Name: 原正畸胶质血异草回顾渗透生长和同源脱氢酶 I 突变 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-14T13:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: 了解原发正位胶质瘤异种移植模型的建立方法，用于研究恶性胶质瘤亚型的组织病理学和分子特征。该方法通过将人脑肿瘤标本移植到免疫缺陷小鼠脑内，保留IDH突变等遗传改变，为临床前肿瘤生物学研究和治疗策略开发提供可靠平台。

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我们特别感谢范德堡大学医学中心的患者，他们为分子神经外科组织库提供了宝贵的研究材料。我们感谢建立并维护该组织库的人员：Reid C. Thompson MD（首席研究员）、Cherryl Kinnard RN（研究护士）和 Larry A. Pierce MS（管理员）。组织学服务部分由范德堡大学医学中心（VUMC）转化病理共享资源完成（由范德堡-英格拉姆癌症中心获得的资助 5P30 CA068485 支持）。本研究得到了美国国立神经疾病与卒中研究所（NINDS，资助号 1R21NS070139）、伯勒斯·威康基金以及范德堡医学中心发展基金的资助。MKC 的研究由美国退伍军人事务部、退伍军人健康管理局、研究与发展办公室、生物医学实验室研究与发展项目（资助号 1 I01 BX000744-01）支持。本文内容不代表美国退伍军人事务部或美国政府的观点。

1. 肿瘤细胞悬液的制备
注意：建立和维持原位胶质瘤原代异种移植模型需要获得适当的机构批准，以使用患者样本和实验动物。在范德比尔特大学医学中心，超出诊断所需范围的切除肿瘤组织在获得患者知情同意后，被收集至研究用组织库。样本使用随机生成的5位数 REDcap 数据库编号进行标记，并去除所有可识别患者身份的信息。REDcap 数据库包含组织库中每个样本的去标识化临床数据，包括性别、年龄（岁）、种族、生存状态、病理结果、癌症治疗方案、切除年份以及疾病进展时间。为保持无菌状态并优化原代异种移植方法的成功率，所有试剂、经蒸汽高压灭菌的手术器械以及手术区域均应提前准备或组装完毕。
注意：胶质瘤标本通常含有大量髓鞘和碎片。根据标本大小，可能需要使用超过4根不连续梯度离心管，以充分去除髓鞘和碎片。
注意： 当无或仅有少量明显可见的未解离组织残留时，即表示解离过程完成。在吹打过程中应避免产生气泡。
注意： 解离后细胞活力通常 &#62;90%。细胞活力较低可能由多种因素导致，包括组织处理或从手术室转运的时间不理想、冷冻保存方法或木瓜蛋白酶解离技术。然而，只要能在适当体积内移植足够数量的活细胞，较低的细胞活力仍可能足够。每只小鼠植入50,000–200,000个活细胞，体积为2 &#181;l. 由于注射器针头为斜面尖端，需额外增加 5 &#181;最终体积中应包含细胞悬液的量，以确保每次注射时有足够材料被吸入注射器。例如，若需注射 2 &#181;每只小鼠1微升，5只小鼠总量应为15微升 &#181;15 l &#181;l = (5 × 2 &#181;l) + 5 &#181;l)。
<ol>
	<li>将新鲜切除的、去标识的患者组织置于无菌带盖容器中，冰上运输至实验室。立即处理标本用于移植，或按照下述方法将标本在液氮中冷冻保存，以备后续使用。</li>
	<li>在无菌操作台内，根据试剂盒生产商提供的组分和说明，配制木瓜蛋白酶解离溶液（木瓜蛋白酶溶液、洗涤/蛋白酶抑制剂溶液和不连续梯度溶液）。标记无菌的15 ml聚苯乙烯锥形管，并按如下方式分配溶液：
		<ul>
			<li>1号管：5 ml木瓜蛋白酶溶液</li>
			<li>2号管：3 ml洗涤/蛋白酶抑制剂溶液</li>
			<li>3–6号管：每管5 ml不连续梯度溶液</li>
		</ul>
	</li>
	<li>将胶质瘤标本放入含5 ml木瓜蛋白酶溶液的1号管中，使用5 ml移液器在10–20分钟内反复吹打组织。</li>
	<li>上下吹打10次后，室温孵育2–3分钟，再开始下一轮吹打操作。</li>
	<li>每轮吹打时，逐渐将5 ml移液器的吸头靠近锥形管底部，最后两轮应使吸头接触管底。</li>
	<li>室温下以300 × g离心5分钟。弃去上清液，用3 ml洗涤/蛋白酶抑制剂溶液将沉淀上下吹打重悬10次。</li>
	<li>使用移液器设置为“重力”排液速度，将等体积的细胞悬液小心地分层加至各5 ml不连续梯度溶液（3–6号管）上方。</li>
	<li>将离心管放入配有摆桶转子的离心机中，加速度调至最低档，关闭刹车。室温下以76 × g离心12分钟。由于刹车关闭，离心过程通常持续约20分钟才能完全停止。</li>
	<li>弃去上清液，将各管沉淀用5 ml无菌平衡盐溶液重悬并合并，将细胞置于冰上保存。</li>
	<li>取部分细胞悬液（10–100 µl），使用血细胞计数板结合台盼蓝排斥法测定活细胞密度。</li>
	<li>以300 × g离心5分钟。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于适量无菌平衡盐溶液中，调整细胞密度至每微升含25,000–125,000个活细胞。</li>
	<li>转移适量体积的细胞悬液至200 μl微量离心管（PCR管）中，置于冰上备用。</li>
</ol>
2. 手术部位和器械的准备
注意：操作过程中需佩戴无菌外科手套。根据各机构的具体要求，可能还需穿戴手术服、帽子和面部防护罩。
<ol>
	<li>为啮齿类动物手术准备已消毒的实验台面，并划分出相邻的独立区域，分别用于动物准备、手术区域和动物恢复。</li>
	<li>使用蒸汽高压灭菌器对手术器械进行灭菌。随后，在从一个动物个体转至下一个动物个体时，使用高温珠灭菌器对器械进行瞬时灭菌。</li>
</ol>
3. 诱导、麻醉与镇痛
注意：若手术时间从麻醉开始起超过15分钟，则需要使用接触式热源。为防止低体温，小鼠在术前和术后期间需提供热源（循环热水毯）。
<ol>
	<li>准备用于诱导麻醉的氯胺酮/赛拉嗪混合液，使每只小鼠按每克体重注射10 µl混合液，接受氯胺酮100 mg/kg和赛拉嗪10 mg/kg的剂量。</li>
	<li>表1. 麻醉混合液。
		<table>
			<tbody>
				<tr>
					<td rowspan="2"></td>
					<td rowspan="2">储备液浓度</td>
					<td colspan="3">配制体积（用于）</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>一只小鼠</td>
					<td>五只小鼠</td>
					<td>十只小鼠</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>氯胺酮</td>
					<td>100 mg/ml</td>
					<td>25 µl</td>
					<td>125 µl</td>
					<td>250 µl</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>赛拉嗪</td>
					<td>100 mg/ml</td>
					<td>2.5 µl</td>
					<td>12.5 µl</td>
					<td>25 µl</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>等渗盐水</td>
					<td></td>
					<td>223 µl</td>
					<td>1,113 µl</td>
					<td>2,225 µl</td>
				</tr>
				<tr>
					<td colspan="2">总量</td>
					<td>250 µl</td>
					<td>1,250 µl</td>
					<td>2,500 µl</td>
				</tr>
			</tbody>
		</table>
	</li>
	<li>通过将储备液（10 mg/ml）用无菌无热原水稀释1:20，配制用于镇痛的酮洛芬溶液，使每只小鼠按每克体重注射10 µl溶液，接受5 mg/kg的剂量。</li>
	<li>称量并记录术前体重。单只小鼠体重存在差异，但通常在18–22 g之间。</li>
	<li>使用胰岛素注射器，将氯胺酮/赛拉嗪混合液按每克小鼠体重10 µl的剂量注入腹腔。例如，对于20 g的小鼠，注射200 µl。</li>
	<li>通过夹捏后肢脚趾判断小鼠是否完全麻醉。通常需要3–5分钟，小鼠对夹捏不再产生回缩反应。</li>
	<li>使用胰岛素注射器，将酮洛芬溶液按每克小鼠体重10 µl的剂量皮下注射至侧腹松弛皮肤处。例如，对于20 g的小鼠，注射200 µl。</li>
	<li>使用电推剪剃除颅骨表面的毛发，用棉签蘸取聚维酮碘擦拭暴露的头皮，再用酒精棉片擦拭。重复上述聚维酮碘擦拭和酒精擦拭步骤两次。</li>
	<li>将眼用软膏涂抹于小鼠眼睛表面。</li>
	<li>使用无菌手术刀片，从耳后至眼前方做一条长约1 cm的正中切口。</li>
	<li>将小鼠置于解剖显微镜下，暴露颅骨以识别缝线。使用钻头以环形动作，在冠状缝后方1 mm、前囟外侧2.5 mm处钻出一个骨孔。</li>
</ol>
4. 颅内移植
注意：超过 2.5 µl 的注射体积可能对小鼠致命。
<ol>
	<li>将小鼠固定在立体定位仪上，使其上门齿钩住门齿杆，并安装鼻夹，确保颅骨牢固地保持在中立位置。</li>
	<li>将离心管中的细胞悬液吸取5–10 µl，用固定在立体定位操作臂上的10 µl Hamilton注射器反复吹打数次，以混匀细胞悬液并排除气泡。推动针栓，使注射器内装载2 µl细胞悬液（足够注射一只动物）。</li>
	<li>牵拉皮肤切口的侧缘以暴露钻孔位置，并使用显微操作器将针头插入钻孔，使斜面部分刚好位于颅骨表面下方。
		<ol>
			<li>将针头推进3 mm，然后回撤0.5 mm，以留出注射空间。</li>
			<li>在30秒内缓慢推进针栓，随后让针头在脑内停留额外2分钟。以每次上升0.5 mm并等待30秒的方式逐步撤出针头，直至完全从脑组织中移除。</li>
		</ol>
	</li>
	<li>将小鼠从立体定位仪上取下，使用自动缝合夹关闭伤口。</li>
	<li>将小鼠置于加热垫上以维持体温，并持续监测其呼吸模式以及黏膜和暴露组织（足底）的颜色。</li>
	<li>待小鼠完全从麻醉状态恢复（能够保持胸卧位并自主活动）后，将其放入无菌独立通气隔离笼中，并送回动物饲养设施。</li>
</ol>
5. 植入后动物护理与观察
注意： 肿瘤植入及浸润性生长最可靠的指征是逐渐且持续的体重下降，伴随弓背姿势和毛发粗糙。极少数情况下，会出现神经系统缺陷，包括共济失调、轻瘫和癫痫发作。原位移植的原代异种移植瘤具有高度侵袭性，且发展周期较长。小鼠通常在移植后3至6个月出现肿瘤生长的相关症状。
<ol>
	<li>每天观察接种原位异种移植瘤的小鼠，记录其食物和水的摄入量、行为、理毛情况以及手术切口部位是否有感染迹象。</li>
	<li>若术后观察到疼痛或痛苦症状，给予酮洛芬（5 mg/kg，皮下注射，每日1–2次）。</li>
	<li>术后8–10天拆除自动缝合夹。</li>
	<li>每周称量小鼠体重。</li>
	<li>监测肿瘤移植成功的体征和症状。</li>
</ol>
6. 肿瘤收获
注意：通过此方法，第一冠状切片（#1）包含嗅球的后部和额叶的前部。移植的肿瘤在接下来的3个冠状切片（切片#2、#3和#4）的右半球中最为丰富，注射部位通常位于冠状切片#3内。根据实验需求，组织可用于肿瘤传代、冷冻组织切片、福尔马林固定石蜡包埋组织切片、解离组织的流式细胞术分析、细胞培养，或用于DNA、RNA或蛋白质分析的裂解物制备。部分肿瘤组织可冷冻保存以供将来使用，细胞活力可达80–95%。
<ol>
	<li>通过长时间暴露于二氧化碳随后进行颈椎脱位来处死小鼠。</li>
	<li>使用较大的手术剪在脑底部（枕骨大孔水平）切断已处死小鼠的头部，并从切口处向前牵拉皮肤，充分暴露颅骨。</li>
	<li>取出脑组织。
		<ol>
			<li>将精细手术剪的一侧尖端插入枕骨大孔的外侧，至左侧外耳道水平，沿颅骨左侧切割枕骨；在右侧执行相同的切割操作。</li>
			<li>沿冠状面从一侧外耳道至另一侧外耳道切割枕骨，并移除骨片以暴露小脑。</li>
			<li>在两眼之间切割鼻骨板。</li>
			<li>从鼻骨板沿矢状缝向后剪切至前囟，再从前囟沿矢状缝向前剪切至人字缝，完成矢状缝中线切口。</li>
			<li>小心将精细镊子的尖端沿矢状切口两侧插入，撕裂颅骨与脑组织之间的硬脑膜粘连，然后将两侧颅骨向外剥离，背侧暴露脑组织和嗅球。</li>
			<li>将镊子滑入嗅球腹侧与颅骨之间，松解任何粘连组织。</li>
			<li>向后倾斜颅骨，使脑组织后移，暴露视神经及其他脑神经。切断脑神经，将脑组织释放至含有无菌 PBS 的培养皿中。</li>
		</ol>
	</li>
	<li>用称量勺将脑组织转移至组织切片矩阵装置中，使用剃刀刀片制备厚度为 2 mm 的冠状切片。</li>
	<li>将冠状切片排列于含有无菌 PBS 的培养皿中，以便进一步肉眼检查和后续组织处理。</li>
</ol>
7. 肿瘤冷冻保存
<ol>
	<li>制备冷冻保存液的储存液。
		<ol>
			<li>将50 ml增殖添加剂、5 ml 100倍浓度的青霉素-链霉素溶液和450 µl 0.2%肝素加入450 ml基础培养基中。</li>
			<li>将储存液置于4 °C避光保存。</li>
		</ol>
	</li>
	<li>制备冷冻保存液的工作液。
		<ol>
			<li>在50 ml聚丙烯圆锥形离心管中加入47.5 ml冷冻保存液和2.5 ml无菌DMSO，充分混匀。</li>
			<li>将工作液以每管1.0 ml分装至冻存管中，置于4 °C避光保存。</li>
		</ol>
	</li>
	<li>将一块2 mm冠状切面的异种移植脑组织放入含有冷冻保存液并置于冰上的冻存管中。</li>
	<li>拧紧管盖，将冻存管放入-80 °C冷冻容器中。次日将冻存管转移至液氮罐中长期保存。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

培养的细胞系、异种移植模型以及基因工程小鼠是建立胶质瘤模型最常用的方法，每种模型系统均有其独特的优势与局限性3,13,14。原位胶质瘤原代异种移植模型的相关优势包括能够模拟弥漫性胶质瘤典型的浸润性生长特性，并保留了重要的遗传改变和关键信号通路机制，而这些特征在培养的胶质瘤细胞中极难维持。例如，isocitrate dehydrogenase（异柠檬酸脱氢酶）突变和Sonic hedgehog配体的表达可在原位胶质瘤原代异种移植模型中得以保留15,16，但在培养的胶质瘤细胞中却极为罕见14,17-19。然而，根据实验需求，也需充分考虑原位胶质瘤原代异种移植模型存在的显著缺点。尽管可获得足够的患者来源组织，但在脑内监测胶质瘤随时间的生长情况仍比在异位移植部位更为困难。此外，原位胶质瘤原代异种移植的生长速度明显慢于异位异种移植。因此，研究者可能更倾向于将细胞移植至免疫缺陷小鼠的 flank（皮下侧腹部），该部位亦可保留重要的组织学和分子特征4。
建立原位原代异种移植模型时，有两个重要...

恶性胶质瘤是发生于脑部且偶发于脊髓的中枢神经系统原发性胶质细胞肿瘤。根据世界卫生组织（WHO）的分类标准，胶质瘤依据其组织学上与星形胶质细胞、少突胶质细胞或室管膜细胞的相似性进行分类，并根据恶性病理特征进行数字分级（I至IV级）。最常见的组织学亚型包括星形细胞瘤、少突胶质细胞瘤以及混合性少突星形细胞瘤。WHO II至IV级的恶性胶质瘤具有侵袭性生长的特点，并对现有治疗手段表现出难治性。在美国，每年约有15,750人被诊断为恶性胶质瘤，估计有12,740名患者死于该疾病。这些数据凸显了恶性胶质瘤的高度致死性，以及提高治疗效果的迫切需求。
癌症模型对于研究肿瘤生物学和治疗方法至关重要。人类癌细胞系是进行此类研究的重要第一步 体外 操作和 在体 异种移植研究（继发性异种移植）1然而，标准的癌细胞培养会发生表型和基因型的转变2-4 在继代异种移植中可能无法恢复5此外，诸如异柠檬酸脱氢酶（IDH）突变6，不同的干细胞群体7 以及对关键信号通路的依赖性8 在癌细胞培养过程中可能会丢失。尽管肿瘤球培养能在更大程度上维持基因组特征，但仍无法完全再现原发肿瘤的基因型2,3直接原位移植可消除体外培养对肿瘤生物学特性的影响 体外 培养，提供适当的微环境，并维持肿瘤起始细胞的完整性9,10因此，原代异种移植模型是一种强大且相关的临床前模型，可用于严格测试靶向药物，从而推动未来临床试验的合理设计5,11,12.

<table><tbody><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Life Technologies</td><td>14040-133</td><td></td></tr><tr><td>木瓜蛋白酶解离系统</td><td>Worthington Biochemical Corp.</td><td>LK003150</td><td></td></tr><tr><td>0.4% 台盼蓝溶液</td><td>Life Technologies</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>盐酸氯胺酮</td><td>从机构药房或当地兽医用品公司获得</td><td></td><td></td></tr><tr><td>盐酸赛拉嗪</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>酮洛芬</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;眼科软膏&lt;/p&gt; </td><td></td><td>&lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;聚维酮碘&lt;/p&gt; </td><td>Fisher Scientific</td><td>&lt;p&gt;190061617&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p&gt;&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;冻存培养基和增殖补充剂&lt;/p&gt; </td><td>StemCell Technologies</td><td>&lt;p&gt;05751&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p&gt;&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;PBS 中的 0.2% 肝素钠盐&lt;/p&gt; </td><td>StemCell Technologies</td><td>&lt;p&gt;07980&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p&gt;&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;青霉素-链霉素&lt;/p&gt; </td><td>Life Technologies</td><td>&lt;p&gt;15140-122&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p&gt;&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;二甲基亚砜&lt;/p&gt; </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&lt;p&gt;D6250-5X10ML&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p&gt;&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;NOD.Cg-&lt;em&gt;Prkdc&lt;sup&gt;scid&lt;/sup&gt; I/2rg&lt;sup&gt;tm1Wjl&lt;/sup&gt;&lt;/em&gt;/SzJ 小鼠&lt;/p&gt; </td><td>杰克逊实验室</td><td>&lt;p&gt;005557&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p&gt;NSG小鼠&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;抗人波形蛋白抗体&lt;/p&gt; </td><td>Dako</td><td>&lt;p&gt;M7020&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p&gt;使用 1:200 至 1:800&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;抗人 IDH1 R132H 抗体&lt;/p&gt; </td><td>Dianova</td><td>&lt;p&gt;DIA-H09&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p&gt;使用 1:100 至 1:400&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;带摆动桶转子的离心机&lt;/p&gt; </td><td></td><td>&lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p&gt;&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;带有分配速度控制的移液器&lt;/p&gt; </td><td></td><td>&lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p&gt;&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;一次性血细胞计数板&lt;/p&gt; </td><td>Fisher Scientific</td><td>&lt;p&gt;22-600-100&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p&gt;&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;无菌外科手套&lt;/p&gt; </td><td>Fisher Scientific</td><td>&lt;p&gt;11-388128&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p&gt;&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;一次性防护服&lt;/p&gt; </td><td>Fisher Scientific</td><td>&lt;p&gt;18-567&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p&gt;&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;外科口罩&lt;/p&gt; </td><td>Fisher Scientific</td><td>&lt;p&gt;19-120-1256&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p&gt;&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;结核菌素注射器&lt;/p&gt; </td><td>BD</td><td>&lt;p&gt;305620&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p&gt;&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;酒精棉片&lt;/p&gt; </td><td>Fisher Scientific</td><td>&lt;p&gt;22-246-073&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p&gt;&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;便携式电子天平&lt;/p&gt; </td><td>Fisher Scientific</td><td>&lt;p&gt;01-919-33&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p&gt;&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;体视显微镜&lt;/p&gt; </td><td></td><td>&lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p&gt;&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;手术剪&lt;/p&gt; </td><td>Stoelting</td><td>&lt;p&gt;51465&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p&gt;&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;手术刀柄&lt;/p&gt; </td><td>Fine Science Tools</td><td>&lt;p&gt;10003-12&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p&gt;&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;手术刀片，#10&lt;/p&gt; </td><td></td><td>&lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p&gt;&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;立体定位仪&lt;/p&gt; </td><td>Stoelting</td><td>&lt;p&gt;51730&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p&gt;&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;高速钻机&lt;/p&gt; </td><td>Stoelting</td><td>&lt;p&gt;51449&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p&gt;&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td>钻头，0.6 mm</td><td>Stoelting</td><td>514552</td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Hamilton 注射器&lt;/p&gt; </td><td>Hamilton</td><td>&lt;p&gt;80336&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p&gt;&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Autoclip，9 mm&lt;/p&gt; </td><td>BD</td><td>&lt;p&gt;427630&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p&gt;&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;循环水加热垫&lt;/p&gt; </td><td>Kent Scientific</td><td>&lt;p&gt;TP-700&lt;/p&gt; &lt;p&gt;TP-1215EA&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p&gt;&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;热珠干热灭菌器&lt;/p&gt; </td><td>Kent Scientific</td><td>&lt;p&gt;INS300850&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p&gt;&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;手术剪&lt;/p&gt; </td><td>Fine Science Tools</td><td>&lt;p&gt;14101-14&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p&gt;&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;精细剪刀&lt;/p&gt; </td><td>Fine Science Tools</td><td>&lt;p&gt;14094-11&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p&gt;&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;弹簧剪&lt;/p&gt; </td><td>Fine Science Tools</td><td>&lt;p&gt;15018-10&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p&gt;&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;杜蒙镊&lt;/p&gt; </td><td>Fine Science Tools</td><td>&lt;p&gt;11251-30&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p&gt;&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;半微量刮勺&lt;/p&gt; </td><td>Fisher Scientific</td><td>&lt;p&gt;14374&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p&gt;&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;小鼠脑切片矩阵模具&lt;/p&gt; </td><td>Zivic Instruments</td><td>&lt;p&gt;BSMAS002-1&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p&gt;&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;冷冻保存管&lt;/p&gt; </td><td>Fisher Scientific</td><td>&lt;p&gt;12-567-501&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p&gt;&lt;/p&gt; </td></tr></tbody></table>

原位胶质瘤原代异种移植模型重现浸润性生长及异柠檬酸脱氢酶i突变

Primary Orthotopic Glioma Xenografts Recapitulate Infiltrative Growth and Isocitrate Dehydrogenase I Mutation

恶性胶质瘤是一类具有显著临床和分子特征的高度浸润性胶质肿瘤，构成一组异质性疾病。在临床前动物模型中，原位移植的原发性异种移植物能够重现恶性胶质瘤亚型的组织病理学和分子特征。为了在移植实验中模拟世界卫生组织（WHO）III级和IV级的恶性胶质瘤，需将人源肿瘤细胞异种移植至免疫缺陷小鼠的原位部位——脑部。与使用体外培养肿瘤细胞的继代异种移植物不同，人源胶质瘤细胞直接从切除的标本中分离，并在未经体外培养传代的情况下进行移植，以建立原发性异种移植物。本报告所述方法详细介绍了肿瘤样本制备、颅内移植至免疫缺陷小鼠、移植后肿瘤生长监测，以及后续用于动物传代或分析的肿瘤收获过程。肿瘤细胞制备需时2小时，每只动物的手术操作需时20分钟。

将离散的胶质瘤细胞直接移植到免疫缺陷小鼠的大脑中，以建立原位异种移植的初代细胞系。每份肿瘤标本在移植前均被分配一个随机编号，作为去标识化流程的一部分，以去除受保护的健康信息。我们为此目的使用一个5位数的 REDcap 数据库编号。图1展示了从携带异柠檬酸脱氢酶1（IDH1）突变（精氨酸132突变为组氨酸，R132H）的胶质母细胞瘤（GBM 17182）建立异种移植细胞系的过程及命名规则。移植后，在肿瘤编号后添加字母“X”表示该肿瘤为异种移植来源，随后添加字母“P”以追踪传代次数。P0代表初次移植的受体小鼠，P1代表第一次异种移植传代的受体小鼠。通常，最初移植3至5只小鼠以建立细胞系，随后将异种移植肿瘤传代至10只受体小鼠（P1）中，以扩增细胞系供后续研究使用。
正位移植后，需监测受体小鼠是否出现肿瘤植入和生长的体征与症状。肿瘤植入最敏感的指征是显著且持续的体重下降。由于小鼠在年幼时进行移植，术后预期会出现体重增长。尽管小鼠体重可能在每周之间出现看似剧烈的波动，但持续减轻超过3 g通常提示肿瘤已成功植入。通常情况下，同一批异种移植小鼠群体中大多数个体...

恶性胶质瘤是一类具有显著临床和分子特征的高度侵袭性胶质肿瘤，其构成具有异质性。在临床前动物模型中，原位移植的原代异种移植瘤能够重现恶性胶质瘤亚型的组织病理学和分子特征。

原位胶质瘤原代异种移植模型重现浸润性生长及异柠檬酸脱氢酶I突变

恶性胶质瘤是一类具有不同临床和分子特征的高度浸润性胶质肿瘤，其构成具有异质性。原代原位异种移植可在临床前动物模型中重现恶性胶质瘤亚型的组织病理学和分子特征。为了在移植实验中模拟世界卫生组织（WHO）Ⅲ级和Ⅳ级恶性胶质瘤，需将人源肿瘤细胞移植至免疫缺陷小鼠的原位部位——脑部。与使用体外培养肿瘤细胞的继代异种移植不同，人源胶质瘤细胞直接从切除的标本中分离，并在未经组织培养传代的情况下进行移植，以建立原代异种移植模型。本报告所述实验流程详细介绍了肿瘤样本制备、向免疫缺陷小鼠颅内移植、监测肿瘤移植存活情况，以及收获肿瘤组织用于后续传代或分析的过程。肿瘤细胞制备需2小时，每只动物的手术操作需20分钟。

本实验方案的总体目标是建立原位异种移植的初级胶质瘤模型，以在临床前动物模型中重现恶性胶质瘤亚型的组织病理学和分子特征。该目标首先通过获取人脑肿瘤标本进行直接移植来实现，第二步是从标本中制备单细胞悬液。接下来，将肿瘤细胞移植到免疫缺陷小鼠的脑内。随后观察受体小鼠是否出现肿瘤形成、移植成功及生长的迹象，并在适当时候处死取材，用于后续分析或连续传代移植。最终通过组织学检查、DNA测序及其他分子检测方法，证实肿瘤具有浸润性生长特征，并保留了诸如异柠檬酸脱氢酶（IDH）基因突变等遗传学改变。癌症的临床前动物模型对于研究肿瘤生物学和治疗方法至关重要。与现有的继代胶质瘤异种移植等方法相比，原代胶质瘤异种移植的主要优势在于，胶质瘤细胞在培养过程中会发生基因型和表型的改变，而这些改变在将培养后的胶质瘤细胞移植到小鼠体内时无法恢复。以下为实验操作流程的演示。今天与我一起的是我实验室的成员Gerardo Valez博士。首先，在无菌操作台中根据制造商提供的试剂盒组分和说明，配制Pepane解离溶液。在1号管中加入5毫升Pepane溶液。2号管中加入3毫升洗涤蛋白酶抑制剂溶液，3至6号管各加入5毫升。每份不连续梯度溶液。准备就绪后，将胶质瘤标本放入第一支试管中，并在10至20分钟的时间内用5毫升移液管反复吹打。上下吹打10次后，在室温下孵育2至3分钟，然后开始下一个吹打循环；在进行吹打时，将5毫升移液管的管尖更靠近锥形管底部。每进行一次三循环，需确保移液器尖端在最后两个循环中接触试管底部，且在整个消化过程中避免产生气泡。当几乎无可见的未消化组织残留时，表明消化过程完成。离心后，弃去上清液，并用三毫升洗涤蛋白酶抑制剂溶液将沉淀吹打重悬10次。接下来，将等体积的悬液小心地分层覆盖到各含有不连续梯度溶液的离心管上。使用设置为重力排液速度的移液器，将离心管放入配备摆动桶转子的离心机中。启动前，将加速度设为最低档，并关闭刹车。收集细胞后，弃去上清液，将每个沉淀重悬并混匀于5 mL无菌平衡盐溶液中。继续操作前将细胞置于冰上。取少量细胞悬液，使用台盼蓝排斥法结合血细胞计数板测定活细胞密度。再进行一次离心步骤后，弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于每微升含 25,000 至 125,000 个活细胞的密度。最后，将适量细胞悬液转移至 200 微升微量离心管中，置于冰上。首先确认麻醉动物的镇静深度。麻醉后，使用碘伏和乙醇反复擦拭并清洁手术区域，涂抹眼膏保护眼睛。准备就绪后，在正中线处做一个一厘米长的切口，于解剖显微镜下暴露颅骨。辨认缝合线位置，钻出骨孔，注意保持硬脑膜完整。通过将重悬的细胞加入连接至探针架的Hamilton注射器中，以准备细胞注射。将针头插入钻孔中，使斜面部分刚好位于颅骨表面下方。推进针头3毫米，然后撤出针头。0.5 毫米以留出注射空间。在 30 秒内缓慢按压推杆，然后让针头在脑内再停留额

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科研

JoVE Journal

Medicine

医学

原正畸胶质血异草回顾渗透生长和同源脱氢酶 I 突变

可通过颅内接种在裸鼠体内建立表达荧光素酶的人脑肿瘤异种移植模型，并利用生物发光成像技术对肿瘤生长及治疗反应进行后续监测。结合生存分析，生物发光监测是针对脑肿瘤治疗方案开展临床前研究的重要工具。...

建立颅内脑肿瘤异种移植模型并利用生物发光成像分析肿瘤生长及治疗反应

我们介绍一种集成方法，用于将人多形性胶质母细胞瘤细胞精确、立体定向地植入裸鼠脑内，并进行后续系列 体内...

立体定向颅内植入与 体内 多形性胶质母细胞瘤小鼠模型系统中肿瘤异种移植的生物发光成像

我们建立了小鼠皮层原位胶质母细胞瘤模型，用于活体双光子显微镜观察，该模型可重现肿瘤生长过程中通常存在的生物物理约束条件。通过以慢性玻璃窗替代肿瘤上方的颅骨，可利用双光子显微镜对肿瘤进展进行长期动态追踪。...

一种保留脑实质物理约束并适用于活体双光子显微成像的原位胶质母细胞瘤小鼠模型

表型正常的星形胶质细胞和神经干细胞取自携带floxed条件性致癌等位基因的基因工程小鼠，通过病毒介导的Cre重组进行转化，可用于建立星形细胞瘤发病机制的模型 体外 和 体内...

星形细胞瘤发病机制建模 体外 和 体内 利用条件性基因工程小鼠的皮层星形胶质细胞或神经干细胞

大脑是一个具有独特特性的部位，其特性无法通过 体外 或异位分析。通过使用立体定位固定仪和低压注射泵进行颅内注射，可可靠地建立具有可重复位置和生长特征的原位小鼠模型。...

创建解剖学上精确且可重复的人脑肿瘤颅内异种移植模型

GL261 胶质瘤细胞为胶质母细胞瘤提供了一种有用的免疫活性动物模型。本方案旨在演示利用颅内肿瘤生长监测的正确技术 体内...

胶质母细胞瘤免疫活性动物模型的生物发光成像

以三维培养方式生长的神经球是研究胶质瘤生物学的有力工具。本文介绍了一种在通过石蜡包埋保持胶质瘤神经球三维结构的前提下进行免疫组织化学分析的实验方案。该方法可用于表征胶质瘤神经球的特性，如干性及神经分化能力。...

通过石蜡包埋的三维胶质瘤神经球培养物免疫组织化学评估胶质瘤生物标志物

在此，我们描述了一种用于胶质母细胞瘤（GBM）的临床前原位小鼠模型，该模型通过将来源于基因工程小鼠模型肿瘤的细胞进行颅内注射而建立。该模型呈现出人类GBM疾病的典型特征。在转化研究中，小鼠脑肿瘤可通过影像学手段进行追踪 体内 MRI 与组织病理学...

多形性胶质母细胞瘤的转化性原位模型

携带IDH1突变的弥漫性低级别胶质瘤是一种罕见肿瘤，难以进行培养。我们介绍一种简单的非酶解组织块培养法，可维持IDH1突变蛋白的表达，并使培养物持续存活数月。重要的是，该技术适用于冻存肿瘤组织，为胶质瘤研究提供了宝贵的资源。...

IDH1突变型弥漫性低级别胶质瘤的组织块培养方案

建立原位儿童脑瘤模型需要极为精细的操作，需使用立体定位仪精确植入癌细胞。本文所述方法概述了脑瘤细胞制备、颅内注射操作以及术后监测系统实施的各个步骤，以评估脑瘤的移植情况。...

使用立体定位仪建立脑肿瘤患者来源异种移植原位模型

本实验方案的目的是为研究人员提供一种高度可重复的颅内植入技术。...

小鼠脑内立体定向接种胶质母细胞瘤患者来源异种移植细胞系

了解原发正位胶质瘤异种移植模型的建立方法，用于研究恶性胶质瘤亚型的组织病理学和分子特征。该方法通过将人脑肿瘤标本移植到免疫缺陷小鼠脑内，保留IDH突变等遗传改变，为临床前肿瘤生物学研究和治疗策略开发提供可靠平台。

原位胶质瘤原代异种移植模型重现浸润性生长及异柠檬酸脱氢酶I突变

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