录或成像过程中存活时间更长。然而，使用幼年动物可能带来重大局限性。神经元活动以及对神经递质或循环营养物质的反应会随年龄发生变化。例如，由于能量平衡与生殖状态密切相关，因此调控能量平衡的下丘脑神经元在青春期前与青春期后动物中的反应可能不同。此外，许多疾病需要长期治疗，或直到成年期才显现，典型的例子包括饮食性肥胖和2型糖尿病。鉴于葡萄糖感应神经元被认为在这些疾病中发挥一定作用，我们建立了一种方法，能够成功培养健康的成年期腹内侧下丘脑（VMH）神经元，用于MPD成像实验。

<table><tbody><tr><td>Neurobasal-A 培养基（定制）</td><td>Invitrogen</td><td>0050128DJ</td><td>定制无葡萄糖</td></tr><tr><td>Hibernate-A 培养基（定制）</td><td>BrainBits</td><td></td><td>定制无葡萄糖</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（20,000 U/ml）</td><td>Invitrogen</td><td>15140</td><td>其他供应商亦可接受</td></tr><tr><td>Stericup 真空滤器装置（0.22 &amp;mu;m)</td><td>Millipore</td><td></td><td>其他供应商可接受</td></tr><tr><td>25 mm 玻璃盖玻片</td><td>沃纳</td><td>#1 25毫米圆形</td><td></td></tr><tr><td>18 mm 玻璃盖玻片</td><td>沃纳</td><td>#1 18毫米圆形</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Invitrogen</td><td>35050</td><td></td></tr><tr><td>B27 去胰岛素（50倍浓缩）</td><td>Invitrogen</td><td>0050129SA</td><td></td></tr><tr><td>剃刀刀片</td><td>VWR</td><td>55411</td><td></td></tr><tr><td>振动切片机 &amp;和冷却室</td><td>振动切片机</td><td>1000 系列切片系统</td><td></td></tr><tr><td>振动切片机刀片</td><td>Polysciences</td><td>22370</td><td>注射器或其它供应商的双刃刀片可接受</td></tr><tr><td>木瓜蛋白酶，悬液</td><td>沃辛顿</td><td>LS003124</td><td></td></tr><tr><td>BSA，适用于细胞培养</td><td>Sigma</td><td></td><td>其他供应商可接受</td></tr><tr><td>DNA酶，用于细胞培养</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>其他供应商可接受</td></tr><tr><td>克隆环，6 mm × 8 mm</td><td>贝尔科玻璃</td><td>2090-00608</td><td></td></tr><tr><td>膜电位染料（蓝色）</td><td>Molecular Devices</td><td>R8042</td><td></td></tr><tr><td>在线加热器</td><td>沃纳</td><td>SF-28</td><td></td></tr><tr><td>注射泵</td><td>WPI</td><td>sp100i</td><td>其他供应商可接受</td></tr><tr><td>封闭室</td><td>沃纳</td><td>RC-43C</td><td></td></tr><tr><td>聚乙烯管</td><td>沃纳</td><td>PE-90</td><td></td></tr><tr><td>Metamorph</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>可接受的替代图像分析软件</td></tr><tr><td>显微镜</td><td>奥林巴斯</td><td>BX61 WI</td><td> &lt;p&gt;与10X联用&amp;nbsp;&lt;span style=&quot;字体大小：13px；行高：1.6em&quot;&gt;目的&lt;/span&gt;&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td>相机</td><td>光度测量</td><td>Cool Snap HQ</td><td></td></tr><tr><td>窄带Cy3滤光片组</td><td>色度</td><td>41007a</td><td></td></tr><tr><td>照明系统</td><td>Sutter Instruments</td><td>Lambda DG-4</td><td></td></tr></tbody></table>

成年小鼠腹内侧下丘脑神经元膜电位染料成像用于研究葡萄糖感应

Membrane Potential Dye Imaging of Ventromedial Hypothalamus Neurons From Adult Mice to Study Glucose Sensing

对神经元活动的研究通常使用出生不到2个月的啮齿类动物神经元，因为随着年龄增长，结缔组织增多以及神经元存活能力下降，导致实验技术难度增加。在此，我们描述了一种从成年小鼠下丘脑中分离健康神经元的方法。能够研究成年小鼠的神经元，使得可以利用那些在较晚年龄才显现的疾病模型，并可能在某些研究中更符合发育实际情况。对分离神经元进行荧光成像可用于研究一群神经元的整体活动，而不是像电生理学那样仅研究单个神经元。当研究的神经元群体具有异质性且目标神经元类型稀少时（例如下丘脑葡萄糖感应神经元），这种方法尤其有用。我们采用膜电位染料成像技术，研究成年小鼠腹内侧下丘脑神经元对细胞外葡萄糖浓度变化的反应。葡萄糖感应神经元被认为在能量平衡的中枢调控中发挥重要作用。能够在成年啮齿类动物中研究葡萄糖感应功能尤为重要，因为与能量平衡失调相关的疾病（例如&#160;肥胖）的发病率随年龄增长而升高。

精确地将腹内侧下丘脑（VMH）与其他下丘脑区域分离对于获得一致的结果至关重要。若包含其他区域，可能会稀释VMH神经元群体，从而改变所计算的去极化神经元百分比。此外，其他下丘脑区域（如外侧下丘脑）也已鉴定出存在葡萄糖感应神经元，这些神经元在功能和机制上可能与VMH的葡萄糖感应神经元不同。 图1 展示了正确解剖位置以进行精确解剖。按照上述方案操作后，可分离出包含正确腹内侧下丘脑（VMH）区域的脑组织。进一步精细分离腹内侧核（VMN）与弓状核（ARC），同时完整保留各亚群全部结构，可能无法实现。 图2 显示了健康的离解下丘脑腹内侧核（VMH）神经元的一个示例。通过免疫细胞化学方法，我们证实了我们的制备样本 &gt;90%为神经元。仅应使用健康的神经元进行数据分析，含有过多不健康神经元的培养皿应予以弃用。不健康的神经元通常边缘颜色较深，对MPD的摄取程度更高，且形态不规则。此外，神经元接种密度应控制在记录期间大多数神经元互不接触的水平。用于分析的神经元不应与其他细胞或碎片接触。
来自GI神经元和非GI神经元记录的数据如<s...

通过从成年小鼠特定脑区分离神经元，并利用荧光膜电位染料成像技术，可研究成年小鼠单个神经元的活动。通过检测神经元对葡萄糖浓度变化的反应，该技术可用于研究成年小鼠腹内侧下丘脑神经元对葡萄糖的敏感性。

对神经元活动的研究通常使用不到2个月大的啮齿类动物的神经元进行，这是由于与...相关的技术困难

本实验的总体目标是利用膜电位敏感性染料作为神经元活性的指标，评估老年小鼠腹内侧下丘脑（VMH）神经元的葡萄糖感知能力。首先，对麻醉小鼠进行心脏灌注，以清除脑组织中的血液，随后取出脑组织。第二步是制备冠状脑切片并分离出VMH区域。接下来，将下丘脑腹内侧核（VMH）神经元解离并接种在盖玻片上进行培养。最后一步是在膜电位染料存在的情况下，随着葡萄糖浓度降低，检测神经元的荧光强度变化。最终，通过每个神经元荧光信号的变化来定量分析该葡萄糖抑制型神经元对葡萄糖浓度变化的反应。与现有方法（如电生理学）相比，该技术的主要优势在于能够研究成年小鼠的神经元，从而让我们能够在成年阶段研究疾病状态。开始操作时，将解剖好的脑组织置于振动切片机腔室的持样器上，将振动切片机的速度设为2级低速、振幅设为9级高振幅，切片厚度为300至500微米，直至到达下丘脑区域。然后从后部到前部以100微米的厚度切取薄片，以分离出精确的腹内侧下丘脑（VMH）区域。在bgma负2.30毫米处需密切注意解剖结构的变化。第三脑室被分为背侧和腹侧部分。Corona。当第三脑室的横切面融合后，切下两片500微米厚的切片，这些切片将包含正确的腹内侧下丘脑（VMH）区域。将这些切片转移至含有培养基、置于冰上的培养皿中，随后解剖VMH。使用移液器将VMH组织块轻柔地转移至冰上预冷的数毫升培养基中。在此步骤中，将含有VMH的培养基从冰上取出，使其适应室温。向4毫升培养基中加入每毫升20单位的pape，然后颠倒混匀，并置于34摄氏度水浴中。每隔一分钟检查并颠倒混匀一次，直至消化液不再浑浊为止。随后，将溶液过滤至无菌烧瓶中，并将组织转移至消化液中。接着，在34摄氏度、100转/分钟的条件下振荡消化30分钟。消化过程中，通过将80毫克牛血清白蛋白（BSA）溶解于1毫升培养基中，配制含有8%牛血清白蛋白的1毫升培养基，并将其过滤至锥形管中备用。将组织转移至含有5毫升培养基的锥形管中，缓慢倒置以洗涤组织。随后，在6毫升培养基中加入30微升DNA酶，混匀以制备消化培养基。然后吸除洗涤用培养基，加入3毫升消化培养基。使用玻璃移液管按从大到小的顺序轻轻吹打10次，然后静置4分钟，使较大的组织块沉淀。接着，用第二支移液管将上层含有解离细胞悬液的2毫升转移至新的锥形管中。加入2毫升三重培养基，吹打10次，静置3分钟。使用第三支移液器将上层两毫升转移至细胞悬液中。随后，加入一毫升三重培养基，重复五次，每次间隔两分钟。使用第四支移液器将上层两毫升转移至细胞悬液中。将解离的细胞悬液小心地铺在8% BSA上层，注意不要混合。然后以1000 RPM离心5分钟。接下来，将已灭菌的6×8毫米克隆环置于每张完全干燥的盖玻片中央。然后吸除上清，将沉淀重悬于440 µL预热的生长培养基中。随后，用神经元悬液填充克隆环，并将培养皿放入培养箱中孵育20分钟。取出克隆环，轻轻冲洗去除碎片。然后向每块培养皿中加入两毫升培养基，使细胞恢复至少一小时后再进行任何检测。在此步骤中，配制记录液并将 pH 值调节至 7.4。现在向一个蓝色 MPD 瓶中加入四毫升室温缓冲液，充分混匀，然后每毫升记录液中加入五微升染料。随后，将细胞在含有染料、含 2.5 毫摩尔葡萄糖的两毫升记录液中，于 34 摄氏度避光孵育 30 分钟。然后，将注射泵中装入2.5或0.1毫摩尔的葡萄糖记录液，灌流系统中装入2.5毫摩尔的葡萄糖记录液。将60毫升注射器的管路连接至多通管。多通管的输出管路应连接至一个管内加热器，再连接聚乙烯管路，最后接入一个封闭室。必要时通过运行灌流系统并用硬物轻敲以清除气泡。然后将灌流速度设置为 0.5 毫升每分钟，并在最短时间内使用最低光照强度完成系统设置。接着，将带有贴壁神经元的 25 毫米盖玻片转移至封闭腔室中。注意避免盖玻片干燥，并防止引入气泡。将盖玻片对齐底部部件的凹槽中。沿两侧滴加数滴记录液，然后轻轻盖上顶部部件，以固定盖玻片。然后用滴管将记录液注入腔室，并在其上方放置一个18毫米的盖玻片。轻轻将白色环圈嵌入腔室，以固定较小的盖玻片。随后，非常缓慢而轻柔地向下按压白色环圈，以防止气泡进入封闭的腔室。启动注射泵，用于2.5毫摩尔葡萄糖记录溶液。然后按下白色环，将其连接至封闭室。缓慢释放白色环上的压力，并将其连接至通向废液容器的管路。对于MPD成像中心，使用低亮度明场光观察神经元。尽量减少细胞暴露于光照下的时间，并在灌流系统启动后运行10分钟，以使温度、焦距和染料平衡达到稳定状态。打开METAMORPH程序，以10倍放大倍数采集神经元的明场图像。使用自动对焦功能拍摄三组荧光图像，并确定在五微米范围内的焦平面。在10分钟的预孵育期结束时，再次检查焦平面，然后开始每30秒采集一次荧光图像，持续40分钟。在2.5毫摩尔葡萄糖条件下建立10分钟的基线。然后将葡萄糖浓度降低并维持15分钟，最后恢复至2.5毫摩尔葡萄糖持续15分钟。在记录所有荧光图像后，采集神经元的明场图像。该图显示了来自成年小鼠健康腹内侧下丘脑（VMH）神经元的明场图像。此图像采集于解离后24小时，用于MPD成像。图中已标记出可用于或不适用于分析的神经元示例。以下是绿色标记的胃肠道相关（GI）神经元和橙色标记的非GI神经元的代表性MPD荧光轨迹：细胞灌流2.5毫摩尔葡萄糖记录液10分钟，随后降低至0.1毫摩尔G持续15分钟，再恢复至2.5毫摩尔G持续15分钟。该图显示了成年腹内侧下丘脑（VMH）神经元中可逆性去极化的细胞百分比，这些神经元通过荧光MPD成像技术检测到葡萄糖水平降低时发生去极化反应。葡萄糖变化幅度与去极化神经元的百分比呈正相关。按照本实验流程，还可采用其他方法，例如单细胞逆转录聚合酶链式反应（single cell R-T-P-C-R），以鉴定葡萄糖感受神经元所表达的特定蛋白质。

membrane-potential-dye-imaging-ventromedial-hypothalamus-neurons-from

Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

膜下丘脑腹内侧神经元的电位染料成像从成年小鼠为研究葡萄糖传感

在本方案中，我们介绍了利用红色荧光Ca2+指示剂染料对脑组织切片中GFP标记的神经元进行Ca2+信号成像的最新进展。...

对下丘脑小鼠脑切片中GFP标记神经元的钙反应进行成像

该视频展示了一种利用基于荧光共振能量转移（FRET）的细胞内葡萄糖传感器，测量果蝇（Drosophila）幼虫运动神经元葡萄糖摄取的技术。在解剖幼虫以暴露腹神经索后，可通过传感器供体荧光团发出的荧光观察运动神经元。当葡萄糖刺激时，传感器的供体与受体荧光团之间发生FRET，触发受体荧光团发射荧光，从而实现对照组幼虫与葡萄糖代谢上调突变体幼虫之间葡萄糖摄取水平的比较。...

评估运动神经元中的葡萄糖摄取 果蝇 葡萄糖代谢上调的幼虫

来源：Changou, C. A., 等 使用去卷积显微镜观察小鼠原代下丘脑神经元中GLUT4蛋白转运的活体成像 视频实验杂志...

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使用两种基因编码的荧光电压传感器进行膜电位成像

本方案描述了一种利用去卷积显微镜观察胰岛素刺激下实时绿色荧光蛋白（GFP）标记的葡萄糖转运蛋白4（GLUT4）转运过程，并鉴定CCR5在胰岛素-GLUT4信号通路中生物学作用的技术。...

使用去卷积显微镜对小鼠原代下丘脑神经元中GLUT4蛋白转运的活体成像

本方案通过使用微型渗透泵脑内灌注系统将拮抗剂MetCCL5递送至小鼠脑内，研究趋化因子（C-C模体）配体5（CCL5）在下丘脑中的作用。这种对CCL5活性的短暂抑制会中断下丘脑胰岛素信号传导，导致葡萄糖耐受不良和外周系统性胰岛素敏感性下降。...

利用小鼠脑部连续药物输注系统研究下丘脑胰岛素信号对周围性葡萄糖耐受不良的影响

活体成像是研究健康与疾病状态下生物学的有力工具。本方案描述了使用标准双光子显微镜对小鼠视网膜进行经瞳孔成像的方法。同时展示了多种活体成像技术，用于对视网膜中多个细胞群体进行荧光标记。...

经瞳孔双光子活体小鼠视网膜成像

测量葡萄糖摄取 果蝇 TDP-43蛋白病变模型

迷走神经介导的肠-脑通信对于胃肠道内分泌系统与大脑之间的信息传递至关重要。然而，胃内注射葡萄糖是否能够改变皮层活动仍不清楚。本文提供了一种全面的实验方案，用于观察葡萄糖注入十二指肠后皮层活动的变化。...

肠道-脑神经通讯的实时分析：肠道葡萄糖刺激下的全皮层钙动力学

学习膜电位敏感染料成像技术，用于评估成年小鼠腹内侧下丘脑神经元对葡萄糖变化的反应活性。该方法有助于研究代谢调控与神经科学中的葡萄糖感应机制。

成年小鼠腹内侧下丘脑神经元膜电位染料成像用于研究葡萄糖感应

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