Name: 听觉皮层在成年猫用高场磁共振成像功能成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-19T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 50 s
Description: 了解利用高场功能磁共振成像技术对成年猫听觉皮层进行功能成像的方法。本实验通过声音刺激呈现和图像采集，量化大脑激活水平，为研究哺乳动物听觉处理机制提供重要见解。

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作者谨此感谢 Kyle Gilbert 在定制射频线圈设计方面的贡献，以及 Kevin Barker 在磁共振成像兼容雪橇设计方面的贡献。本研究工作得到了加拿大卫生研究院（CIHR）、加拿大自然科学与工程研究理事会（NSERC）和加拿大创新基金会（CFI）的支持。

以下步骤可应用于使用麻醉猫的任何成像实验。专为听觉实验设计的步骤（步骤 1.1–1.7、2.8、4.1）可根据其他感觉刺激方案进行调整。
所有实验程序均获得西安大略大学动物护理委员会动物使用小组委员会的批准，并遵循加拿大动物护理委员会（CCAC）规定指南44。从动物准备到恢复，所述实验大约需要150分钟。实验的时间进程如图1所示。
1. 刺激设备准备
图2展示了在MRI扫描仪中生成听觉刺激所需的电子元件及其相应的连接方式。所需设备如下：一台计算机、一个外置声卡、一个立体声功率放大器以及一套与fMRI兼容的耳机系统。
<ol>
	<li>通过通用串行总线（USB）电缆将用于呈现听觉刺激的计算机连接到外置声卡。</li>
	<li>将连接外置声卡输出端口的电缆连接至立体声功率放大器的输入端口。</li>
	<li>将连接立体声功率放大器输出端口的电缆连接至fMRI兼容耳机系统的变压器盒的输入端口。</li>
	<li>将双耳耳机连接至变压器盒的输出端口。</li>
	<li>使用带有BNC接头的屏蔽同轴电缆，将变压器盒连接至扫描室外部的穿墙面板。</li>
	<li>在扫描室内，将耳机电缆组件连接至穿墙面板上对应的BNC端口。</li>
	<li>将泡沫耳塞连接至耳机，然后将耳机连接至电缆组件。运行测试听觉刺激，以确认声音已从计算机传输至耳机。在动物准备阶段（步骤2.7），断开耳机连接，并将泡沫耳塞牢固地插入猫的耳道中。</li>
</ol>
2. 动物准备
<ol>
	<li>对猫进行术前用药时，通过皮下（SC）注射给予硫酸阿托品（0.02 mg/kg）和乙酰丙嗪（0.02 mg/kg）的镇静混合物。</li>
	<li>20分钟后，通过肌肉（IM）注射给予氯胺酮（4 mg/kg）和盐酸右美托咪定（0.02–0.03 mg/kg）以诱导麻醉。氯胺酮通常需与镇静剂和肌肉松弛剂联合使用，在本例中即为盐酸右美托咪定，以减少单独使用氯胺酮时常见的震颤和肌肉强直45。该麻醉组合通常可维持约150分钟的镇静效果，在兽医临床实践中常用于小型动物的麻醉诱导。</li>
	<li>当猫失去翻正反射后，向其眼部涂抹眼用软膏，以防止操作过程中角膜干燥。在内侧隐静脉置入留置导管，用于静脉输注氯胺酮。</li>
	<li>通过夹捏前肢脚趾并观察猫是否回缩肢体来测试麻醉诱导是否成功。一旦足底反射消失，用利多卡因喷雾抑制咽反射，随后插入4.0–4.5号气管导管进行气管插管。</li>
	<li>在整个成像过程中，通过持续输注氯胺酮（0.6–0.75 mg/kg/hr）并联合吸入异氟烷（0.4–0.5%），以1–1.5 L/min流速在100%氧气中输送，以维持麻醉状态。将60 ml生理盐水与0.07 ml氯胺酮混合于60 ml注射器中，然后将注射器置于注射泵内。此步骤可在猫术前用药前完成。</li>
	<li>将装有温热石蜡的加热垫放置在磁共振兼容雪橇的底部（图3a和3c），并在雪橇内壁周围铺设隔热用塑料气泡膜。</li>
	<li>将猫以仰卧位置于磁共振兼容雪橇内的隔热气泡膜中（图3c）。</li>
	<li>猫体位固定后，调整头部以便接触耳道。将泡沫耳塞尽可能卷至最小直径，然后将每侧耳塞深入插入耳道。插入后，泡沫耳塞应膨胀以填满耳道内部空间。</li>
	<li>调整猫的头部位置，使其准确位于3通道射频（RF）线圈内（图3b）。使用声学阻尼记忆泡沫固定头部（图3d）。在耳部周围放置泡沫材料，以进一步衰减扫描仪噪声。</li>
	<li>用隔热塑料气泡膜包裹猫体，然后固定并运送雪橇至扫描仪床。</li>
	<li>将输液管路、麻醉气体输送管及监测设备连接至猫。将耳机连接至穿透面板上的耳机电缆组件。</li>
	<li>以0.6 mg/kg/hr的基础流速开始氯胺酮输注，并根据麻醉深度按需调整流速。初始异氟烷浓度设为0.5%，在完成解剖扫描后降至0.4%。</li>
	<li>在整个实验过程中，使用远离扫描孔道适当距离的磁共振兼容监测设备，持续监测并记录猫的血氧饱和度、呼气末CO2水平、心率、呼吸频率及直肠温度（如可行）。表1列出了成功实施该操作所需的生理参数平均值及其范围。心率和呼吸频率的持续升高通常提示即将从麻醉中恢复。</li>
	<li>操作结束后，将猫从雪橇中取出。继续使用加热垫和毛巾提供辅助加热，直至动物完全恢复。一旦咽反射恢复，立即拔除气管导管。持续监测猫直至翻正反射恢复，然后将其送回饲养设施。在操作次日对动物进行评估，确保实验未引起任何不良反应。</li>
</ol>
3. 脑成像
<ol>
	<li>以轴向切片方向采集猫脑的解剖学扫描图像。解剖学参考体积的成像参数如下：FLASH成像序列，TR = 750毫秒，TE = 8毫秒，矩阵 = 256 x 256，采集体素尺寸 = 281 μm x 281 μm x 1.0 mm。解剖扫描持续时间约为6分钟。图4（左侧面板）展示了使用上述参数获得的典型解剖图像切片。</li>
	<li>功能成像体积的成像参数如下：分段交错回波平面成像（EPI），TR = 1,000毫秒，TE = 15毫秒，3个分段/层面，21 x 1 mm切片；矩阵 = 96 x 96；视野 = 72 mm x 72 mm；采集体素尺寸 = 0.75 mm x 0.75 mm x 1.0 mm；每个体积的采集时间为3秒。 图4（右侧面板）展示了使用上述参数获得的典型功能图像切片。</li>
</ol>
4. 刺激呈现
<ol>
	<li>采用区组设计呈现宽带白噪声刺激（0-25 kHz，100 毫秒脉冲，上升/下降时间 5 毫秒，每 200 毫秒呈现一次，90-100 dB SPL），其中听觉刺激持续 30 秒，并与 30 秒基线期（无刺激）交替进行（图 5）。重复此步骤，直至在听觉皮层中观察到声诱发的 BOLD 活动。使用区组设计的每个功能扫描运行时长约 4.5 分钟，共采集 90 个体积数据。</li>
	<li>按照所需的功能扫描次数，以适当的区组设计构型呈现刺激。</li>
</ol>
5. 数据分析
<ol>
	<li>选择合适的fMRI分析软件（例如 SPM、FSL）来处理所获取的功能图像数据。</li>
	<li>将每个功能像体积与参考解剖扫描时间上最接近的那个像体积进行重新对齐。保存所得的运动校正参数，供步骤5.6使用。排除任何旋转头部运动超过1°或平移头部运动超过1 mm的功能扫描数据。</li>
	<li>将每个体积数据与参考解剖扫描图像进行配准。</li>
	<li>使用2 mm全宽半高（FWHM）高斯滤波器对每个体积进行平滑处理。</li>
	<li>将一个对应于ON-OFF刺激区组设计的方波（矩形）函数作为回归变量纳入一般线性模型（GLM）。</li>
	<li>将运动校正参数作为无关协变量纳入回归分析，以校正与运动相关的伪影。对GLM结果采用未经校正的统计阈值p = 0.001，以观察BOLD信号激活簇。确定满足经校正（全脑家族-wise误差：FWE）阈值p的最小激活簇的大小。 &#60; 在簇水平上设置 p = 0.05。将簇扩展阈值设为该值，以显示感兴趣区域中具有统计学意义的簇。</li>
	<li>将每个体素的BOLD信号百分比变化（PSC）定义为刺激阶段的平均BOLD信号与基线阶段的平均BOLD信号之间的差值。</li>
</ol>

作者声明不存在任何经济或其他方面的利益冲突。

在为麻醉动物模型的听觉功能设计功能性磁共振成像（fMRI）实验时，应仔细考虑以下问题：（i）麻醉对皮层反应的影响，（ii）背景扫描噪声的影响，以及（iii）实验过程中数据采集阶段的优化。
尽管麻醉状态下的准备具有能够提供长时间镇静并最大限度减少功能成像过程中潜在头部运动的重要优势，但已知麻醉会影响皮层血流动力学。本方案中描述的麻醉剂在猫听觉皮层（氯胺酮）和视觉皮层（异氟烷）的电生理学46-48及功能成像研究26-28,42中被广泛使用。虽然已知氯胺酮对皮层自发活动的影响较小49，但在大鼠听觉皮层中，10 mg/kg剂量的氯胺酮已被证明会降低脑代谢，从而减弱血流动力学反应50。然而，在本方案推荐的剂量（4 mg/kg）下，猫听觉皮层在声学刺激下可观察到高达6%的BOLD信号变化43。异氟烷常用于研究猫视觉皮层的功能特性；但与清醒状态下的准备相比，它也被证明会降低猫视觉皮层血流动力学反应的幅度51。此外，在剂量超过1.5%时，异氟烷会增加大鼠的脑血流量<s...

目前对哺乳动物听觉处理的理解主要来源于对猴子1-5、雪貂6-10、蝙蝠11-14、啮齿类动物15-19和猫20-24进行的侵入性电生理学研究。电生理技术通常利用细胞外微电极记录电极尖端周围小块神经组织内单个或多个神经元的活动。已建立的功能成像方法，如光学成像和功能磁共振成像（fMRI），通过提供多个空间上分离的脑区在同时激活时的宏观视角，可作为细胞外记录的有益补充。内在信号光学成像通过测量脑组织表面反射特性与活动相关的改变，实现对诱发活动的可视化；而fMRI则利用血氧水平依赖（BOLD）对比来测量特定任务期间活跃脑区中由刺激诱发的血流动力学变化。光学成像需要直接暴露大脑皮层表面，以测量与刺激诱发活动相关的组织表面反射率变化25。相比之下，fMRI具有非侵入性，利用脱氧血红蛋白的顺磁特性，在完整颅骨条件下测量大脑皮层表面26-28以及脑沟内27,29的诱发活动。在非人灵长类动物视觉皮层30和人类听觉皮层31中，BOLD信号与神经元活动之间存在强相关性，这验证了fMRI作为研究感觉功能的有效工具。由于fMRI已被广泛用于研究人类、猴和大鼠模型中听觉通路的特征，例如频率拓扑组织32-36、听觉功能的偏侧化37、皮层激活模式、皮层区域的识别38、声音强度对听觉反应特性的影响39,40以及BOLD反应时间进程的特征29,41，因此建立一种适用于研究猫听觉功能的功能成像方案，将为现有功能成像文献提供有价值的补充。尽管fMRI也已被用于探索麻醉状态下猫视觉皮层的多种功能特征26-28,42，但极少有研究采用该技术来考察猫听觉皮层中的感觉信息处理。本方案的目的是建立一种有效的方法，利用fMRI定量评估麻醉状态下猫听觉皮层的功能。本文所述实验程序已成功用于描述成年猫听觉皮层BOLD反应时间进程的特征43。

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;材料&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>硫酸阿托品注射液 0.5 mg/ml</td><td>Rafter 8 Products</td><td></td><td></td></tr><tr><td>乙酰丙嗪 5 mg/ml</td><td>Vetoquinol Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>盐酸氯胺酮 100 mg/ml</td><td>Bimeda-MTC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>盐酸右美托咪定（Dexdomitor 0.5 mg/ml）</td><td>Orion Pharma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>异氟烷 99.9%</td><td>Abbott Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>利多卡因（气管内喷雾剂，每计量剂量10 mg）</td><td>Astra Zeneca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>润滑性眼膏（Refresh Lacri Lube）</td><td>Allergan Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>生理盐水 0.95%</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>静脉留置针 22 g（带翼）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>静脉延长管</td><td>Codan US Corp.</td><td>BC 269</td><td></td></tr><tr><td>静脉输液器 10 滴/ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>气管插管 4.0</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>加热垫（Snuggle Safe）</td><td>Lenric C21 Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>60 ml 注射器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;设备&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>外置声卡</td><td>Roland Corporation</td><td>Cakewalk UA-25EX</td><td></td></tr><tr><td>立体声功率放大器</td><td>Pyle Audio Inc.</td><td>Pyle Pro PCAU11</td><td></td></tr><tr><td>MRI 兼容插入式耳机系统</td><td>Sensimetric Corporation</td><td>Model S14</td><td></td></tr><tr><td>插入式耳机用泡沫耳塞</td><td>E-A-R Auditory Systems</td><td>Earlink 3B</td><td></td></tr><tr><td>呼气末 CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 监测仪</td><td>Nellcor</td><td>N-85</td><td></td></tr><tr><td>MRI 兼容脉搏血氧仪</td><td>Nonin Medical Inc.</td><td>Model 7500</td><td></td></tr><tr><td>注射泵</td><td>Harvard Apparatus</td><td>70-2208</td><td></td></tr></tbody></table>

使用高场强fmri对成年猫听觉皮层进行功能成像

Functional Imaging of Auditory Cortex in Adult Cats using High-field fMRI

目前对哺乳动物听觉系统感觉处理的认识主要来源于在多种动物模型（包括猴子、雪貂、蝙蝠、啮齿类动物和猫）上开展的电生理学研究。为了在人类与动物的听觉功能模型之间建立恰当的对应关系，有必要在人类功能成像研究与动物电生理研究之间搭建桥梁。功能性磁共振成像（fMRI）是一种成熟且微创的技术，可用于测量大脑皮层不同区域的血流动力学活动的大范围模式。该技术被广泛用于探测人脑中的感觉功能，是连接人类与动物听觉处理研究的有力工具，并已成功应用于猴子和啮齿类动物听觉功能的研究。以下方案描述了一种通过fMRI测量刺激诱发的听觉皮层血流动力学变化，以研究麻醉成年猫听觉功能的实验流程。该方法有助于比较不同听觉功能模型中的血流动力学反应，从而增进对哺乳动物听觉皮层跨物种共性特征的理解。

采用7T水平孔径扫描仪获取了典型的脑功能数据，并利用MATLAB中的统计参数映射工具箱进行分析。根据所述实验方案，已在猫模型中持续观察到听觉刺激引发的稳定皮层血流动力学反应43。图6展示了两只动物在30秒宽带噪声刺激（以区组设计呈现）下的BOLD激活情况。宽带噪声与基线（无刺激）对比的T统计量图在两个成像切片平面上显示出听觉皮层内双侧对称、连续的激活簇（图6a 和 6d；簇水平FWE校正阈值：p &lt; 0.05）。图6b 和 6e 分别显示了在一次功能扫描过程中，图6a 和 6d 中高亮体素处BOLD信号的时间调制过程。若采用方波形式的一般线性模型拟合，预期BOLD信号将在每次听觉刺激呈现期间相对于基线（无刺激条件）发生调制，其模式类似于区组设计中的“开-关”（ON-OFF）模式。图6c 和 6f 展示了BOL...

对哺乳动物听觉系统的功能研究传统上采用空间聚焦技术，例如电生理记录。以下方案描述了一种利用功能性磁共振成像来可视化猫听觉皮层中诱发性血流动力学活动大尺度模式的方法。

使用高场强fMRI对成年猫听觉皮层进行功能成像

目前对哺乳动物听觉系统感觉信息处理的认识主要来源于在多种动物身上开展的电生理学研究……

本实验的总体目标是利用高场强功能磁共振成像技术对猫的完整听觉皮层进行功能性成像。首先，需要准备用于刺激呈现的声学设备；其次，对猫进行麻醉并将其固定在与磁共振成像兼容的滑板上，以完成扫描前的准备工作。接下来，在呈现刺激的同时，采集全脑的解剖和功能图像。最后一步是处理图像，以量化刺激呈现期间大脑激活的程度。最终，功能成像用于显示完整猫听觉皮层在声音刺激下的激活范围。该方法可用于帮助解答听觉功能中的关键问题，例如听觉皮层是否存在层级结构。与光学成像等现有方法相比，该技术的主要优势在于功能性磁共振成像（fMRI）具有非侵入性，能够在完整颅骨内测量功能性的皮层活动。该方法可为听觉功能提供深入见解，并可应用于其他感觉模式，如视觉和躯体感觉。本实验操作将由注册兽医技术员 Pam Nixon 和本实验室的研究生 Amy Hall 进行示范。本方案中所述的所有动物实验操作在开展前必须获得您所在机构动物使用委员会的批准。开始本方案的准备工作时，首先通过 USB 线缆将用于播放听觉刺激的计算机连接至外置声卡。然后，将外置声卡输出端口的线缆连接至立体声功率放大器的输入端口。接着，将立体声功率放大器输出端口的线缆连接至FMRI兼容耳机系统的变压器盒输入端口。使用带有BNC接头的屏蔽同轴电缆，将变压器盒连接至扫描室外部的穿墙面板。然后将耳机电缆组件连接到穿透面板上对应的 BNC 端口。在扫描室内，将泡沫耳塞连接到耳机上，再将耳机连接到电缆组件。运行测试听觉刺激，以确认声音正从计算机传输到耳机。在动物准备阶段，断开耳机连接，并将泡沫耳塞牢固地插入猫的耳道中。首先，设置好用于维持麻醉的注射泵，将60毫升生理盐水与0.07毫升氯胺酮混合于一支60毫升注射器中，并将其放入注射泵内。然后通过皮下注射给予硫酸阿托品和奋乃静（SUP promazine）的镇静混合物。20分钟后，通过肌肉注射给予氯胺酮和甲苯噻嗪盐酸盐以诱导麻醉。当猫的翻正反射消失后，在眼睛上涂抹眼用软膏，以防止手术过程中角膜干燥。同时，在内侧隐静脉内置入留置导管，用于静脉注射氯胺酮。在操作过程中，再次通过夹捏四只爪子上的脚趾并观察猫是否回缩肢体来检测麻醉诱导是否成功。一旦角膜反射消失，通过将利多卡因喷洒在咽壁上以抑制咽反射。然后使用4.0或4.5号气管导管对猫进行插管。在整个成像过程中，通过持续输注氯胺酮并吸入异氟烷，以每分钟1至1.5升的流速在100%氧气中维持麻醉。接下来，在MRI兼容雪橇的底部铺设一层隔热塑料气泡膜。然后将装有温热石蜡的加热垫放在气泡膜上方。在加热垫上再覆盖一层塑料气泡膜。接着将猫置于绝缘气泡膜内，并使其仰卧于与磁共振成像仪兼容的滑板中。将猫固定好后，调整其头部以方便接触耳朵。将泡沫耳塞尖端卷至尽可能小的直径，然后将每个耳塞尖端深入插入耳道内。插入后，泡沫耳塞应膨胀以填满耳道内的空间。调整猫的位置，使其头部在三通道射频线圈内处于适当位置，并使用吸音减震记忆泡沫固定头部。务必在耳朵周围放置泡沫，以进一步减弱扫描仪的噪声。现在用塑料气泡隔热膜将猫的躯体包裹起来，然后固定并运送雪橇至扫描仪床。连接输液管、麻醉输送管路及监测设备至猫。同时，将耳机连接到穿透面板上附带的耳机电缆组件。以0.6毫克/千克/小时的基础流速开始氯胺酮输注。然后根据麻醉深度按需增加流速。异氟烷的初始剂量设为0.5%，在完成解剖扫描后将其降低至0.4%。在整个实验过程中，使用位于扫描仪适当距离处的磁共振兼容监测设备，监测并记录猫的血氧饱和度、呼气末二氧化碳水平、心率、呼吸频率和直肠温度。心率和呼吸频率的持续升高通常与即将从麻醉中恢复相关。首先，使用快速成像序列并按照屏幕上显示的成像参数，以轴向切片方向采集猫脑的解剖参考扫描图像。解剖扫描的持续时间应约为六分钟。接下来，采用分段交错式回波平面成像序列，并根据屏幕上显示的成像参数设置功能成像。在呈现宽带白噪声刺激的同时开始图像容积采集。采用区组设计，听觉刺激应持续播放30秒，并与32秒的静音基线条件交替进行。重复此步骤，直至在听觉皮层观察到声学诱发的BOLD活动。采用区组设计时，每次功能扫描的持续时间应约为4.5分钟，采集90个体积像。根据实验需求呈现刺激并完成预定次数的功能扫描。磁共振扫描结束后，将猫从扫描架上移除。在动物完全恢复之前，持续使用加热垫和毛巾提供辅助加热。一旦咽反射恢复，即移除气管插管。持续监测猫直至翻正反射恢复。然后将动物送回饲养设施。在实验操作后的第二天对动物进行评估，以确保实验未对其造成不良影响。实验结束后，选择合适的fMRI分析软件（如SPM或FSL）来处理所获得的功能像数据。在此，我们可以观察到两个动物在区块化呈现第32次宽带噪声刺激时出现明显的激活。设计宽带噪声与基线对比的T统计图。在两个图像切片平面上，显示出听觉皮层中双侧声学诱发活动的连续簇状区域。这些图显示了在单次功能扫描过程中，所标注体素内 BOLD 信号的变化情况。在此我们可以看到，BOLD 反应的事件相关平均时间进程已归一化至平均 BOLD 基线信号。在这些示例中，BOLD 信号在刺激开始后 3 至 6 秒内相对于基线出现显著升高。在进行该操作过程中，密切监测猫的生理参数至关重要，以确保在整个操作期间维持稳定的麻醉状态。观看本视频后，您应能够充分掌握如何开展功能性磁共振成像实验，以研究麻醉状态下听觉皮层的功能。请务必注意，操作磁共振成像设备可能存在潜在危险。进行此操作时，务必确保相关人员已接受适当筛查，实验装置与磁共振成像设备兼容，且监测设备为磁共振安全设备，或已放置在距磁体的安全距离之外。

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