2014年2月13日
方法的NF-κB依赖型成年海马神经发生的操作和分析的描述。详细的协议提出了一个齿状回依赖性行为测试(称为空间格局分离巴恩斯迷宫)的认知结果小鼠的调查。这项技术也将有助于使在其他实验设置的调查。
该程序的总体目标是研究转录因子 NF kappa B 在成人大脑中的功能。这是通过首先培育特异性抑制神经元中 NF κ B 活性的转基因小鼠来实现的。该程序的第二步是使用空间模式、分离或谷仓、迷宫来测试 NF kappa B 抑制的行为后果。
第三步是小心翼翼地将动物大量繁殖,取出大脑,并对其进行适当的切片。最后一步是分析组织学和结构效应,例如通过免疫染色可视化苔藓纤维投射。最终,使用行为测试后进行组织学可以将齿状回依赖性学习的变化与相关组织的结构变化相关联。
与火星花瓶等现有方法相比,这种技术的主要优点是空间模式分离键 MA 提供了专门测量该大脑区域的抗儿童依赖学习过程以及神经退化和再生的机会。这种方法可以帮助回答成人神经发生领域的关键问题,例如作为特殊模式分离的学习。演示迷宫将由我实验室的技术人员 Angela Kula 完成。
灌注将由研究助理 Peter Hyman 介绍。然后,技术员 Ulrich KA 将展示大脑切片。最后,共聚焦扫描显微镜将由我实验室的博士生 Jeanine Muah 介绍进行空间模式分离。
Barnes Maze 根据国际和当地指南进行行为测试。对于该测定,仅使用至少 6 个月大的雄性小鼠很重要。对于每个测试系列,动物必须在 4 天内,并且应在测试前由同一作员进行所有测试。
应该给小鼠喂食标准饮食,以便它们受到甜食的刺激。要首先设置测试,请获得一个直径为 120 厘米的硬塑料白板。额外的迷宫提示可以由不同的材料制成,并且可能具有不同的形状。
重要的是,它们必须具有高对比度才能被动物行走的轮子清楚地识别。梯子和隧道都是很好的提示。将板放在几个中等强度的霓虹荧光灯下,这样小鼠就有动力离开光线。
房间必须控制湿度并恒定在 22 摄氏度。现在设置视频跟踪系统。将相机放置在板中心上方 115 厘米处。
接下来,将多色的额外迷宫提示连接到适合盘子的白色布上。将它们放置在布料中心附近,以便动物很容易看到它们。现在,用快速消毒剂仔细清洁板,该消毒剂可以去除实验装置中的任何气味。
在白色盘子上放置 7 个相同的黄色食物屋。在开始测试前一天,应该明确标记它们的位置,让每个鼠标都习惯于光盘。将甜食颗粒奖励(如四分之一的水果循环)放入七个食物屋中的每一个内,以进行居住试验。
将每只鼠标放在盘子的起点上,让它探索 10 分钟。记录 mice 之间的探索。用快速消毒剂清洁圆板和食品房。
还要补充食物奖励。在接下来的连续 7 天内,为测试运行测试试验。在整个实验过程中,除了一个房子外,所有房子都用透明胶带封闭。
它总是同一个房子。每个房子仍然加载着奖励,并且测试像习惯化试验一样进行。在一天中的同一时间为每只动物进行测试,以避免昼夜节律变化。
稍后,使用适当的统计数据分析延迟、覆盖的距离和错误。软件将错误定义为接近错误的食品屋或接触正确的盒子,但未能输入和取回奖励。要比较各组,请使用双因子方差分析和 bon fer 事后检验。
用腹膜间注射 vertin 麻醉动物后,小心地用含有肝素和丙烷的 PBS 经亲切灌注它。使用 26 号针头在左心室打一个孔。还要在右心房切开,让血液和灌注 8 流出。
将灌注针以直角插入左心室的孔中,深度为 1 至 2 毫米。使用 1.2 至 1.4 米的静水压力,并在 2 至 4 分钟内灌注鼠标。用 4% Paraldehyde in PBS 溶液对肝素和丙烷进行 10 至 15 分钟的跟踪。
灌注速度应为 15 毫升/分钟。现在解剖大脑。它应该是淡白色的,没有可见的红色血管。
将所有收集的大脑在 4 摄氏度的 4% 对甲醛中固定 24 小时。第二天。Cryo 在 PBS 中的 30% 蔗糖中保护大脑,将它们储存在 4 摄氏度后至少 24 小时。
大脑被冷冻在冷冻音台上,并切成 40 微米厚的水平切片。用神经丝 M 抗体对切片进行染色后,可以使用共聚焦激光扫描显微镜以适合荧光抗体的波长观察苔藓纤维投影。以低放大倍率开始扫描,并定向到海马体和苔藓纤维突起。
然后在更高的放大倍率下,收集苔藓纤维的高分辨率 C 形截面扫描进行分析,以研究 I kappa B alpha AA one 转基因的表达。在双转基因小鼠大脑中,使用抗 GFP 共聚焦激光扫描的抗体进行冷冻切片和染色。显微镜检查显示转基因在 CA one 区、CA 3 区和 DG 中高表达,以确定在海马神经源区表达 CAMK two alpha 驱动的 I kappa B alpha AA one 的最早细胞类型。
来自 I Kappa BTTA 的河马 Campi 的冷冻切片。对动物进行双 courtin 染色,转基因共聚焦分析显示年轻的 DCX 阳性颗粒细胞中的 GFP 信号,箭头表示 CAMK 两个 α 活性诱导转基因的表达。对 i kappa BTTA 和 i Kappa B minus 小鼠海马体的冠状切片进行神经丝 M 染色,以可视化苔藓纤维突起并揭示 I kappa BTTA 小鼠的复杂和囊泡组织。
长满苔藓的纤维突起严重受损。此外,NF kappa B 抑制导致叶片厚度显着减少和 DG 体积减小,以研究显着结构缺陷的潜在原因。用荧光玉 C 对来自对照和 I kappa BTTA 小鼠的新鲜未固定海马切片进行染色,这允许特异性检测神经元细胞死亡。
与单转基因对照相比,在双转基因动物中观察到退化神经突的数量显著增加。此外,在 I kappa BTTA 小鼠中检测到裂解的 capace 三个阳性细胞显着增加。相比之下,针对 DCX 的免疫组织化学染色显示 I kappa BT 小鼠大脑中 DCX 阳性细胞的数量显着增加。
此外,I kappa B TTA hippo Campi 中的 d CX 阳性细胞并不完全排列在亚颗粒区,但也存在于 dg 的更深区域。而对照动物中的 D CX 阳性祖细胞几乎完全位于亚颗粒区。检测表达 DCX 的细胞数量的增加是早期祖细胞成熟的结果或直接由于 DCX 阳性细胞的增殖。
腹膜内注射 i kappa BTTA 和对照小鼠的 BRDU,然后冷冻切片并用 DCX 和 BRDU 染色以分析增殖。BRDU 注射一次,24 小时后进行分析。为了分析分化,每天进行 3 次注射,然后在单次 BRDU 注射后 7 天后进行分析。
未观察到 I kappa BTTA 阴性动物和对照动物之间 BRDU 阳性细胞总数的显着差异。相比之下,三次连续注射方法显示 I capa 的 DG BTTA 中 B-R-D-U-D-C-X 阳性细胞的数量明显增加。小鼠干扰了表达 DCX 的细胞的分化或整合,细胞数量可能增加,并且可能涉及 3 型细胞以专门测试双转基因小鼠的行为。
在一项依赖 DG 的任务中,采用了 S-P-S-B-M。I kappa B 对照动物在实验的第一天连续探索了食品屋。经过 7 天的训练,动物们能够直接找到开放的食物屋。
相比之下,IA BTTA 动物即使在训练后仍继续连续探索食品屋。与 i Kappa B 对照动物相比,I kappa BTTA 动物所覆盖的距离显着增加以及更高的潜伏期和错误率的观察表明,这些动物具有严重的学习缺陷。一旦建立,如果执行得当,每只动物可以在 30 分钟内完成这项技术。
这项技术可能会为其他对 daid 陀螺依赖任务感兴趣的神经科学家铺平道路,例如小鼠的成体神经发生、退化或再生。
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本文介绍了操纵和分析NF-κB依赖的成年海马神经发生的方法。提出了一个详细的牙状回依赖的行为测试协议,即空间模式分离-Barnes迷宫,用于研究小鼠的认知结果。
Understanding NF-κB's role in adult hippocampal neurogenesis provides mechanistic insights into learning and memory pathways relevant to cognitive disorder target validation. The spatial pattern separation-Barnes maze enables quantitative assessment of dentate gyrus-dependent cognition, supporting phenotypic screening of genetic or pharmacological modulators. This integrated behavioral-histological approach facilitates preclinical model validation and translational biomarker alignment for neurogenic pathways.
This method bridges early target validation (NF-κB modulation) to phenotypic screening (behavioral testing) and preclinical analysis (histological quantification), enabling iterative de-risking of neurogenic targets.