Name: 浸润性膀胱移行细胞癌中的完整的人MUC1转基因小鼠免疫诱导免疫治疗发展模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-30T22:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 2 s
Description: 了解在MUC1转基因小鼠中诱导膀胱癌并评估MUC1靶向肽疫苗免疫治疗效果的方法。该模型利用完整免疫系统研究肿瘤相关抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞反应，为膀胱癌免疫治疗开发提供临床前研究平台。

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作者感谢加州大学戴维斯分校小鼠生物学项目为小鼠的繁育工作提供的支持。本研究获得了德国达姆施塔特默克公司（Merck KGaA）资助项目的资助。

所有动物研究和实验均在加州大学戴维斯分校机构动物护理和使用行政咨询委员会批准的协议下进行。
1. MUC1.Tg 小鼠的繁殖与传代
<ol>
	<li>加州大学戴维斯分校小鼠生物学项目（MBP）将野生型 C57BL/6 雄性小鼠与杂合型 MUC1.Tg C57BL/6 雌性小鼠进行交配，以建立我们的繁殖种群。根据研究需要，将 MUC1.Tg 后代小鼠运送至实验场所。</li>
	<li>MBP 工作人员按照既定模式（0-99）对后代小鼠进行脚趾剪切以用于个体识别，并在必要时进行尾部剪切。采集的脚趾或尾部组织将通过标准 DNA 提取方法和聚合酶链式反应（PCR）分析进行基因型鉴定。</li>
</ol>
2. 研究设计
<ol>
	<li>研究组分配
	<ol>
		<li>使用天平分别称量每只小鼠，并以克为单位记录每只小鼠的体重。</li>
		<li>该步骤涉及研究的方法学与实验设计。在研究的第一阶段，选取年龄匹配的 MUC1.Tg 转基因小鼠和野生型小鼠，开始使用 OH-BBN 诱导膀胱癌。在最后一次给予 OH-BBN 剂量后 8 周处死小鼠，通过组织学检查确认膀胱肿瘤的存在。</li>
		<li>在研究的第二部分，将雄性 MUC1.Tg 小鼠随机分为相应数量的治疗组和对照组。在诱导期及肿瘤形成期间监测这些小鼠的血清细胞因子和 T 细胞免疫反应，然后在最后一次 OH-BBN 给药后 8 周研究结束时终止实验。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>膀胱癌诱导
	<ol>
		<li>OH-BBN 是一种致癌物且具有高毒性。操作和储存该化学品时，请阅读并遵循材料安全数据表中的指南。</li>
		<li>根据每项研究和每组小鼠的平均体重及小鼠数量，计算为每只小鼠提供适当剂量（3 mg）所需的给药溶液浓度，给药体积为 100 μl。</li>
		<li>将 OH-BBN 溶于 100% 乙醇中，再用无菌水调节终浓度至 30 mg/ml。终体积中乙醇与水的比例应为 20:80（v/v）。</li>
		<li>使用不锈钢20 G针头经口给予OH-BBN&#160;每日灌胃针操作，每周5天&#160;12周，根据治疗分组在8周龄时开始给药。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>疫苗接种治疗
	<ol>
		<li>将每瓶冻干肽疫苗用600 μl的0.9%无菌生理盐水重悬，并通过0.5&#160;27 G 英寸&#160;6号针头。使用生理盐水调整浓度，使所需剂量在100 μl体积内完成给药。</li>
		<li>从第20周开始，在最后一次给予OH-BBN后，通过皮下注射100 μl（使用25 G针头）每周接种一次疫苗，持续八个周期&#160;针（周数对应小鼠的年龄）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>监测与样本采集
	<ol>
		<li>每周称量所有小鼠体重，并触诊是否有新发肿瘤。若小鼠体重减轻≥20%，或出现可触及的肿瘤、血尿和/或尿潴留，应实施安乐死。</li>
		<li>首次给予OH-BBN之前，以及之后每4次&#160;此后每隔一周，通过下颌下采血法采集全血。将血液收集至血清凝固管（BD Microtainer）中，静置30分钟使血液凝固。</li>
		<li>在微量离心机中以 3,500 x g 离心血液样本 10 分钟。使用移液器小心将血清转移至带螺口盖的冻存管中。</li>
		<li>液氮中速冻，随后于 -80 °C 保存，待进行多重分析。</li>
		<li>最后一次注射OH-BBN八周后，通过CO处死所有小鼠2 窒息</li>
		<li>将每只小鼠置于解剖板上，并用针固定四肢。</li>
		<li>使用镊子和剪刀，在上腹部区域做一横向切口。将剪刀插入表皮层与腹壁之间的切口，借助镊子轻轻分离皮肤与下方组织。</li>
		<li>从横向切口沿中轴线向小鼠前端做垂直切口。将皮肤与肋骨分离，并使用一把1&#160;毫升注射器和22 G&#160;针头穿刺心脏，平稳匀速地抽取血液。</li>
		<li>参照步骤 2.4.3 和 2.4.4 进行血清分离与保存。</li>
		<li>使用镊子和剪刀，剪开并剥离剩余的表皮层。切开腹壁和腹膜，无菌条件下取出膀胱肿瘤用于免疫组织化学（IHC）和蛋白质印迹实验。</li>
		<li>采集脾脏用于细胞活力分析（Muse）和ELISpot。对于免疫组化（IHC），将膀胱肿瘤标本置于组织包埋盒中，用预冷的甲醛在室温下固定过夜。</li>
		<li>次日，将甲醛替换为70%乙醇。</li>
		<li>用于肿瘤的蛋白质印迹分析时，将肿瘤组织匀浆，加入蛋白提取缓冲液及Halt蛋白酶抑制剂，转移至1.5 mL离心管中&#160;毫升微量离心管</li>
		<li>涡旋30-60秒，冰上放置5分钟。液氮中速冻，然后在常温水中解冻。重复涡旋、冷冻和解冻过程两次。</li>
		<li>在 4 °C 条件下以 10,000 x g 离心 10 分钟，然后将细胞提取物转移至新的标记管中。</li>
		<li>通过二辛可宁酸蛋白测定法（BCA法）测定蛋白浓度。样品于-80 °C保存，直至进行Western印迹分析。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 分子生物学/蛋白质印迹
以下实验步骤采用标准Western Blot方法检测小鼠膀胱肿瘤组织中MUC1的表达情况（数据未显示）。
<ol>
	<li>采用 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离蛋白质提取物，然后使用半干转装置将蛋白质转移至 PVDF 膜上。</li>
	<li>在室温下，将转有蛋白质的膜置于含 5% 脱脂奶粉的磷酸盐缓冲液（含 0.1% Tween-20，pH 7.4，简称 PBS-T）中，于摇床上封闭 1 小时。</li>
	<li>将膜在摇床上与抗 MUC1 或抗 β-actin 抗体于 0.1% PBS-T 中室温孵育 1 小时。</li>
	<li>倾去溶液，加入 0.1% PBS-T 洗涤膜，在摇床上轻轻振荡 5 分钟后倾去；重复此步骤两次。</li>
	<li>将膜与辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗在室温下孵育 1 小时。</li>
	<li>洗涤 3 次（参见步骤 3.4）。</li>
	<li>按照增强化学发光（ECL）试剂盒的说明书操作，激活并读取荧光图像。</li>
</ol>
4. 多重荧光微球免疫测定
<ol>
	<li>设置与计算
	<ol>
		<li>使用96孔板图谱，为各孔分配空白孔、标准品、对照品和待测样本。计算检测所需的分析物、捕获抗体和链霉亲和素-藻红蛋白（SA-PE）的数量及体积。</li>
		<li>使所有缓冲液和稀释液恢复至室温。使用空白96孔板配制标准品和样本的稀释液。</li>
		<li>根据生产商说明书，重悬血清基质和冻干标准品，并在96孔板中用适当的稀释液对标准品进行1:5倍比稀释。对于空白孔，使用相应的稀释液。</li>
		<li>在96孔板其余孔中，用适当的稀释液将所有对照品和未知样本按1:2比例稀释。</li>
		<li>对于微球混合液，将所需体积的适当稀释液移入15&#160;ml离心管中。将每种微球管涡旋振荡20秒，然后将每种分析物所需体积加入该15&#160;ml离心管中。</li>
		<li>始终避免微球暴露于光线下，以防光漂白。切勿将96孔板置于吸水材料上，以免因毛细作用导致样本损失。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>检测流程
	<ol>
		<li>用200 μl检测缓冲液预润湿96孔滤板底部，确保滤膜完全浸透。使用96孔板真空装置轻轻抽滤，并用纸巾吸干板底液体。</li>
		<li>使用多通道移液器，向分配给空白孔和标准品的孔中加入25 μl血清基质，向分配给对照品和未知样本的孔中加入25 μl检测缓冲液。</li>
		<li>向各自指定的孔中加入25 μl空白液、标准品、对照品和未知样本。将微球混合液涡旋振荡20秒，转移至储液槽中。</li>
		<li>向每孔加入25 μl微球混合液。用铝箔或不透光板盖覆盖板子，避免光照。</li>
		<li>在平板振荡器上以500 rpm于室温震荡2小时。用200 μl含0.1% Tween 20的磷酸盐缓冲盐水（PBS-T）洗涤两次，每次均抽干并用纸巾吸干。</li>
		<li>配制捕获抗体溶液。将所需量的0.1% PBS-T和捕获抗体加入15&#160;ml离心管中，涡旋振荡10秒。将捕获抗体混合液转移至储液槽，并向每孔加入25 μl。</li>
		<li>在平板振荡器上以500 rpm于室温震荡1小时。用200 μl 0.1% PBS-T洗涤两次，每次均抽干并吸干。</li>
		<li>配制SA-PE溶液。将所需体积的0.1% PBS-T和SA-PE加入15&#160;ml离心管中，涡旋振荡10秒。将溶液转移至储液槽，并向每孔加入25 μl。</li>
		<li>在平板振荡器上以500 rpm于室温震荡30分钟。用200 μl 0.1% PBS-T洗涤两次，每次均抽干并吸干。</li>
		<li>加入100 μl 0.1% PBS-T，在平板振荡器上以500 rpm震荡至少2分钟，以充分重悬微球。在Luminex Lx200仪器上读板并进行数据分析。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 干扰素-γ/白细胞介素-4 ELISpot 制备与分析
<ol>
	<li>在生物安全柜中，将脾脏通过100 μm尼龙滤网研磨，收集至无菌培养皿中的5 ml无菌磷酸盐缓冲液（PBS）中。将获得的脾细胞悬液小心叠加于无菌15 ml离心管内3 ml淋巴细胞分离液上层。</li>
	<li>以600 x g离心15分钟，分离淋巴细胞与红细胞。吸取梯度上层的淋巴细胞层，转移至新的无菌15 ml离心管中。</li>
	<li>用无菌PBS调整体积至10 ml。以600 x g离心10分钟，沉淀细胞。</li>
	<li>吸弃上清液，将细胞重悬于1 ml PBS中，使用Muse分析仪进行细胞活率与计数检测。按照Muse Count &amp;#38; Viability Kit试剂盒说明书操作。</li>
	<li>在1.5&#160;ml螺口离心管中，用Count &amp;#38; Viability染料对淋巴细胞进行系列稀释，稀释比例分别为1:10、1:20和1:40（或根据需要设定），总体积不少于300 μl。每种稀释液吹打混匀数次后，上机Muse分析仪检测。</li>
	<li>根据ELISpot板的样本与实验条件设计板图。按照试剂盒说明书准备ELISpot板，并向各孔加入100 μl培养基、肽段（10 μg/ml）或乱序肽段（10 μg/ml）。</li>
	<li>向每孔加入100 μl细胞悬液，使每孔细胞数为1.0 x 106个，37 °C孵育过夜。</li>
	<li>按照ELISpot试剂盒说明书完成后续实验步骤。使用解剖显微镜观察显色后的ELISpot板。</li>
	<li>通过计数每孔中对应各分析物的显色斑点数量进行结果量化。斑点数量代表每孔中斑点形成细胞（SFC）的数量。</li>
</ol>
6. 免疫组织化学（IHC）与苏木精染色 &amp;#38; 伊红（H&amp;#38;E) 染色
<ol>
	<li>取按照上述方法（第2.4.11节）保存的膀胱肿瘤组织，包埋于石蜡中，并以4 μm厚度连续切片，用于免疫组织化学分析。</li>
	<li>使用识别MUC1串联重复区域的MUC1抗体进行免疫组化（IHC）检测。采用动物研究试剂盒（peroxidase）以减少二抗（小鼠来源）与组织中内源性免疫球蛋白的非特异性反应。</li>
	<li>按照标准操作流程进行苏木精和伊红（H&E）染色。</li>
</ol>
7. 统计学方法
对于多重荧光微球免疫分析，采用双尾Student t检验比较治疗组与对照组之间血清细胞因子浓度的平均值。对于ELISpot实验，采用单因素方差分析（one-way ANOVA）比较培养基对照组、随机肽组和肽段处理组之间的斑点形成细胞集落。使用Dunnett多重比较检验以降低假阳性结果的可能性。所有分析中，p值≤0.05被认为具有显著性差异。

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</ol>

DPV、GTW、SMG、CJK、AMG 和 GKH 宣称不存在利益冲突。MWD 是来自默克股份公司（Merck KGaA）资助项目的首席研究员，MW 为默克股份公司（Merck KGaA）的员工。

在人源MUC1转基因小鼠中成功诱导出浸润性移行细胞和鳞状细胞膀胱癌，为免疫治疗的开发提供了一种临床前模型。免疫治疗研究需要采用自发性、免疫系统完整的模型，以便评估随着时间推移肿瘤进展所引发的炎症反应以及对免疫治疗所产生的免疫应答。在自发性肿瘤发展模型中，肿瘤微环境保持完整，肿瘤生长速率更具代表性，从而能够评估治疗的抗肿瘤效果。此外，可通过生物标志物对免疫系统进行测量和监测，进而评价治疗的有效性。
文献中描述的用于测试免疫疗法的其他荷瘤小鼠模型包括异种移植模型和移植模型。尽管这些模型使用方便，并已在癌症研究中被广泛采用，但在开展免疫治疗研究时仍需考虑一些重要局限性。异种移植和移植肿瘤均非自发形成，且其增殖所处的微环境不能代表肿瘤原始来源组织的真实情况。此外，异种移植和移植肿瘤的生长速度较自发性肿瘤更快，限制了对治疗免疫效应的研究时间。最重要的是，这些模型需要免疫系统受损的宿主。
除了我们的模型外，还有多种其他化学诱导的膀胱癌模型。例如，N-[4-(5-硝基-2-呋喃基)-2-噻唑基]甲酰胺（FANFT）和N-甲基-N-亚硝基脲（...

膀胱癌是第四大常见癌症，也是美国男性癌症死亡的第八位主要原因。在美国，预计2013年男性和女性中膀胱癌新发病例总数约为72,500例，死亡病例约为15,000例1。膀胱癌的发病率在男性中约为女性的三倍。在美国，移行细胞癌（TCC）占所有病例的90%以上，而鳞状细胞癌（SCC）的发病率低于2%2。乳头状TCC的总体5年相对生存率为91.5%，而SCC仅为30.9%2。尽管在诊断时非浸润性乳头状TCC约占病例的75%，但即使经过治疗，仍有超过50%的患者在5年内出现复发，其中高达30%的患者会进展为肌层浸润性膀胱癌3,4。非肌层浸润性膀胱癌的典型治疗方案包括经尿道膀胱肿瘤切除术（TUR），随后进行膀胱内化疗。对于高级别Ta或T1期肿瘤患者，可在化疗前再次行TUR3,4。对于低级别Ta期复发或高级别Ta或T1期病变患者，可采用TUR联合辅助化疗或免疫治疗，后者通常使用卡介苗（Bacillus Calmette-Guerin, BCG）3,4。研究表明，与膀胱内使用丝裂霉素C相比，膀胱内灌注BCG在延缓复发时间方面更具优势5。对于T2期肌层浸润性膀胱癌，推荐治疗方案为根治性膀胱切除术，可选择性联合新辅助化疗3。在SCC患者中，根治性膀胱切除术似乎是目前最有效的治疗方法6。鉴于现有最佳治疗手段下复发率仍然极高，显然迫切需要开发更有效的新疗法来应对膀胱癌。
拓展膀胱癌的新型免疫疗法是一种可能有助于延长无病生存期的策略。历史上，卡介苗（BCG）一直是膀胱癌唯一有效的免疫疗法。其作用机制被认为通过提高白细胞介素-2（IL-2）和γ-干扰素（IFN-γ）水平，非特异性地诱导T辅助细胞1型（Th1）免疫反应4。在癌症免疫治疗中，细胞免疫（即Th1免疫）至关重要，因为体液免疫（即Th2免疫）从未被证明对实体瘤有效，仅针对生长因子受体的抗体例外7。为了在BCG单药治疗的基础上进一步提升疗效，曾开展了一项II期临床试验评估IFN-α 2B与BCG联合免疫治疗，但结果尚不明确8。膀胱癌免疫治疗的另一种替代策略可能是靶向肿瘤相关抗原（TAAs），这类抗原的发现使癌症免疫治疗更具特异性7。
一种这样的肿瘤相关抗原是黏蛋白1（MUC1），它是一种在多种上皮细胞癌中过度表达的细胞表面糖蛋白，例如膀胱癌、乳腺癌、肺癌和胰腺癌9,10。在癌变过程中，MUC1的表达和修饰也发生了显著改变，导致糖基化不足，从而暴露出肽链核心中称为串联重复序列可变数目（VNTR）的抗原性氨基酸序列。尽管MUC1是一种自身分子，但由于正常情况下其VNTR优势表位区域被广泛的糖基化所遮蔽，这些区域通常不会暴露；因此，免疫系统将其识别为外来物质11,12。特异性识别MUC1表位的细胞毒性T淋巴细胞（CTL）已从乳腺癌患者的肿瘤引流淋巴结13以及多发性骨髓瘤患者的血液和骨髓中分离得到14,15，这使得MUC1成为细胞免疫应答的潜在靶点。CTL可识别低糖基化形式MUC1中的免疫优势VNTR区域，从而导致肿瘤细胞的破坏16-19。然而，机体对癌变MUC1的天然细胞和/或体液免疫应答通常不足以清除肿瘤。为了增强针对MUC1已存在的微弱免疫反应，可通过疫苗接种引入合成的免疫优势肽段，以诱导足够强的CTL反应，从而产生临床获益18,20。已有研究表明，MUC1脂质体疫苗可提高肺癌患者的生存率21,22，诱导能够杀伤MUC1阳性肿瘤细胞的CTL，并引发Th1极化的细胞因子反应23,24。由于膀胱癌中MUC1表达水平较高9,11,25，因此是测试靶向MUC1免疫治疗的合理候选对象26,27。此外，MUC1在膀胱癌中具有作为预后因子的潜力28，其在移行细胞癌（TCC）中的表达与肿瘤分期和分级显著相关，且已发现转移性TCC仍持续表达MUC129。
为了评估靶向MUC1的免疫疗法在膀胱癌中的潜在应用价值，我们建立了一种免疫系统完整的、在C57BL/6近交系背景上携带人源MUC1（hMUC1）表达的转基因（MUC1.Tg）膀胱癌小鼠模型30。人源MUC1在其自身启动子的调控下作为自身蛋白表达，其组织表达模式与人类中观察到的情况一致30,31。通过给予已知的膀胱致癌物N-丁基-N-(4-羟丁基)亚硝胺（OH-BBN）32诱导小鼠成瘤，随后对所形成的肿瘤进行hMUC1表达情况以及肿瘤类型和分级的评估。为评估致癌物在肿瘤发生过程中对Th1/Th2细胞因子水平的影响，定期采集血清样本进行多重分析。随后，对小鼠给予靶向MUC1的多肽疫苗治疗，并通过多重荧光微球免疫分析法和ELISpot检测血清细胞因子水平及免疫应答反应。

<table><tbody><tr><td>&lt;强&gt;试剂&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-丁基-N-(4-羟基丁基)-亚硝胺（OH-BBN）</td><td>TCI America</td><td>B0938</td><td></td></tr><tr><td>20 G 穿刺针</td><td>Popper & Sons, Inc.</td><td>7921</td><td>不锈钢</td></tr><tr><td>肽疫苗</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>研究性药物</td></tr><tr><td>BD 微量采血管</td><td>BD</td><td>365957</td><td></td></tr><tr><td>组织包埋盒</td><td>Simport</td><td>M490-12</td><td></td></tr><tr><td>10% 中性缓冲福尔马林</td><td>Fisher Scientific</td><td>SF100-4</td><td></td></tr><tr><td>裂解缓冲液</td><td>皮尔斯</td><td>87787</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂 &amp;磷酸酶抑制剂混合物</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>78444</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA 蛋白检测试剂盒</td><td>Pierce</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>小鼠细胞因子20重检测试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td>LMC006</td><td></td></tr><tr><td>磁性微球珠</td><td>Luminex</td><td>MC100xx-01</td><td>xx 是珠子区域</td></tr><tr><td>抗小鼠 TNF- 捕获抗体</td><td>BD Pharmingen</td><td>551225</td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠 TNF- 检测抗体</td><td>BD Pharmingen</td><td>554415</td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠IFN-捕获抗体</td><td>Abcam</td><td>ab10742</td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠IFN-γ检测抗体</td><td>Abcam</td><td>ab83136</td><td></td></tr><tr><td>PBS，pH 7.4</td><td>Sigma</td><td>P3813-10PAK</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fisher</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>测定缓冲液</td><td>Millipore</td><td>L-MAB</td><td></td></tr><tr><td>细胞因子标准品</td><td>默克密理博</td><td>MXM8070</td><td></td></tr><tr><td>多屏高通量筛选96孔滤板</td><td>Millipore</td><td>MSBVN1210</td><td></td></tr><tr><td>SA-PE</td><td>Invitrogen</td><td>SA10044</td><td></td></tr><tr><td>100 微米尼龙组织筛</td><td>BD</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>脾细胞分离培养基</td><td>Lonza</td><td>17-829E</td><td></td></tr><tr><td>TNF- /IL-4 ELISpot 板</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>ELD5217</td><td></td></tr><tr><td>兔抗MUC1单克隆抗体</td><td>Epitomics</td><td>2900-1</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗肌动蛋白单克隆抗体</td><td>Sigma</td><td>A1978</td><td></td></tr><tr><td>抗兔 HRP 抗体</td><td>Promega</td><td>W401B</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗小鼠 HRP 抗体</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>SC-2005</td><td></td></tr><tr><td>PVDF膜</td><td>伯乐（BioRad）</td><td>162-0174</td><td></td></tr><tr><td>Mini Protean TGX 预制胶</td><td>伯乐（BioRad）</td><td>456-1083</td><td></td></tr><tr><td>Muse计数 &amp;与活力检测试剂盒</td><td>Millipore</td><td>MCH100104</td><td></td></tr><tr><td>MUC1 抗体</td><td>BD Pharmingen</td><td>550486</td><td>IHC 抗体</td></tr><tr><td>动物研究过氧化物酶试剂盒</td><td>Dako</td><td>K3954</td><td>免疫组化染色</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;仪器与软件&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>密理博板真空装置</td><td>Millipore</td><td>MSVMHTS00</td><td></td></tr><tr><td>Luminex Lx200</td><td>Millipore / Luminex</td><td>40-013</td><td>由Luminex制造，Millipore经销</td></tr><tr><td>Luminex Xponent 软件</td><td>Millipore / Luminex</td><td>N/A</td><td>版本 3.1；随 Luminex Lx200 提供</td></tr><tr><td>Milliple Analyst 软件</td><td>Milliplex / VigeneTech</td><td>40-086</td><td>版本 5.1</td></tr><tr><td>Muse细胞分析仪</td><td>Millipore</td><td>0500-3115</td><td></td></tr><tr><td>Muse Software</td><td>默克密理博</td><td>N/A</td><td>版本 1.1.0.0；包含在 Analyzer 中</td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>Unitron</td><td>Z730</td><td></td></tr><tr><td>Graphpad Prism 软件</td><td>Graphpad Software Inc.</td><td>N/A</td><td>版本 5.1</td></tr><tr><td>Mini Protean Tetra Cell 凝胶装置</td><td>伯乐（BioRad）</td><td>165-8001</td><td></td></tr><tr><td>Trans Blot SD 转膜槽和 PowerPac 电源</td><td>BioRad</td><td>170-3849</td><td></td></tr></tbody></table>

在免疫系统完整的人源muc1转基因小鼠中诱导侵袭性移行细胞膀胱癌：一种用于免疫治疗开发的模型

Induction of Invasive Transitional Cell Bladder Carcinoma in Immune Intact Human MUC1 Transgenic Mice:  A Model for Immunotherapy Development

为评估免疫治疗和/或细胞毒化疗的效果，建立了人黏蛋白1（MUC1）转基因（MUC1.Tg）小鼠的侵袭性膀胱癌临床前模型。为诱导膀胱癌，对C57BL/6小鼠（MUC1.Tg和野生型）以3.0 mg/天、每周5天的剂量经口给予致癌物N-丁基-N-(4-羟丁基)亚硝胺（OH-BBN），持续12周。为评估OH-BBN在肿瘤发展过程中对血清细胞因子谱的影响，分别在处理前及之后每四周通过下颌下静脉采血收集全血。此外，每周对各组小鼠给予MUC1靶向肽疫苗或安慰剂，持续八周。在肿瘤发展期间及疫苗接种后，采用多重荧光微球免疫分析法检测血清细胞因子水平。实验终点时，进行干扰素γ（IFN-γ）/白细胞介素-4（IL-4）ELISpot分析以评估MUC1特异性T细胞免疫应答，并对肿瘤类型和分级进行组织病理学评价。结果显示：（1）MUC1.Tg小鼠和野生型小鼠中膀胱癌的发生率均为67%；（2）移行细胞癌（TCC）与鳞状细胞癌（SCC）的发生比例为2:1；（3）炎症性细胞因子水平随肿瘤发展时间逐渐升高；（4）给予肽疫苗可诱导Th1极化的血清细胞因子谱并引发MUC1特异性T细胞应答。所有MUC1.Tg小鼠的肿瘤均呈MUC1表达阳性，且MUC1.Tg小鼠和野生型小鼠中半数肿瘤具有侵袭性。综上所述，通过药理学家、免疫学家、病理学家和分子生物学家的协作，我们成功构建了一种免疫系统完整的表达hMUC1的转基因膀胱癌小鼠模型。

在膀胱癌中，对新型免疫疗法及其联合方案进行临床前评估需要建立合适的动物模型。在我们的转基因小鼠模型中，使用化学致癌物OH-BBN诱导后，小鼠出现膀胱癌的比例较高，且以移行细胞癌（TCC）为主，部分为鳞状细胞癌（SCC），这与人类膀胱癌的病理特征相似。为确定肿瘤组织学类型、MUC1表达状态以及对肽疫苗治疗的免疫反应，在OH-BBN诱导8周后（第28周），处死21只MUC1.Tg小鼠和18只野生型小鼠，采集血液、膀胱和脾脏组织（图1）。MUC1.Tg小鼠（14/21）和野生型小鼠（12/18）的膀胱癌发生率均为67%。苏木精-伊红（H&amp;E）染色证实存在TCC和SCC，其中TCC占主导，比例约为2:1。在这些肿瘤中，我们观察到从低级别到高级别的非浸润性肿瘤，以及高级别的浸润性肿瘤。所有MUC1.Tg小鼠的膀胱癌标本经免疫组化（IHC）检测均显示MUC1表达阳性（图2）。需要注意的是，用于MUC1免疫组化检测的抗体可同时识别正常和癌变的人源MUC1蛋白。
在模型构建过程中，我们对第8至28周间的血清炎症性细胞因子水...

为了测试靶向MUC1的免疫疗法，在人黏蛋白1（MUC1）转基因小鼠中建立了由N-丁基-N-(4-羟丁基)亚硝胺诱导的膀胱癌模型。给予MUC1靶向多肽疫苗后，通过检测血清细胞因子水平和T细胞特异性活性，证实了针对MUC1的细胞毒性T淋巴细胞反应。

在免疫系统完整的人源MUC1转基因小鼠中诱导侵袭性移行细胞膀胱癌：一种用于免疫治疗开发的模型

一种侵袭性膀胱癌的临床前模型在人黏蛋白1（MUC1）转基因（MUC1.Tg）小鼠中建立，用于评估免疫治疗……

以下实验的总体目标是有效诱导针对膀胱癌相关肿瘤抗原的细胞毒性T淋巴细胞反应。该目标通过在表达人源肿瘤相关抗原mach one的小鼠中诱导膀胱癌来实现。随后，将一种多肽疫苗注射入小鼠体内，从而引发针对mach one特异性的细胞毒性T淋巴细胞反应。然后分离血清、肿瘤和脾脏，并分别对这些组织进行细胞因子、抗原及免疫应答的分析。通过使用蛋白质印迹多重检测、荧光微球法、免疫分析、免疫组织化学以及活细胞斑点分析，我们可以评估肽疫苗对抗膀胱癌的效果。您好，我是格雷戈里·韦茨（Dr. Gregory Wetz），加州大学戴维斯医疗系统位于加利福尼亚州萨克拉门托的研究科学家。与现有方法（如异种移植）相比，该技术的主要优势在于，异种移植需要使用免疫缺陷的宿主，而我们的模型采用的是具有完整免疫系统的转基因小鼠，该小鼠表达一种与人类肿瘤相关的抗原，正是肽疫苗所针对的目标。接下来将由我与Daniel V以及Chaga博士、Audrey Gutierrez博士共同演示这些技术操作，他们均为研究科学家，工作于Michael de Gregorio博士的实验室及加州大学戴维斯分校健康系统。在给予第一剂N-丁基-N-4-羟基丁基亚硝胺（O-H-B-B-N）以诱导膀胱癌之前，需对每只小鼠进行下颌下静脉采血，采集全血并置于血液凝固管中，静置30分钟使血液充分凝固。从第八周开始，使用不锈钢20号灌胃针，每周口服给予O-H-V-B-N五次，持续12周。第20周时，用600 µL的0.9%无菌生理盐水溶解每瓶冻干肽疫苗，并使用生理盐水通过27号、0.5英寸针头反复抽吸六次，充分重悬。调整浓度，使所需剂量在最后一次给予O-H-B-B-N后以100 µL体积给药，并在最后一次O-H-B-B-N给药八周后，使用25号针头每周注射100 µL疫苗，持续八个星期为一个周期。通过二氧化碳窒息法处死所有小鼠后，将每只小鼠置于解剖板上，并用针固定四肢。接着，使用镊子和剪刀在腹部上区做一横向切口。将剪刀插入表皮层与腹壁之间的切口，借助镊子轻轻将皮肤与下方组织分离。从水平切口处沿中轴线向小鼠前端做一垂直切口。随后将皮肤与肋骨分离，使用1 mL注射器和22号针头穿刺心脏，用镊子和剪刀平稳、均匀地抽取血液。在生物安全柜内剪开并掀开其余表皮层。无菌条件下切开腹壁和腹膜。取出膀胱肿瘤用于免疫组织化学（IHC）或IHC以及Western blot检测。将膀胱肿瘤标本放入组织包埋盒中，并在冰冻福尔马林中固定过夜。在室温下，采集脾脏用于细胞活力分析，并采集血液样本以进行多重荧光微球免疫测定。使用 200 µL 分析缓冲液预润湿 96 孔滤板底部的滤膜，确保滤膜完全浸透。然后使用96孔板真空装置轻轻抽滤，除去滤液，并用纸巾吸干板底部的液体。使用多通道移液器向指定用于空白孔和标准品孔的孔中加入25 µL血清基质，向指定用于对照品和待测样品孔的孔中加入25 µL检测缓冲液。接下来，向各自指定的孔中加入25 µL空白标准品、对照品及待测样品。将磁珠混合物涡旋振荡20秒，然后转移至储液槽中。然后将25微升珠子混合液加入每个孔中。用盖板膜覆盖，避免光照，于室温下以500转/分钟在摇床上振荡孵育2小时。弃去孔内液体，每孔加入200微升PBST洗涤液，洗涤两次，每次洗涤后弃去液体并拍干。为配制检测抗体溶液，取适量0.1% PBST缓冲液与检测抗体加入15毫升离心管中，涡旋混匀10秒。然后每孔加入25 µL。在室温下以500 ×g振荡培养板一小时。随后弃去液体，每孔加入200 µL的0.1% PBST洗涤两次，每次均弃去洗液并吸干。每孔加入25 µL新配制的链霉亲和素-藻红蛋白（SAPE）或链霉亲和素-异硫氰酸荧光素（FICO eryn），将培养板置于振荡器上，在室温下以500 ×g孵育30分钟。用PBST洗涤两次，弃去液体。为重悬磁珠，向每孔加入100 µL 0.1% PBST，于500 RPM振荡至少2分钟。在生物安全柜中使用Luminex LX 200仪器读取并分析该板。将小鼠脾脏通过100微米尼龙组织筛网，处理至无菌培养皿中的5毫升无菌PBS中。将脾细胞悬液小心叠加于无菌15毫升离心管内3毫升淋巴细胞分离液上。以600 ×g离心15分钟。为了将淋巴细胞与红细胞分离，将梯度上方分层的淋巴细胞转移至新的无菌15毫升离心管中，使用1.5毫升带螺口盖的离心管。使用计数和活力试剂对淋巴细胞进行系列稀释，然后在Muse仪器上进行分析。根据制造商的说明书准备共培养板的样品和条件布局图，向每孔中加入100 µL的中等肽或乱序肽。再向每孔加入100 µL细胞悬液，并在37°C下孵育过夜。按照制造商提供的ALI斑点检测说明书进行操作，并使用解剖显微镜分析已发育的Aly斑点板。通过计数每孔中对应于各分析物的着色斑点数量来量化结果。在本研究的转基因小鼠模型中，这些斑点对应于每孔中斑点形成细胞的数量，该模型通过化学致癌物诱导。O-H-B-B-N 导致膀胱癌发生率较高，主要为移行细胞癌（TCC），部分为鳞状细胞癌（SCC），这与人类膀胱癌相似，如本图所示。O-H-B-B-N诱导8周后，mach one转基因（TG）小鼠和野生型小鼠的膀胱癌发生率均为67%。苏木精-伊红染色证实存在移行细胞癌（TCC）和鳞状细胞癌（SCC），其中TCC占主导地位，比例为2:1。在这些肿瘤中，我们观察到从低级别、非侵袭性到高级别、侵袭性肿瘤的多种类型。所有mach one膀胱癌标本经免疫组化（IHC）检测均显示mach one表达呈阳性。在模型构建过程中，我们对第8周至第28周之间的血清炎症性细胞因子水平进行了连续监测。我们观察到，从造模开始直至研究结束，炎症性细胞因子水平随时间推移逐渐升高。该细胞因子变化模式与我们先前在肺癌模型中观察到的结果非常相似，强烈提示炎症性细胞因子水平的升高可能与肿瘤的发生发展相关。为评估肽疫苗对血清细胞因子反应的影响，研究结束时处死15只接种疫苗和14只给予安慰剂的雄性TG小鼠，并在末次疫苗接种后24小时采集血液。多重分析显示，疫苗组小鼠血清中TNF-α、干扰素-γ、IL-2、IL-12和IL-17的水平升高。与安慰剂组相比，接受疫苗治疗的小鼠体内TNF-α、干扰素-γ和IL-17水平显著升高。这些结果提示该多肽疫苗可诱导Th1型极化的细胞因子反应。为评估该多肽疫苗引发的Th1/Th2免疫反应，通过干扰素-γ和IL-4 ELISpot法对脾细胞进行了检测。图中显示的是将活性淋巴细胞接种至ELISpot板后，对分离的淋巴细胞活力进行的评估结果。本实验结果明确且特异性地显示出淋巴细胞对多肽产生干扰素-γ反应，证实了该多肽疫苗可诱导Th1型免疫反应。该技术为癌症免疫学领域的研究人员探索利用晚期膀胱癌的临床前模型开发新型免疫治疗药物铺平了道路。

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浸润性膀胱移行细胞癌中的完整的人MUC1转基因小鼠免疫诱导免疫治疗发展模型

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关键词：正位肿瘤模型，膀胱肿瘤，小鼠模型，膀胱内灌注，癌细胞植入

将肿瘤细胞植入其起源器官可作为评估新型疗法的一种有效临床前模型。MB49...

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磁共振成像评估致癌物诱导的小鼠膀胱肿瘤

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源自患者的膀胱上皮细胞癌和结直肠癌原位异种移植模型用于肿瘤生长及自发性转移研究

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小鼠膀胱肿瘤类器官的培养、操作及原位移植

了解在MUC1转基因小鼠中诱导膀胱癌并评估MUC1靶向肽疫苗免疫治疗效果的方法。该模型利用完整免疫系统研究肿瘤相关抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞反应，为膀胱癌免疫治疗开发提供临床前研究平台。

在免疫系统完整的人源MUC1转基因小鼠中诱导侵袭性移行细胞膀胱癌：一种用于免疫治疗开发的模型

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