NF-κB依赖性成体神经发生的调控与分析方法

本实验的总体目标是研究转录因子NF kappa B在成年大脑中的功能。首先通过培育在神经元中特异性抑制NF kappa B活性的转基因小鼠来实现这一目标。实验的第二步是利用空间模式分离或Barnes迷宫测试来评估抑制NF kappa B后所产生的行为学后果。

第三步是仔细灌注动物，取出脑组织，并进行适当的切片。最后一步是分析组织学和结构上的效应，例如通过免疫染色来观察苔藓纤维的投射。最终，通过行为学测试结合组织学分析，可将齿状回依赖性学习的变化与相关组织的结构改变相互关联。

与现有的 Mars Vase 等方法相比，该技术的主要优势在于，空间模式分离任务 MA 能够特异性地测量与抗儿童依赖性学习过程以及该脑区神经退行与再生相关的活动。该方法有助于回答成年神经发生领域的关键科学问题，例如学习过程中的特殊模式分离。迷宫操作的示范将由本实验室的技术员 Angela Kula 完成。

灌流操作将由研究助理 Peter Hyman 演示，随后由技术员 Ulrich KA 展示脑组织切片过程，最后由我实验室的博士生 Jeanine Muah 演示共聚焦扫描显微镜，以完成空间模式分离实验。

根据国际和本地指南进行 Barnes 迷宫行为学测试。本实验应仅使用至少六个月大的雄性小鼠。每组实验中的动物年龄相差不得超过四天，且所有测试均须由同一操作者在测试前完成。

小鼠应饲喂标准饮食，以确保其对甜食具有摄食动机。首先准备一个由硬质塑料制成、直径为120厘米的白色平板用于测试。额外的迷宫线索可采用不同材料制成，并可具有不同的形状。

重要的是，这些线索必须具有高对比度，以便动物跑轮能够清晰识别。梯子和隧道都是很好的线索。将培养板置于数个中等强度的荧光灯管下方，使小鼠因趋暗习性而有动力离开光照区域。

房间必须控制湿度，并保持恒定的22摄氏度。现在设置视频追踪系统。将摄像头置于平板中心正上方115厘米处。

接下来，将多色的额外迷宫线索固定在一块与转盘大小匹配的白色布料上。将这些线索置于布料中央附近，以便动物能够清晰看见。现在，使用快速消毒剂仔细清洁转盘，以去除实验装置中可能残留的任何气味。

在白色托盘上放置七个相同的黄色食物屋。应在开始测试前一天明确标记其位置，并让每只小鼠适应转盘环境。在适应性试验期间，将甜味食物颗粒（如切成四等份的果环）作为奖励放入七个食物屋内。

将每只小鼠放置于平板的起始点，使其自由探索10分钟。记录小鼠之间的探索行为。使用快速消毒剂清洁圆形平板和食物盒。

同时补充食物奖励。在接下来的连续七天内，进行测试阶段的试验。整个实验过程中，除一个房屋外，其余所有房屋均用透明胶带封闭。

每次使用的都是同一间房间。每个房间仍需放置奖励物，并像习惯化试验一样运行测试。每天在相同时间对每只动物进行测试，以避免昼夜节律变化的影响。

随后，使用适当的统计方法分析潜伏期、移动距离和错误次数。软件将错误定义为接近错误的食物屋，或虽与正确的箱子接触但未能进入并获取奖励。采用双因素方差分析（two-way ANOVA）结合邦弗罗尼（Bonferroni）事后检验来比较各组之间的差异。

使用戊巴比妥经腹腔注射麻醉动物后，用含有肝素和丙烷的磷酸盐缓冲液（PBS）经心脏进行灌注。使用26号针头在左心室打一个小孔，同时在右心房做一切口，以使血液和灌注液顺利流出。

将灌注针以直角插入左心室的孔洞，深度为一至两毫米。使用1.2至1.4米的静水压，在2至4分钟内完成小鼠灌注。在肝素和丙烷之后，使用PBS配制的4%多聚甲醛灌注10至15分钟。

灌注速度应为每分钟15毫升。现在解剖出脑组织，其应呈淡白色，无可见的红色血管。

将所有收集的脑组织在4%多聚甲醛中4摄氏度固定24小时。次日，用含30%蔗糖的PBS溶液在4摄氏度对脑组织进行冷冻保护，保存至少24小时。

将脑组织置于冷冻切片台上冷冻，并切成40微米厚的水平切片。用神经丝蛋白M抗体对切片进行染色后，可在荧光抗体对应的波长下，使用共聚焦激光扫描显微镜观察苔藓纤维投射。先以低倍镜开始扫描，定位海马体及苔藓纤维投射区域。

然后在更高放大倍数下，采集苔藓纤维的高分辨率冠状面扫描图像，用于分析 IκBα AA1 转基因的表达情况。对双转基因小鼠脑组织进行分离、冷冻切片，并使用抗 GFP 抗体进行共聚焦激光扫描显微染色。显微观察显示，该转基因在 CA1 区、CA3 区以及齿状回（DG）中均有高水平表达，从而确定了海马神经发生区域中最早表达由 CAMK2α 驱动的 IκBα AA1 的细胞类型。

来自I Kappa BTTA小鼠的海马体CAMPi冷冻切片。动物经双重染色标记double courtin和转基因，共聚焦分析显示，在由箭头指示的年轻DCX阳性颗粒细胞中检测到GFP信号，表明CAMK IIα活性诱导了转基因的表达。对i kappa BTTA和i Kappa B缺失小鼠海马体的冠状切片进行神经丝蛋白M染色，以显示苔藓纤维投射，并揭示i kappa BTTA小鼠中复杂的囊泡样结构组织。

苔藓纤维投射严重受损。此外，NF kappa B 抑制导致颗粒细胞层厚度显著减小以及齿状回体积缩小，为研究这种显著结构缺陷的潜在原因，我们对对照组和 I kappa BTTA 小鼠的新鲜未固定海马切片进行了氟代玉红 C 染色，该染色可特异性检测神经元细胞死亡。

与单转基因对照动物相比，双转基因动物中观察到退化神经突的数量显著增加。此外，在I kappa BTTA小鼠中检测到cleaved capase-3阳性细胞数量显著增多。相比之下，针对DCX的免疫组织化学染色显示，I kappa BT小鼠脑内DCX阳性细胞数量明显增加。

此外，I kappa B TTA 海马齿状回中的 DCX 阳性细胞不仅存在于颗粒下层，还出现在齿状回更深层的区域；而对照组动物中的 DCX 阳性前体细胞则几乎全部局限于颗粒下层。为了验证 DCX 表达细胞数量的增加是源于早期前体细胞的成熟，还是直接由 DCX 阳性细胞增殖所致。

向i kappa BTTA小鼠和对照小鼠腹腔注射BRDU，随后进行冷冻切片，并用DCX和BRDU染色，以分析细胞增殖情况。细胞增殖分析采用单次注射BRDU后24小时进行检测。对于细胞分化分析，则每天进行三次BRDU注射，连续注射后七天进行分析。

I kappa BTTA 阴性动物与对照组动物之间，BrdU 阳性细胞的总数未观察到显著差异。相比之下，三次连续注射方法显示，I capa, BTTA 小鼠齿状回（DG）中 BrdU-DCX 双阳性细胞数量明显增加。表达 DCX 的细胞的分化或整合可能受到干扰，导致细胞数量增加，且可能涉及 III 型细胞，以特异性检测双转基因小鼠的行为表现。

在一项依赖 DG 的任务中，采用了 S-P-S-B-M 方法。I kappa B 对照组动物在实验第一天依次探索食物屋。经过七天的训练后，动物能够直接找到开放的食物屋。

相比之下，IA BTTA 动物在训练结束后仍会持续逐个探索食物屋。与 i Kappa B 对照动物相比，I kappa BTTA 动物行走距离显著增加，且潜伏期更长、错误率更高，这一观察结果提示这些动物存在严重的学习缺陷。该技术一旦建立，若操作得当，每只动物可在 30 分钟内完成。

该技术可能为其他对依赖陀螺仪任务的神经科学研究人员提供帮助，例如小鼠成年神经发生、退化或再生的研究。