浸润性膀胱移行细胞癌中的完整的人MUC1转基因小鼠免疫诱导免疫治疗发展模型

以下实验的总体目标是在膀胱癌中有效诱导靶向肿瘤相关抗原的细胞毒性 T 淋巴细胞反应。这是通过在表达人肿瘤相关抗原马赫 1 的小鼠中诱导膀胱癌来实现的。接下来，将肽疫苗注射到小鼠体内，并产生一种特异性的细胞毒性 T 淋巴细胞反应。

然后分离血清肿瘤和脾脏，并分别分析组织的细胞因子、抗原和免疫反应。利用蛋白质印迹多重、荧光微珠、免疫测定免疫组织化学和活斑分析，我们可以测试肽疫苗对膀胱癌的疗效。您好，我是 Gregory Wetz 博士，是加利福尼亚州萨克拉门托市加州大学戴维斯分校卫生系统的研究科学家。

与异种移植物等现有方法相比，该技术的主要优点是异种移植物需要免疫功能低下的宿主，而我们的模型利用免疫完整的转基因小鼠，该小鼠表达作为肽疫苗靶标的人类肿瘤相关抗原。与我一起演示这些技术的将是 Daniel V 博士、Chaga 博士和 Audrey Gutierrez 博士，他们都是研究科学家，以及 Michael de Gregorio 博士的实验室和加州大学戴维斯分校卫生系统。在施用第一剂 N 丁基、N 四羟基、丁基亚硝胺或 O-H-B-B-N 诱导膀胱癌之前，对每只小鼠进行下颌下出血以收集全血和凝血管，并等待 30 分钟让血液凝结。

从 8 周开始使用不锈钢 20 号管饲针，每周 5 天口服 O-H-V-B-N，持续 12 周。在第 20 周，使用 600 微升 0.9% 无菌盐水复溶每瓶冻干肽疫苗，并使用盐水通过 0.5 英寸 27 号针头抽取溶液六次，彻底重悬。调整浓度，以便在最后一剂 O-H-B-B-N 后以 100 微升的体积输送所需剂量，并在最后一剂 O-H-B-B-N 后八周使用 25 号针头注射 100 微升疫苗，以 8 周为周期接种疫苗。

通过二氧化碳窒息对所有小鼠实施安乐死后，将每只小鼠放在解剖板上并固定所有四个肢体。接下来，使用镊子和剪刀在上腹部区域做一个水平切口。将剪刀插入表皮层和腹壁之间的切口中，并在镊子的帮助下，轻轻地将皮肤与下面的组织分开。

从水平切口沿着中轴朝向鼠标的前端做一个垂直切口。然后将皮肤与胸腔分开，使用 1 毫升注射器和 22 号针头，穿刺心脏，并使用镊子和剪刀平稳稳定地抽吸血液。在生物安全柜内切开并剥开其余的表皮层。

切开腹壁和腹膜，无菌切开。去除膀胱肿瘤进行免疫组织化学或 IHC 和 Western blot 进行 IHC。将膀胱肿瘤标本放入组织盒中，并在冷藏的甲醛中固定过夜。

在室温下，收集脾脏用于细胞活力分析，并收集谎点以进行多重荧光测定微生物免疫测定。使用 200 μL 检测缓冲液进行预润湿。一个 96 孔过滤器底板，允许过滤器完全浸泡。

然后使用 96 孔板真空仪轻轻排空过滤器，并使用纸巾用多通道移液器将 25 μL 血清基质移液到分配给空白和标准品的孔中，并将 25 μL 检测缓冲液移液到分配给对照和未知物的孔中。接下来，将 25 微升空白标准品、对照品和未知物移液至相应的指定孔中。涡旋微珠混合物 20 秒，然后将微珠转移到储液槽中。

然后将 25 微升珠子混合物移液到每个珠子混合物中。盖上板子避光，在摇床上以 500 RPM 的速度在室温下摇动板子两个小时，排空板并使用 200 微升 PBST 洗涤两次，然后沥干并吸干。要制备检测抗体溶液，请将所需量的 0.1% PBST 和检测抗体混合在 15 ml 试管中，涡旋 10 秒。

然后向每个中移取 25 微升。在室温下以 500 RPM 摇动板 1 小时。然后用 200 微升 0.1% PBST 排空并洗涤板，排空并吸干移液管 25 微升新鲜制备的链球菌、AVID 和 FICO eryn 或 SAPE，将板放在板振荡器上，在室温下以 500 RPM 孵育 30 分钟。

沥干并用 PBST 洗涤两次。要悬浮磁珠，请向每个孔中加入 100 微升 0.1% PBST，并以 500 RPM 振荡至少两分钟。使用 Luminex LX 200 机器读取和分析生物安全柜中的板。

通过 100 微米尼龙组织筛将小鼠脾脏加工成无菌培养皿中的 5 毫升无菌 PBS。将 PLE aytes 分层在 15 毫升无菌管中的 3 毫升淋巴细胞分离培养基上。将试管以 600 GS 离心 15 分钟。

为了将淋巴细胞与红细胞分离，将梯度上方的分层淋巴细胞转移到 1.5 mL 螺旋盖离心管中的新无菌 15 mL 试管中。使用 countin 活力试剂对淋巴细胞进行连续稀释。然后在缪斯上分析。

根据制造商的方案准备板，准备 ally 点板的样品和条件的板图，并将 100 微升培养基肽或加扰肽移液到每个板中。加入 100 微升细胞悬液，并在 37 摄氏度下孵育板过夜。遵循制造商的 ALI 斑点测定方案，并使用解剖显微镜分析显影的 Aly 斑点板。

通过计算每个孔中对应于每种分析物的彩色点的数量来量化结果。这些斑点对应于我们的转基因小鼠模型中用化学致癌物诱导的每个孔中形成斑点的细胞的数量。O-H-B-B-N 导致膀胱癌发病率高，主要是移行细胞癌或 TCC 伴有一些鳞状细胞癌或 SCC，这与人类膀胱癌相似，如图所示。

O-H-B-B-N 诱导膀胱癌后 8 周，马赫一转基因或 TG 和野生型小鼠的膀胱癌发病率为 67%血红蛋白，伊红染色证实了 TCC 和 SCC 的存在，其中 TCC 以 2 比 1 的比例占主导地位。其中，我们观察到一系列低级别和高级别非浸润性到高级别浸润性肿瘤。IHC 显示，所有 Mach 1 膀胱癌标本的 mach one 表达呈阳性。

在模型开发过程中，在第 8 至 28 周之间连续监测血清炎性细胞因子水平。我们观察到，从诱导到研究结束，炎性细胞因子水平随着时间的推移而增加。这种细胞因子模式与我们之前在肺癌模型中观察到的非常相似，这强烈表明炎性细胞因子水平升高可能与肿瘤发展相关。

为了评估第 1 个血清细胞因子对肽疫苗的反应，对 15 只接种疫苗和 14 只接受安慰剂治疗的 mach one TG 小鼠实施安乐死，并在研究结束时采集血液。最后一次疫苗治疗后 24 小时。多重分析显示，疫苗组 TNF 、 α 干扰素、 γ IL 、 2 IL 和 IL 17 的血清细胞因子水平升高。

与安慰剂组相比，疫苗处理小鼠的 TNF α 干扰素 γ 和 IL 17 水平显着升高。这些结果表明 th 1 极化细胞因子对肽疫苗的反应，以评估 TH 1、TH 2 对肽疫苗的免疫反应。通过干扰素 γ IL 评估 SP 细胞 四个 ALI 斑点，这里显示的是用活淋巴细胞接种 ALI 斑点板后分离的淋巴细胞活力评估，该实验的结果明确且特异性地干扰素 γ 对肽的反应，这证实了 TH one 对肽疫苗的免疫反应在其发展后。

这项技术为癌症免疫学领域的研究人员利用晚期膀胱癌的临床前模型探索新的免疫疗法铺平了道路。