Name: 方法研究抗精神病药物的作用机制在秀丽隐杆线虫 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: 了解抗精神病药物对秀丽隐杆线虫发育和咽泵行为的影响机制。该方法通过同步化虫群并在含药培养板上培养，评估药物对发育延迟和咽泵抑制的效应，为神经药理学研究提供重要模型。

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本工作获得了美国国立卫生研究院临床科学家发展奖K08NS002083、谢尔弗特·弗雷泽研究所研究基金以及NARSAD青年研究者奖的资助，上述奖项均授予Edgar A. Buttner。

1. 发育迟缓/致死率检测：在12孔板中，对野生型（N2）及两种突变型（Mut1 和 Mut2）菌株在三种氯氮平浓度下进行测试
<ol>
	<li>第1天，将2 ml NGM培养基10倒入12孔板的每个孔中（每孔直径为2 cm），在室温（RT）下静置过夜使其凝固。同一天，挑取一单个大肠杆菌（Escherichia coli）OP50菌落，接种至50 ml LB液体培养基中，在37 °C、220 rpm摇床中过夜培养。</li>
	<li>第2天，将20 µl OP50菌液转移至每个NGM孔的中央。将培养板置于37 °C培养箱中，或在室温下过夜放置，以促进细菌菌膜增厚。</li>
	<li>通过将氯氮平溶解于DMSO（二甲基亚砜）溶剂中，配制80 mM氯氮平储备液。然后根据表1，用储备液与1.7 mM乙酸稀释，配制80 µl工作溶液。 
	注意：针对特定研究药物的工作浓度，需通过一系列预实验浓度梯度测试，确定最适浓度以区分野生型与突变体。</li>
	<li>将80 µl氯氮平工作溶液转移至已接种细菌的NGM孔中，轻轻旋转培养板使溶液均匀分布于表面。待培养板干燥后，当天即可用于实验，或置于20 °C培养箱中保存，次日使用。 
	注意：由于氯氮平溶解度较低，尤其在高浓度时，工作溶液为药物悬浮液。因此，在将溶液转移至药物板前，需充分涡旋混匀，以确保药物浓度准确。</li>
	<li>用M9缓冲液冲洗含有大量成年 gravid 线虫的3.5 cm培养皿，将线虫收集至15 ml离心管中，在2,000 rpm下离心1分钟。</li>
	<li>吸除上清液，加入5 ml漂白液（NaOH:次氯酸钠:ddH2O 比例为4:1:5），轻轻颠倒混匀以裂解线虫。</li>
	<li>观察线虫裂解情况，约5分钟后当一半个体溶解时，以2,000 rpm离心1分钟收集卵。</li>
	<li>吸除上清液，迅速加入14 ml M9缓冲液。</li>
	<li>以2,000 rpm离心1分钟，吸除上清液，保留约100 µl溶液。涡旋振荡使卵充分悬浮。</li>
	<li>取2 µl含卵的M9悬浮液转移至普通NGM平板，检测转移卵的数量。调整悬浮液的体积，确保每次转移含有约30–35个卵。将30–35个卵转移至检测板的每个孔中，随后在20 °C培养箱中培养24小时。</li>
	<li>在实验第一天，记录孵化卵的数量。如有必要，挑除多余线虫，将每孔孵化个体总数调整为25只。</li>
	<li>在后续几天中，每天观察并记录线虫发育情况，每隔24小时评分一次。发育阶段根据线虫体型大小及阴门形态11进行判定。实验持续5–6天，通常在第三或第四天观察到最显著的表型差异。</li>
	<li>将数据录入Excel文件，计算实验每一天各发育阶段线虫所占百分比。使用“二维柱形图”菜单中的“100%堆积柱形图”功能生成图表。</li>
</ol>
2. 咽泵实验：在氯氮平检测平板上对野生型和突变株的年轻成年动物进行评分
<ol>
	<li>检测板的制备采用与发育延迟/致死率检测相同的实验方案。</li>
	<li>在检测前24小时，将每种品系的50只L4期线虫挑至已铺有菌的NGM平板上，并在20 °C条件下培养线虫。</li>
	<li>将10只线虫挑入检测板的一个孔中，随后每隔15–20分钟将10只线虫挑入下一个孔。</li>
	<li>当第一孔中的线虫暴露于药物30分钟后，开始在解剖显微镜下观察咽部泵动，并记录20秒内的泵动次数9。完成咽部泵动计数后，将线虫从平板上移除。</li>
</ol>

<ol><li>Donohoe, D. R., Jarvis, R. A., Weeks, K., Aamodt, E. J., Dwyer, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+adaptation+in+C.+elegans+produced+by+antipsychotic+drugs+requires+serotonin+and+is+associated+with+calcium+signaling+and+calcineurin+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Behavioral adaptation in C. elegans produced by antipsychotic drugs requires serotonin and is associated with calcium signaling and calcineurin inhibition.</a> Neurosci. Res. 64, 280-289 (2009).</li>
<li>Karmacharya, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clozapine+interaction+with+phosphatidyl+inositol+3-kinase+%28PI3K%29%2Finsulin-signaling+pathway+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Clozapine interaction with phosphatidyl inositol 3-kinase (PI3K)/insulin-signaling pathway in Caenorhabditis elegans.</a> Neuropsychopharmacology. 34, 1968-1978 (2009).</li>
<li>Rand, J. B., Johnson, C. D. Carnorhabditis elegans Modern Biological Analysis of an Organism. Estein, H. F., Shakes, D. C. 48, Academic Press, Inc.. 187-204 (1995).</li>
<li>Kwok, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small-molecule+screen+in+C.+elegans+yields+a+new+calcium+channel+antagonist%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A small-molecule screen in C. elegans yields a new calcium channel antagonist.</a> Nature. 441, 91-95 (2006).</li>
<li>Wang, X., Sliwoski, G. R., Buttner, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relevance+of+Caenorhabditis+elegans+genetics+for+understanding+human+psychiatric+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Harv.+Rev.+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">The relevance of Caenorhabditis elegans genetics for understanding human psychiatric disease.</a> Harv. Rev. Psychiatry. 19, 210-218 (2011).</li>
<li>Donohoe, D. R., Aamodt, E. J., Osborn, E., Dwyer, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antipsychotic+drugs+disrupt+normal+development+in+Caenorhabditis+elegans+via+additional+mechanisms+besides+dopamine+and+serotonin+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol.+Res%22%5BJournal%5D)">Antipsychotic drugs disrupt normal development in Caenorhabditis elegans via additional mechanisms besides dopamine and serotonin receptors.</a> Pharmacol. Res. 54, 361-372 (2006).</li>
<li>Karmacharya, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+effects+of+clozapine%3A+involvement+of+trace+amine+pathways+in+C.+elegans+and+M.+musculus%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Behavioral effects of clozapine: involvement of trace amine pathways in C. elegans and M. musculus.</a> Brain Res. 1393, 91-99 (2011).</li>
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<li>Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+introduction+to+worm+lab%3A+from+culturing+worms+to+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis.</a> J Vis Exp. 47, (2011).</li>
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<li>Partridge, F. A., Tearle, A. W., Gravato-Nobre, M. J., Schafer, W. R., Hodgkin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+C.+elegans+glycosyltransferase+BUS-8+has+two+distinct+and+essential+roles+in+epidermal+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The C. elegans glycosyltransferase BUS-8 has two distinct and essential roles in epidermal morphogenesis.</a> Dev. Biol. 317, 549-559 (2008).</li>
<li>Leung, C. K., Deonarine, A., Strange, K., Choe, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+and+biosensing+with+fluorescent+C.+elegans+strains%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening and biosensing with fluorescent C. elegans strains.</a> J. Vis. Exp. (51), (2011).</li>
</ol>

作者声明不存在利益冲突。

本文描述了检测抗精神病药物（APDs）对秀丽隐杆线虫（C. elegans）发育和行为影响的方法。由于该类药物在水中溶解度较低，因此使用二甲基亚砜（DMSO）或乙醇来溶解氯氮平。已有报道指出溶剂可能影响C. elegans的生物学特性12，因此必须设置仅含DMSO或仅含乙醇的对照组。我们在实验中使用的最高DMSO浓度为3%，此浓度对C. elegans的发育无明显影响。DMSO可用于溶解多种小分子，甚至某些大分子，例如&#160;脂酸。
这些检测中使用的APD浓度高于给予人类的剂量。这在大多数小分子研究中是常见的 秀丽隐杆线虫，因为高浓度是穿透所必需的 秀丽隐杆线虫 角质层。HPLC 分析表明，氯氮平在 秀丽隐杆线虫 发育测定中的组织接近人脑中预期的组织2.
对于大分子的研究而言，穿透角质层是一个特别值得关注的问题。acs-20突变体以及Bu...

Caenorhabditis elegans 是一种结构简单的遗传学模式生物，适用于大规模的正向和反向遗传筛选以及化学遗传筛选。C. elegans 对多种生物活性化合物具有敏感性，因此已被成功用于阐明多种此类化合物的作用机制。例如，利用线虫药物遗传学研究的生物活性化合物包括乙酰胆碱受体激动剂（例如&#160;左旋咪唑、尼古丁、莫仑太尔和吡喹酮）、麻醉剂（例如&#160;氟烷）、咖啡因、胆碱酯酶抑制剂（例如&#160;涕灭威、克百威和敌百虫）、氟化物、GABA相关化合物（例如&#160;GABA和蝇蕈醇）、伊维菌素、百草枯、佛波酯以及5-羟色胺相关药物（例如&#160;5-羟色胺和丙米嗪）3。此外，C. elegans 已被用于大规模小分子筛选，有助于发现新的生物活性化合物并鉴定新的遗传靶点4。
的 秀丽隐杆线虫 基因组包含在人类中保守的潜在抗精神病药物（APD）靶点，包括编码神经递质合成以及突触结构和功能相关蛋白的基因5因此， 秀丽隐杆线虫 神经遗传学与神经生物学为发现抗精神病药物（APDs）作用的新型分子机制提供了方法。在秀丽线虫中，发育早期暴露于抗精神病药物会导致发育延迟，而在较高浓度下则会导致死亡2,6成年期暴露于APD会产生行为表型。例如，氯氮平暴露会抑制运动和咽部泵动，并促进产卵1,2,7.
APD 引起的发育延迟和致死性是适用于大规模化学遗传筛选的强有力表型。这些表型具有复杂性，因为它们可能具有多种细胞和遗传基础。因此，此类遗传筛选有望发现多种间接药物靶点。然而，本实验室已开展候选基因筛选以及全基因组 RNA 干扰（RNAi）筛选，用于寻找能够抑制 APD 引起的发育延迟和致死性的基因，并成功鉴定出可能编码直接靶点的基因，包括多巴胺受体、胰岛素受体和烟碱型乙酰胆碱受体2,8。基于成虫中 APD 诱导行为的遗传筛选也已促成新 APD 靶点的发现，目前我们正在哺乳动物中验证来自发育和行为筛选的靶点7。因此，利用无脊椎动物化学遗传学方法来发现 APD 新的分子作用机制似乎是可行的5,8。
C. elegans 咽部是一个器官，包含20个神经元、20个肌细胞和20个辅助细胞，外包基底膜。与哺乳动物心脏类似，咽部具有自主性，能够持续将食物从外部环境泵入体内9。咽部泵动速率的抑制会损害摄食，因此导致咽部泵动受抑制的突变或药物会引起发育延迟或停滞9。非典型抗精神病药物（APDs）可抑制咽部泵动速率，部分解释了它们对发育和存活率的影响1,2。本文以非典型抗精神病药物氯氮平为例，演示用于线虫发育和咽部泵动的药物检测方法。

<table><tbody><tr><td>氯氮平</td><td>Sigma</td><td>C6305</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜 (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>乙酸 (HAC)</td><td>Fisher</td><td>BP2401</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠 (NaOH)</td><td>EMD</td><td>SX0590-13</td><td></td></tr><tr><td>次氯酸盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>425044</td><td></td></tr><tr><td>5810 型离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5810 000.017</td><td></td></tr><tr><td>摇床培养箱</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>M1246-0006</td><td></td></tr><tr><td>低温培养箱 815</td><td>Precision Scientific</td><td>J1790-1B</td><td></td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>Olympus</td><td>SZX12</td><td></td></tr><tr><td>35 × 10 mm 培养皿</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9434271</td><td></td></tr><tr><td>12 孔组织培养板</td><td>BD Falcon</td><td>REF 353043</td><td></td></tr></tbody></table>

研究抗精神病药物在caenorhabditis elegans中作用机制的方法

Methods for Studying the Mechanisms of Action of Antipsychotic Drugs in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans 是一种结构简单的遗传学模式生物，适用于大规模的正向和反向遗传筛选以及化学遗传筛选。C. elegans 基因组中包含在人类中保守的潜在抗精神病药物（APD）靶点，包括编码神经递质合成相关蛋白以及突触结构和功能相关蛋白的基因。抗精神病药物的暴露会以浓度依赖的方式导致线虫出现发育延迟和/或致死现象。这些表型部分是由于抗精神病药物抑制了咽部泵动所致1,2。因此，该发育表型具有神经肌肉基础，使其适用于抗精神病药物的药物遗传学研究。本文详细演示了检测抗精神病药物对线虫发育及咽部泵动影响的实验方法。在发育实验中，将同步化的胚胎置于含有抗精神病药物的线虫生长培养基（NGM）平板上，随后每日记录发育中个体所处的发育阶段。在咽部泵动速率检测中，选取特定发育阶段的年轻成虫在含有抗精神病药物的NGM平板上进行测试，记录单位时间内的咽部泵动次数，并计算泵动速率。这些实验方法也可用于研究其他多种小分子甚至大分子的作用。

1. 发育迟缓/致死性实验结果
发育延迟/致死性实验的典型结果如图1a和图1b所示。当对照组中的野生型个体已发育至产卵成虫阶段时（图1a），暴露于氯氮平的野生型个体仍处于幼龄幼虫阶段或已死亡（图1b）。图1c展示了在三种不同浓度的氯氮平处理下，抑制型突变体（Mut1）和增强型突变体（Mut2）与野生型的代表性结果比较。在所有三种氯氮平浓度下，Mut1的致死率均低于野生型，而Mut2的致死率则高于野生型。Mut1存活个体的发育阶段较野生型更为成熟，而Mut2存活个体则表现出相较于野生型的发育延迟。
2. 咽泵频率检测结果
图2展示了在两种氯氮平浓度下，抑制型突变体（Mut...

介绍了在秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）中检测抗精神病药物（APDs）作用的方法。描述了用于评估药物对发育和存活率以及咽部泵动速率影响的实验方案。这些方法也可应用于除APDs以外其他药物类别的药物遗传学实验。

研究抗精神病药物在Caenorhabditis elegans中作用机制的方法

秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）是一种结构简单的遗传学模式生物，适用于大规模的正向遗传筛选、反向遗传筛选以及化学遗传筛选。C.

本实验的总体目标是研究抗精神病药物对海生线虫发育及咽部泵动的影响。首先培养一群成年线虫，并由此获得同步化的动物群体。下一步是将同步化的卵或成虫转移至含有药物的检测培养板中。最后一步是观察并评估药物对线虫的作用效果。最终结果可能表明，抗精神病药物会延缓动物的发育并抑制药物暴露个体的咽部泵动。尽管该方法可为抗精神病药物的作用机制提供见解，但也可用于研究其他小分子甚至脂质等大分子。准备好已知有效浓度的待研究药物。首先，在12孔板的每个孔中加入2毫升NGM培养基。将该板放置一旁，在室温下使其凝固。接着，挑取一环OP50细菌菌落，转移至50毫升LB培养基瓶中。将细菌在37摄氏度、220 rpm振荡条件下过夜培养。次日，取20微升菌液加入已制备好的培养板的每个孔中，并将培养板置于37摄氏度继续孵育过夜。随后，在每个含菌液的孔中加入80微升目标药物，使其达到工作浓度。在此情况下，药物为 C 氯氮平。取样前务必涡旋混匀溶液。轻轻摇动溶液，使其在孔内均匀分布，并在室温下敞开通风，让其充分吸收。然后继续进行检测，或将酶标板在 20 摄氏度下保存过夜，次日开始检测。首先从目标基因型中收集卵。起始线虫群体应包含大量 GR 成虫。用 M9 缓冲液冲洗 3.5 厘米培养皿中的线虫。然后将线虫转移至 15 毫升离心管中，在 2000 ×g 下离心 1 分钟。通过抽吸去除上清液，并加入 5 毫升漂白液。然后轻轻颠倒试管以破坏成虫，并等待动物开始持续溶解。在显微镜下观察溶解的蠕虫。当大约一半的蠕虫已溶解时。大约五分钟后，离心管子以收集卵子，吸除上清液，并迅速用 M 九缓冲液替代。然后像之前一样再次离心管子，除去上清液，仅保留约 100 µL 的 M 九上清液。为悬浮卵子，需涡旋振荡管子。然后取两微升悬浮液转移至NGM平板，计数转移的卵数。接着将药物处理的平板每孔加入30至35个卵，并在20°C下孵育24小时。24小时后，记录孵化的卵数。如果任一孔中存在超过25条线虫，则移除多余的线虫。将平板上的线虫放回培养箱，此后每天以24小时为间隔进行观察，根据线虫的大小及其阴门的形状，对各孔中线虫的发育阶段进行评分。通常在第三天和第四天可观察到显著的效果。实验应持续约一周。对于本方案，在启动检测前一天，应按此前所述方法准备好药物测试板。每种基因型挑选50条四阶段的动物进行实验。将它们转移至NGM平板，于20摄氏度下培养24小时。次日，每15至20分钟将经药物处理30分钟的一组中的10只动物加载到测试孔中，并在解剖显微镜下开始观察其咽部泵动情况。首先，找到一条线虫，然后计数其咽部泵动持续 20 秒。评分完成后，将线虫从培养板上挑出。以相同方式对孔内所有线虫进行评分。进行实验延迟的预期结果。与野生型对照进行致死率检测时应显示，与典型的生长速率进入成虫阶段不同，暴露于氯氮平的动物仍处于幼年幼虫阶段或已死亡。在

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