Name: 从天然蛋白质体外快速生成淀粉样蛋白 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-05T16:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 48 s
Description: 学习利用MES缓冲液和高温孵育或EDC交联技术，在体外快速将天然蛋白质转化为淀粉样蛋白纤维的方法。该技术有助于研究蛋白质错误折叠疾病的发病机制及淀粉样蛋白的生物学功能。

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本工作由美国国立卫生研究院资助项目 AI074809 以及德克萨斯大学M. D. 安德森癌症中心机构研究资助项目向 W.C. 提供资助。

1. 配制 MES 缓冲液
<ol>
	<li>使用 MES 缓冲液（0.1 M 2-(N-吗啉代)乙磺酸和 0.9 M NaCl）制备仅含蛋白质的淀粉样蛋白以及稳定的可溶性蛋白寡聚体。称取 1.95 g MES 和 5.27 g NaCl，加入 H2O 并调节 pH 至 4.7，定容至 100 ml。4º C 保存，可使用长达 6 个月。</li>
</ol>
2. 从天然蛋白质直接制备仅含蛋白质的淀粉样蛋白
<ol>
	<li>称取所需蛋白（任何天然蛋白或肽），并用 MES 缓冲液重悬至 10 mg/ml。</li>
	<li>在 65 ºC 水浴中孵育 4 小时。孵育结束后，溶液中可见白色沉淀。</li>
	<li>加入 10% (v/v) 的 Tris-HCl (1 M, pH 10.5) 中和样品。</li>
	<li>将蛋白样品置于透析膜盒中，过夜透析，置换为后续分析所需的缓冲液。</li>
	<li>可通过执行步骤 2.1、2.3 和 2.4（省略热沉淀步骤 2.2）制备天然蛋白的对照样品。</li>
</ol>
3. 从天然蛋白质的稳定可溶性寡聚体中制备杂交淀粉样蛋白
<ol>
	<li>制备稳定的可溶性蛋白寡聚体
	<ol>
		<li>称取所需蛋白，并用 MES 缓冲液重悬至浓度为 10 mg/ml，在室温下放置 15 分钟。</li>
		<li>称取盐酸-1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺（EDC），并用 MES 缓冲液新鲜配制 20 mg/ml 的母液。</li>
		<li>按体积比 2:5 混合蛋白溶液与 EDC 溶液，即 每 10 mg EDC 对应 2 mg 蛋白。</li>
		<li>在室温下孵育 2 小时。</li>
		<li>加入终体积 10% 的 Tris-HCl（1 M，pH 10.5）中和样品。</li>
		<li>将蛋白样品装入透析盒中，在目标缓冲液中透析过夜，以完成缓冲液置换，用于后续分析。</li>
		<li>将制备好的稳定可溶性蛋白寡聚体于 4 ºC 保存，可稳定保存长达 4 周。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>利用稳定的可溶性蛋白寡聚体制备杂交淀粉样纤维。
	<ol>
		<li>制备含 DNA 的淀粉样纤维：按质量比 1:1 混合 DNA 与稳定的可溶性蛋白寡聚体，于 4 ºC 放置至少 2 小时。在此期间，当初始蛋白浓度为 0.5 mg/ml 或更高时，溶液中可见不溶性沉淀物形成。</li>
		<li>制备含 RNA 的淀粉样纤维：按质量比 1:1 混合 RNA 与稳定的可溶性蛋白寡聚体，于 4 ºC 放置至少 2 小时。在此期间，当初始蛋白浓度为 0.5 mg/ml 或更高时，溶液中可见不溶性沉淀物形成。</li>
		<li>制备含肝素的淀粉样纤维：按质量比 1:1 混合肝素与稳定的可溶性蛋白寡聚体，于 4 ºC 放置至少 2 小时。在此期间，当初始蛋白浓度为 0.5 mg/ml 或更高时，溶液中可见不溶性沉淀物形成。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Bhattacharya, M., Jain, N., Mukhopadhyay, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+the+Mechanism+of+Aggregation+and+Fibril+Formation+from+Bovine+Serum+Albumin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem.+B%22%5BJournal%5D)">Insights into the Mechanism of Aggregation and Fibril Formation from Bovine Serum Albumin.</a> J. Phys. Chem. B. 115, 4195-4205 (2011).</li>
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<li>McParland, V. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partially+Unfolded+States+of+b2-Microglobulin+and+Amyloid+Formation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Partially Unfolded States of b2-Microglobulin and Amyloid Formation in vitro.</a> Biochemistry. 39, 8735-8746 (2000).</li>
<li>Liu, K., Cho, H. S., Lashuel, H. A., Kelly, J. W., Wemmer, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+glimpse+of+a+possible+amyloidogenic+intermediate+of+transthyretin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">A glimpse of a possible amyloidogenic intermediate of transthyretin.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 7, 754-757 (2000).</li>
<li>Pfefferkorn, C. M., McGlinchey, R. P., Lee, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+pH+on+aggregation+kinetics+of+the+repeat+domain+of+a+functional+amyloid%5BTitle%5D)+AND+%22Pmel17.+Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Effects of pH on aggregation kinetics of the repeat domain of a functional amyloid.</a> Pmel17. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 21447-21452 (2010).</li>
<li>Di Domizio, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleic+acid-containing+amyloid+fibrils+potently+induce+type+I+interferon+and+stimulate+systemic+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Nucleic acid-containing amyloid fibrils potently induce type I interferon and stimulate systemic autoimmunity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 14550-14555 (2012).</li>
<li>Halle, A., Hornung, V., Petzold, G. C., Stewart, C. R., Monks, B. G., Reinheckel, T., Fitzgerald, K. A., Latz, E., Moore, K. J., Golenbock, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NALP3+inflammasome+is+involved+in+the+innate+immune+response+to+amyloid-%CE%B2%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The NALP3 inflammasome is involved in the innate immune response to amyloid-β.</a> Nat. Immunol. 9, 857(2008).</li>
<li>Masters, S. L., O'Neill, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease-associated+amyloid+and+misfolded+protein+aggregates+activate+the+inflammasome%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Disease-associated amyloid and misfolded protein aggregates activate the inflammasome.</a> Trends Mol. Med. 17, 276-282 (2011).</li>
</ol>

我们没有需要披露的内容。

本文所述方法为制备淀粉样纤维提供了一种快速且灵活的手段 体外 几乎可以从任何选定的蛋白质或肽段制备出多种不同类型的淀粉样纤维，包括仅含蛋白质的纤维或含有 DNA、RNA 的杂合聚集体。 &#160;或糖胺聚糖。该方法所涉及的操作步骤简单直接，无需高级技术培训。通过此方法制备的淀粉样蛋白相当稳定，可在4 ºC安全保存，或在-80 ºC长期冷冻储存。
确保成功生成淀粉样蛋白及其前体的最关键因素之一是MES缓冲液的适当酸度。根据我们的经验，pH值在3-5.5范围内的MES缓冲液可实现淀粉样蛋白及其前体的成功且可重复的制备。在pH 6.5条件下，生成淀粉样前体的效率显著降低。这一结果与其他先前报道一致——在pH 5.5的醋酸盐缓冲液中加入三氟乙醇，可诱导牛磷脂酰肌醇-3'-激酶的SH3结构域以及大肠杆菌（Escherichia coli）HypF蛋白的氨基末端结构域形成可溶性寡聚体21。人β2-微球蛋白和转甲状腺素蛋白在体外酸性条件下能高效形成淀粉样纤维in vitro&#160;2...

蛋白质是存在于所有类型细胞中最丰富的生物大分子。它们具有多种多样的大小、结构和翻译后修饰形式，在天然状态下执行着极其广泛的生物学功能。已有二十多种异常多肽被证实与多种人类病理状态相关，例如阿尔茨海默病、帕金森病、&#160;以及2型糖尿病1-4。这些终末错误折叠的蛋白质会积累形成淀粉样纤维&#160;，即在细胞外或细胞内形成的不溶性稳定聚集体。
尽管特定蛋白质与某些疾病相关，但越来越多的证据表明，所有多肽都具有内在特性，能够发生淀粉样变。全基因组序列分析鉴定了“淀粉样组”（amylome），其中从大肠杆菌（E. coli）到人类的所有编码肽段中，约有15%属于易形成淀粉样的片段5。因此，近年来发现了越来越多的功能性淀粉样蛋白，它们参与多种重要的细胞过程。例如，细菌利用淀粉样蛋白组装形成生物膜和芽孢结构，这对它们的生存和致病性至关重要6-9。肽类激素在哺乳动物分泌颗粒中储存时会形成淀粉样沉积物，随后才被释放，这进一步表明蛋白质的淀粉样形态可发挥有益的生物学功能6,10,11。此外，蛋白质还可组装成淀粉样纤维以传递关键的细胞信号12,13。
多年来，最受关注的淀粉样蛋白是由与人类疾病相关的单个肽段制备而来，例如淀粉样β肽或朊病毒肽。这些肽段通常缺乏明确的结构，可在溶液中随时间推移自发形成淀粉样蛋白，该过程由一种部分错误折叠的中间体介导，该中间体是不溶性淀粉样蛋白的前体。淀粉样蛋白的前体也称为可溶性蛋白寡聚体，由天然肽段生成时含量稀少且不稳定14,15。然而，如前所述，原则上几乎任何蛋白质在适当条件下均可形成淀粉样构象。我们近期建立了一种方法，可制备稳定的天然蛋白可溶性寡聚体，该寡聚体在多种辅因子存在下易于形成淀粉样蛋白16。所形成的淀粉样纤维反映了终末蛋白错误折叠聚集体的复杂特性17,18。本文中，我们使用“纯蛋白淀粉样物”指代不含辅因子的蛋白纤维，而使用“杂合淀粉样物”指代含有非蛋白质成分的纤维。
此前，已开发出多种方法用于生成淀粉样蛋白 体外 通过施加已知有利于蛋白质错误折叠的条件，例如高温、疏水环境和pH值变化19-23然而，这些方法存在多种问题，例如效率低、折叠可逆、批次间差异大或动力学缓慢。本文所述方法具有良好的可重复性，易于放大，并可精确控制淀粉样蛋白转化的时间和条件。

<table><tbody><tr><td>2-(N-吗啉代)乙磺酸 (MES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8250</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>BP358-10</td><td></td></tr><tr><td>1-乙基-3-[3-二甲氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐 (EDC)</td><td>Thermo/Pierce</td><td>22980</td><td></td></tr><tr><td>鲑鱼精子DNA</td><td>Sigma</td><td>D1626</td><td></td></tr><tr><td>酵母RNA</td><td>Sigma</td><td>R6625</td><td></td></tr><tr><td>猪肠黏膜肝素</td><td>Sigma</td><td>H3149</td><td></td></tr><tr><td>Tris碱</td><td>Fisher</td><td>BP152-1</td><td></td></tr><tr><td>设备：</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>水浴锅</td><td>Fisher Science</td><td>Isotemp 210</td><td></td></tr><tr><td>Slide-A-Lyzer透析盒</td><td>Thermo/Pierce</td><td>66380</td><td></td></tr></tbody></table>

天然蛋白质快速生成淀粉样蛋白 体外

Rapid Generation of Amyloid from Native Proteins In vitro

蛋白质通过其特定的三维折叠结构发挥功能，从而在生物体中执行关键任务。尽管多肽链的天然结构已具备多种功能，但目前人们认识到大多数蛋白质能够形成富含β折叠的淀粉样蛋白替代构象。不溶性的淀粉样纤维最初与多种人类疾病相关，但越来越多的研究表明其在多种重要的细胞过程中也发挥功能性作用。此外，患者组织中沉积的淀粉样物质包含 非蛋白质的 成分，如核酸和糖胺聚糖（GAGs）。这些辅因子可促进淀粉样蛋白的形成，从而产生不同类型的不溶性沉淀物。基于对蛋白质通过可溶性淀粉样前体中间阶段发生错误折叠机制的理解，我们设计了一种将天然蛋白质转化为淀粉样纤维的方法。 体外该方法可用于大量制备淀粉样蛋白，研究由特定蛋白生成的淀粉样蛋白的性质，并评估伴随其转化过程的结构变化。

将天然蛋白质直接转化为淀粉样蛋白的能力依赖于在 MES 缓冲液中高温所引发的构象变化。溶液中出现沉淀是蛋白质聚集以及可能形成淀粉样蛋白的良好指示。另一方面，为了使可溶性蛋白质寡聚体得以稳定，使用 EDC 对蛋白质进行交联，以固化在 MES 缓冲液中诱导产生的寡聚构象。因此，经稳定的蛋白质寡聚体为多聚体蛋白质（图 1），在 SDS-PAGE 分离时，可明显区别于单体形式的天然蛋白质或热诱导形成的聚集体。
稳定的可溶性蛋白质寡聚体在溶液中具有良好的稳定性，因此可以灵活地单独进行辅因子诱导的淀粉样转化，以控制缓冲液条件、蛋白质与辅因子的相对比例或其他参数。寡聚体向淀粉样结构的转化过程发生迅速，因此在与核酸或糖胺聚糖（GAGs）混合后数分钟内即出现不溶性沉淀物，这一现象并不意外。为确保稳定化的可溶性蛋白质寡聚体的质量，可进行若干简单的检测。如先前研究所述16，这些稳定的可溶性蛋白质寡聚体能够以序列非依赖的方式高效结合核酸，包括DNA和RNA。因此，可通过凝胶迁移实验来直观展示稳定化的可溶性蛋白质寡聚体与DNA之间的直接相互作用，表现为...

蛋白质可折叠成天然结构，也可错误折叠形成不溶性淀粉样蛋白。有利于错误折叠途径的条件可导致不同类型的淀粉样纤维形成。本文所述方法可实现天然蛋白质向淀粉样蛋白的快速转化 体外.

蛋白质通过其特定的三维折叠结构所激发的功能，在生物体中执行至关重要的任务。尽管天然结构……

以下实验的总体目标是快速在体外从任何蛋白质获得淀粉样纤维。该目标通过将目标蛋白质溶解于MES缓冲液中以诱导其结构错误折叠来实现。随后可将蛋白质在高温下孵育，从而在无需其他辅助因子的情况下促进淀粉样纤维的形成。或者，使用EDC对蛋白质进行交联，以生成稳定的可溶性蛋白原纤维，即淀粉样物质的前体。最后，将非蛋白质辅因子与稳定的可溶性蛋白寡聚体混合，以促进杂交淀粉样结构的形成。实验结果表明，在有利条件的促进下，天然蛋白质可被迅速转化为淀粉样构象。该方法有助于解答蛋白质错误折叠疾病中的关键问题，例如淀粉样结构如何从可溶性蛋白寡聚体精确形成，以及不同类型的淀粉样物质是否具有独特的生物学和病理学功能。首先，按照文本方案中所述方法制备MES缓冲液，用于仅含蛋白质的淀粉样蛋白和稳定可溶性蛋白质实验。随后称取所需蛋白质，并将其在MES缓冲液中重悬至浓度为10毫克/毫升。在本实验中，使用人血清白蛋白（HSA），将溶液置于65摄氏度水浴中孵育4小时。反应结束时，溶液中可见白色沉淀。用10%（v/v）的Tris-HCl中和样品，将蛋白在透析膜中透析过夜，以置换至所需的缓冲液中。为进一步分析，可通过以下步骤制备天然蛋白质的对照样品，但不进行热沉淀。为制备稳定的可溶性蛋白质，称取所需量的目标蛋白质，并将其重悬至浓度为10毫克/毫升。将蛋白质溶液置于MES缓冲液中，在室温下孵育15分钟。配制新鲜的20毫克/毫升EDC MES缓冲液储备液。将蛋白质溶液与EDC溶液按2:5的比例混合，室温孵育2小时。孵育结束后，加入10%体积比的Tris HCl中和样品，随后将蛋白质置于透析盒中，在目标缓冲液中透析过夜，完成缓冲液置换。用于进一步分析。将稳定后的可溶性蛋白韧带在4°C下保存，最长可保存四周。该悬浮液将用于制备杂交淀粉样蛋白，以同时构建含DNA的淀粉样蛋白和含RNA的淀粉样蛋白。将核酸与稳定化的可溶性蛋白质按1:1的比例混合。将混合物置于4摄氏度下孵育至少两小时。在此期间，当初始蛋白浓度为0.5毫克/毫升或更高时，溶液中可见不溶性沉淀物。制备含肝素的淀粉样蛋白混合物时，将肝素与稳定态可溶性蛋白按1:1的比例混合，然后在4摄氏度下孵育至少两小时。与含核酸的淀粉样蛋白类似，溶液中可见可溶性沉淀。当初始蛋白浓度为0.5毫克/毫升或更高时，将天然蛋白直接转化为淀粉样蛋白的能力依赖于高温所引发的构象改变。在 MES 缓冲液中，溶液中出现沉淀是蛋白质聚集以及可能形成淀粉样物质的良好指示，这有助于可溶性蛋白质寡聚体的稳定。EDC 用于交联蛋白质，以固化在 MES 缓冲液中诱导形成的寡聚构象。因此，所得到的稳定蛋白质寡聚体是与单体天然蛋白质或热诱导聚集物不同的多聚体蛋白质。当通过SDS-PAGE分离稳定化的可溶性蛋白时，所有配体均能以序列非依赖的方式 readily 结合并结合核酸，包括DNA和RNA。因此，可通过凝胶迁移实验（gel shift assay）来观察稳定化可溶性蛋白、所有配体与DNA之间的直接相互作用，该相互作用将导致DNA在AROS凝胶上的迁移速度减慢。细胞毒性是可溶性蛋白的一个典型特征。所有配体均能稳定可溶性蛋白，并以剂量依赖的方式诱导细胞死亡，该过程可通过荧光激活细胞分选法检测。如图所示，RP I 8 2 2 6 细胞对可溶性蛋白极为敏感，所有配体均可诱导细胞死亡，通过碘化丙啶染色进行检测。观看本视频后，您应能够充分理解如何在体外从任意选择的蛋白质制备不同类型的淀粉样蛋白。

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学习利用MES缓冲液和高温孵育或EDC交联技术，在体外快速将天然蛋白质转化为淀粉样蛋白纤维的方法。该技术有助于研究蛋白质错误折叠疾病的发病机制及淀粉样蛋白的生物学功能。

天然蛋白质快速生成淀粉样蛋白体外

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