Name: 鉴定 13C-二甲基 N-末端胺对还原甲基化蛋白的 NMR 共振的方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-12T13:45:00.000+00:00
Duration: 13 min 59 s
Description: 学习利用pH选择性还原甲基化与氨肽酶降解两种方法，对溶菌酶N端赖氨酸的α和ε位二甲基胺NMR信号进行归属。该技术可明确解析蛋白质N端修饰位点的核磁共振共振峰。

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本研究获得了美国国立卫生研究院研究资源中心资助编号R00RR024105的支持。

1. 溶菌酶的还原甲基化
<ol>
	<li>配制 500 ml 50 mM 的磷酸钠缓冲液（pH 7.5）。室温保存。</li>
	<li>标记三个 1 ml 微量离心管，分别用于完全标记样品（FLS）、低 pH 部分标记样品（LpH）和高 pH 部分标记样品（HpH）。</li>
	<li>称取 10 mg 溶菌酶，溶于 2 ml 磷酸钠缓冲液中，制成浓度为 5 mg/ml 的水溶液。&#160;用铝箔覆盖管口，防止甲醛因光照而降解。向每根管中加入 500 μl 溶菌酶溶液。</li>
	<li>新鲜配制 1.0 M 的二甲胺硼烷复合物（DMAB）和 13C-甲醛溶液。0 °C 下保存。</li>
	<li>对于完全标记样品，采用 1:10 的摩尔比（反应性胺基 : 甲醛）；对于部分标记样品，采用 1:5 的摩尔比。也可根据需要优化该比例。例如，为了在低 pH 条件下突出 α-13C-二甲胺峰，需使用 2:7 的比例。</li>
	<li>向 FLS 中加入 6.1 μl 1.0 M DMAB，向 LpH 和 HpH 中各加入 3.2 μl 1.0 M DMAB，并轻轻涡旋混匀。然后向 FLS 中加入 12.3 μl 1.0 M 13C-甲醛，向 LpH 和 HpH 中各加入 6.1 μl 1.0 M 13C-甲醛。将反应混合物在 4 °C 下振荡反应 2 小时。</li>
	<li>按上一步相同体积再次加入 1.0 M DMAB 和 13C-甲醛，继续在 4 °C 下振荡过夜，总反应时间为 18–24 小时。</li>
	<li>通过离心过滤器（分子量截留值 3 kDa）将样品缓冲液置换为 pH 7.5 的磷酸盐缓冲液，以去除过量试剂和副产物。</li>
	<li>对于部分标记样品，在 pH 7.5 条件下使用天然丰度甲醛进行还原性甲基化，以获得均一修饰的蛋白质。重新配制 1.0 M 的 DMAB 和天然丰度甲醛溶液。</li>
	<li>用铝箔覆盖样品管，向 LpH 和 HpH 中各加入 6.1 μl DMAB，并轻轻涡旋混匀。然后加入 12.3 μl 天然丰度甲醛。将反应混合物在 4 °C 下振荡 2 小时。</li>
	<li>按上一步相同体积再次加入 1.0 M DMAB 和天然丰度甲醛，继续在 4 °C 下振荡过夜，总反应时间为 18–24 小时。随后按照步骤 2.5–2.6&#160;进行缓冲液置换，并将 50 μg 样品于 -20 °C 保存用于质谱分析。</li>
</ol>
2. 准备用于核磁共振分析的样品
<ol>
	<li>在 H 中配制 pH 8.5 的 2.0 M 硼酸钠缓冲液2O.</li>
	<li>向四个15 ml锥形管中各加入375 μl的2.0 M硼酸钠缓冲液溶液。用Parafilm封口膜封住管口并戳孔。将烧瓶放入冻干瓶中，冷冻样品。</li>
	<li>将冷冻样品置于冻干机中干燥。干燥完成后取出。</li>
	<li>使用移液器加入15 ml的D2向每根试管中加入 O 并混匀。</li>
	<li>标记三个 4 ml 离心过滤管（分子量截留值 3 kDa），分别标注为 FLS、LpH 和 HpH。向各滤管中加入相应的样品（约 500 μl）。向每根管中加入 3.0 ml pH 8.5 的 50 mM 硼酸钠缓冲液。为第三根管配制平衡管，然后使用配备 35° 固定角转子的离心机在 4 °C、7,500 rcf 条件下将样品浓缩至 500 μl。</li>
	<li>清空每个滤器下方的收集管。向样品中再加入 3.0 ml 缓冲液，再次将样品浓缩至 500 μl。重复步骤 2.5&#160;4x</li>
	<li>使用二辛可宁酸（BCA）蛋白质测定法36，测定每个样品的浓度。用50 mM硼酸钠缓冲液将溶菌酶样品稀释至150 μM。</li>
	<li>将530 μl转移至一支5 mm核磁共振管，或将250 μM转移至一支5 mm磁化率匹配管。</li>
	<li>制备80 mM的1,2-二氯乙烷储备液13C2 在 D 中2O. 将该储备液于 -80 °C 保存。使用时稀释至 24 mM，体积为 80 μl，转移至同轴插入管中，作为核磁共振（NMR）分析的参比样品。用 NMR 分析样品。注意：运行 1D 1H-13C HSQC 并对每个共振峰进行积分。对于完全标记的样品，峰面积应相同。</li>
</ol>
3. 溶菌酶的氨肽酶降解
<ol>
	<li>在超纯水中配制浓度为 5 mg/ml 的溶菌酶溶液。</li>
	<li>取 250 μl 溶菌酶溶液加入洁净的 1 ml 离心管中。</li>
	<li>加入 25 μl 0.1 M 的三（羟甲基）氨基甲烷-乙酸缓冲液（tricine 溶液，pH 8.0）和 6 μl 浓度为 2.16 μg/ml 的 Aeromonas proteolytica 氨肽酶溶液。</li>
	<li>在 37 °C 下孵育 6 小时。</li>
	<li>向样品中再加入 6 μl 浓度为 2.16 μg/ml 的氨肽酶溶液，使氨肽酶与溶菌酶的摩尔比达到 1:50。在 37 °C 下继续孵育 20 小时。</li>
	<li>使用 C18 离心柱对 30 μl 样品进行脱盐处理（遵循制造商的操作说明）。将脱盐后的样品于 -20 °C 保存，用于 MALDI 质谱分析。</li>
	<li>按照方案&#160;2) 中所述方法，将剩余的蛋白质样品制备用于核磁共振（NMR）分析。</li>
</ol>
4. 准备质谱样品
<ol>
	<li>使用步骤 2.3 中保留的 50 μg 样品，将其缓冲液置换为 100 mM 碳酸氢铵（pH 8.0），并使用 1 ml 离心过滤器（3 kDa 分子量截断值）浓缩至约 50 μl。将样品转移至 1 ml 离心管中，并用铝箔包裹。</li>
	<li>加入 2.0 μl 的 500 mM 二硫苏糖醇以还原二硫键。将溶液在 60 °C 下孵育 1 小时。</li>
	<li>加入 2 μl 新鲜配制的 500 mM 碘乙酰胺以烷基化巯基。在室温下孵育 20 分钟。</li>
	<li>移除铝箔，加入 1.0 μl 的 500 mM 二硫苏糖醇溶液以终止反应。</li>
	<li>加入 2.0 μg 的测序级胰蛋白酶以消化蛋白质。将混合物在 37 °C 下孵育 16–24 小时。</li>
	<li>加入三氟乙酸（TFA）直至 pH 小于 2，以终止消化反应。（也可使用甲酸或乙酸）</li>
	<li>在 C18 旋转柱上对样品进行脱盐，并用 80% 乙腈/0.1% TFA 洗脱蛋白质。使用真空浓缩仪将样品干燥。</li>
	<li>将样品重新溶解于 5.0 μl 的 50% 乙腈/0.1% TFA 中，用于基质辅助激光解吸电离质谱（MALDI MS）分析。在 MALDI 目标板上，将重悬后的样品与等体积的饱和 2,5-二羟基苯甲酸基质溶液混合。在 MALDI 质谱仪上分析样品。注意：使用串联质谱（tandem MS）确认肽段峰的身份。对质谱图进行平滑处理并分析。对于每个含二甲胺的肽段，测定其同位素峰图中各同位素峰的峰强度和峰面积。按照先前所述方法34计算 13C 掺入百分比。</li>
</ol>

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指派还原性 13C-甲基化蛋白质对于充分使用这种同位素标记方法是必要的。利用质谱（MS）通过部分信号的相关性来辅助核磁共振（NMR）信号的归属 13C-结合数据是一种颇具前景的技术。该技术相较于其他指认方法的优势在于仅需蛋白质的一级氨基酸序列。质谱辅助的指认方法在以下情况下存在局限性：当 N-末端氨基酸是赖氨酸，因为 13α-二甲胺和ε-二甲胺的碳同位素掺入无法通过质谱法单独测定。滴定实验通常显示α-二甲胺化学位移具有pH依赖性，但盐桥及其他结构因素使化学位移成为一种不可靠的归属方法。采用本文所述方法不仅解决了这一问题，还避免了测定各个位点的困难 13C %-掺入率用于α-和ε-二甲基氨基肽的质谱分析。由于一个位点被标记，因此 13C %-掺入可直接通过质谱法（MS）测量。由于此前仅使用平均值，赖氨酸1（Lys1）的α-和ε-二甲胺化修饰的归属存在歧义。 13C %-掺入量的测定34采用pH和氨肽酶方法，可直接指定α-和ε-二甲基胺峰，其结果与其他研究者的指定结果一致...

核磁共振（NMR）波谱法是蛋白质结构解析的重要工具1核磁共振波谱法可用于测定蛋白质在天然状态下的溶液结构。为了克服稳定磁性同位素天然丰度低的问题，有必要引入 13C 和 15N 引入目标蛋白。最常用的方法是在细菌宿主中进行重组表达。2-3然而，使用细菌宿主进行过表达有两个缺点：无法产生翻译后修饰，且并非对所有蛋白质都有效。3-4当细菌表达无法作为蛋白质生产的可行途径时，可采用非细菌宿主进行过表达，但同位素标记困难且成本较高5替代表达方法用于整合 13C 和 15用于核磁共振分析的蛋白质氮同位素标记包括利用甲基标记的代谢前体进行稀疏标记的技术6 和单个 13C, 15N 氨基酸7-9一种本文所采用的稀疏标记化学方法是成熟的还原性 13C-甲基化反应（图1），其中蛋白质上的伯氨基—— N-末端α-氨基和赖氨酸侧链的ε-氨基被甲基化。一旦生成单甲基胺，由于其更高的pKa值，氨基易于再次发生甲基化，形成二甲基胺。
还原性甲基化最初由 Means 和 Feeney 提出，作为一种化学修饰蛋白质的方法10该反应的优点在于其广泛的适用性，以及在缓冲的生理pH值和低温条件下即可进行的温和反应条件。11,12.&#160;在甲醛和还原剂（如二甲基胺硼烷复合物（DMAB））存在下，赖氨酸的ε-氨基基团以及 N-末端α-氨基被选择性甲基化，生成二甲基化胺。尽管已知甲醛可通过形成亚甲基桥交联蛋白质，但该过程会被还原剂阻断13,14.
还原性甲基化已成功用于核磁共振（NMR）和X射线晶体学研究蛋白质。还原性甲基化可用于促进难以结晶的蛋白质的结晶过程15。鸡蛋清溶菌酶是首个以二甲基化形式实现结晶的蛋白质。甲基化与非甲基化溶菌酶结构中重原子的均方根偏差为0.40 Å16。该比较表明，蛋白质结构在还原性甲基化后仍可保持不变，因此该反应可作为一种有效的标记工具用于结构解析。
利用13C标记的甲醛进行还原性甲基化反应，可生成13C-二甲基化胺类化合物。13C-二甲基胺是可通过核磁共振（NMR）检测的探针，已被广泛用于研究蛋白质的动力学、结构与功能。核磁共振与还原性13C-甲基化技术已被应用于研究β2肾上腺素受体17、核糖核酸酶A18、溶菌酶19, fd基因5号蛋白20以及细胞色素c21的蛋白质-配体及蛋白质-蛋白质相互作用。类似地，还原性13C-甲基化的核糖核酸酶A22、溶菌酶23、fd基因5号蛋白24、Clostridium pasteurianum铁氧还蛋白25、IgG的Fc片段26、载脂蛋白A-I27，&#160;以及MIP-1α28的结构与功能特性也已被研究。13C-二甲基氨基基团的动力学特性已在刀豆蛋白A29-30和钙调蛋白31上进行了研究。
尽管是还原性的 13C-甲基化已广泛用于通过核磁共振（NMR）研究蛋白质，但该标记方法始终受限于NMR共振信号归属的困难26. 大多数用于还原性标记的分配策略 13C-甲基化蛋白依赖于少量的位点，20,28 已知的结构特性11,19,23,26,31,32或大规模的基因改造33这些研究均未能成功地将所有 13除钙调蛋白研究外，C-二甲胺峰均被指认，而在钙调蛋白研究中，各赖氨酸位点通过定点突变进行峰的归属33在研究MIP-1α二聚体形成过程中，采用质谱法（MS）辅助完成还原性条件下NMR信号的归属 13C-甲基化胺类最早有报道28. 基质辅助激光解吸电离飞行时间（MALDI-TOF）质谱用于鉴定二聚体界面处的赖氨酸。通过质谱鉴定了人MIP-1α胰蛋白酶肽段中部分甲基化的赖氨酸，并将其与完整蛋白在二维核磁中观察到的单甲基胺和二甲基胺信号的出现相关联。 1H-13C HSQC NMR 谱28我们课题组拓展了质谱技术的应用，并提出了一种分配方法，该方法仅需蛋白质的氨基酸序列信息，无需其结构或其他性质的先验知识。34该方法适用于大多数蛋白质，但有一种例外情况，即当蛋白质具有一个 N-末端赖氨酸，因为质谱同位素图谱显示 N末端赖氨酸 α- 和 ε-13二甲基胺类化合物无法被独立测定。
本文介绍了两种方法，一种为化学法，另一种为酶法，用于鉴定 N末端α-二甲基胺和侧链ε-二甲基胺位点 N-末端赖氨酸残基。第一种方法受到Córdova的启发 等&#160;利用pH控制蛋白质乙酰化选择性的人35反应倾向于 N在低pH下检测末端α-氨基，高pH下检测侧链ε-氨基，从而在其研究中利用毛细管电泳区分蛋白质的α-和ε-氨基基团35我们展示了如何利用高pH和低pH条件，通过还原性方法改变蛋白质氨基的标记。 13C-甲基化反应，并允许应用质谱辅助的归属策略。第二种归属方法 N-末端α-和ε-13C-二甲胺利用了选择性去除的特性 N-末端残基使用重组 Aeromonas proteolytica 氨肽酶

<table><tbody><tr><td>乙腈</td><td>Sigma</td><td>34851</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra 4 ml 离心滤膜（3k MWCO）</td><td>Fisher Scientific</td><td>UFC800308 (8pk)</td><td></td></tr><tr><td>氨肽酶</td><td>Creative Biomart</td><td>Aminopeptidase-86A</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢铵</td><td>Sigma</td><td>A6141</td><td></td></tr><tr><td>硫酸铵</td><td>Sigma</td><td>A5132</td><td></td></tr><tr><td>硼烷-二甲胺复合物</td><td>Sigma</td><td>180238</td><td>使用前新鲜配制 1 M 溶液。</td></tr><tr><td>硼酸</td><td>Sigma</td><td>B6768</td><td></td></tr><tr><td>牛胰岛素</td><td>Sigma</td><td>I5500</td><td></td></tr><tr><td>C18 离心柱</td><td>Thermo Scientific</td><td>89870</td><td></td></tr><tr><td>重水</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>DLM-4-100</td><td></td></tr><tr><td>1,2-二氯乙烷-&lt;sup&gt;13&lt;/sup&gt;C&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>714321</td><td>80 mM 储存液，保存于 -80 &amp;deg;C。NMR 谱图中以 24 mM 作为参考。</td></tr><tr><td>甲醛（36.5% wt/wt）</td><td>Sigma</td><td>33220</td><td>使用前新鲜配制 1 M 溶液。</td></tr><tr><td>&lt;sup&gt;13&lt;/sup&gt;C-甲醛（99%）</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>CLM-806-1</td><td>使用前新鲜配制 1 M 溶液。</td></tr><tr><td>溶菌酶（鸡蛋清来源）</td><td>Sigma</td><td>L6376</td><td></td></tr><tr><td>磷酸钠（七水合二碱）</td><td>Sigma</td><td>S9390</td><td></td></tr><tr><td>磷酸钠（单碱）</td><td>Sigma</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>Tricine</td><td>Sigma</td><td>T0377</td><td></td></tr><tr><td>三氟乙酸</td><td>Sigma</td><td>302031</td><td></td></tr><tr><td>700 MHz Varian VNMRS 配备 5 mm HCN 5922 探头</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bruker UltrafleXtreme MALDI TOF/TOF</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

用于鉴定还原甲基化蛋白质n端二甲基胺13c标记核磁共振信号的方法

Methods to Identify the NMR Resonances of the 13C-Dimethyl N-terminal Amine on Reductively Methylated Proteins

核磁共振（NMR）波谱法是研究蛋白质结构与动力学的成熟技术。利用NMR研究蛋白质时，通常通过代谢方式引入稳定的磁性同位素，以提高检测灵敏度并实现共振信号的序列归属。还原性13C-甲基化是一种替代性蛋白质标记方法，适用于那些难以通过细菌宿主过表达（同位素标记最常用的方法）进行标记的蛋白质。还原性13C-甲基化是一种在温和条件下进行的化学反应，可将蛋白质的伯氨基（赖氨酸的ε-氨基以及N-末端的α-氨基）修饰为13C-二甲氨基基团。大多数蛋白质的结构与功能在该修饰后保持不变，因此该方法是代谢标记的一种可行替代方案。由于还原性13C-甲基化引入的是稀疏分布的同位素标记，传统的NMR信号归属方法不再适用。为此，已开发出一种结合质谱法（MS）辅助完成蛋白质13C-二甲胺NMR信号归属的替代方法。该方法依赖于每个伯氨基上不同程度的部分13C-标记。当蛋白质的N-末端残基为赖氨酸时，该方法存在一个局限性，即Lys1的α-和ε-二甲氨基基团无法通过质谱单独测定。为克服这一局限，本文描述了两种方法，用于鉴定与N-末端α-胺和侧链ε-胺相关的13C-二甲胺的NMR共振信号。在1H-13C异核单量子相干谱中，成功识别了鸡蛋清溶菌酶Lys1的N-末端α-二甲胺和侧链ε-二甲胺的NMR信号。

还原甲基化与 pH
pH诱导的化学选择性还原 13C-甲基化反应已在溶菌酶上得到验证。在低pH条件下，该反应更倾向于 N-末端α-氨基相较于侧链ε-氨基，反之亦然，在高pH条件下。在溶液中，蛋白质的氨基在游离胺与共轭酸之间存在平衡，该平衡可通过pH调节。此反应的最佳pH范围取决于所用还原剂。本例中，二甲基胺硼烷的最佳pH为7.0–9.0。在还原剂的最佳范围之外进行反应虽会降低反应效率，但在此情况下反而成为优势。还原甲基化反应优先修饰 N- 在 pH 6.0 时由于较低的酸解离常数（pK）而导致的末端 α-胺基aα-氨基的（~7）23 与ε-氨基（约10个）相比32在 pH 6.0 时，平衡显著向有利于共轭酸的方向移动；此时 α-氨基以游离胺形式存在，浓度最高，是还原甲基化反应中的活性形式。在 pH 10.0 时，平衡则有利于游离胺。尽管 α-氨基的 pK 值较低a 几乎完全以游离胺形式存在，ε-氨基为更强的碱且更具反应性。在限量存在的情况下 <...

两种用于指定还原性α-和ε-二甲胺核磁共振信号的方法 13C-甲基化 N-末端赖氨酸的描述。一种方法利用还原性甲基化反应的pH诱导选择性，另一种方法使用氨肽酶选择性去除 N末端赖氨酸

用于鉴定还原甲基化蛋白质N端二甲基胺13C标记核磁共振信号的方法

核磁共振（NMR）波谱学是研究蛋白质结构与动力学的成熟技术。利用NMR研究蛋白质需要稳定的磁场……

本实验的总体目标是确定溶菌酶末端赖氨酸残基的α碳和ε碳。13-二甲基胺核磁共振信号。该目标通过以下步骤实现：首先在低pH和高pH条件下，使用亚化学计量的碳13标记甲醛对溶菌酶进行还原性甲基化。第二步是使用过量的天然丰度甲醛对低 pH 和高 pH 样品进行还原性甲基化，以完成甲基化反应。最后一步是将还原性甲基化后的样品置换到 D₂O 缓冲液中，用于核磁共振（NMR）分析。在第二种方法中，通过溶菌酶样品的氨基肽酶降解来实现该目标。第二步是使用过量的碳13标记甲醛对截短的蛋白质样品进行还原性甲基化，随后更换缓冲液以进行核磁共振（NMR）分析。最终通过核磁共振波谱检测碳13甲基共振信号的缺失，从而完成信号归属。该技术相较于现有方法的主要优势在于，能够明确指认蛋白质内部赖氨酸的α位和SSON二甲基胺以及ML共振信号。取三个1毫升微量离心管，分别标记为F-L-S-L-P-H和HPH，将三份溶菌酶样品分别溶解于先前配制好的pH为6、7.5和10的缓冲溶液中，使其终浓度为每毫升5毫克。用铝箔覆盖试管，以防止光照导致降解。随后，向 FLS 试管中加入 6.1 µL 已预先配制的一摩尔二甲基胺硼烷复合物溶液，向 LPH 和 HPH 试管中各加入 3.2 µL 该溶液。轻轻涡旋混匀后，向 FLS 样品中加入 12.3 µL 已预先配制的一摩尔碳-13 甲醛溶液，向 L-P-H-N-H-P-H 样品中各加入 6.1 µL 该溶液。将反应混合物在 4 摄氏度下振荡两小时。通过向相应的试管中加入等量的 DMAB 和碳 13 甲醛，重复之前的步骤。将反应混合物在 4 摄氏度下振荡过夜，使总反应时间达到 18 至 24 小时。振荡结束后，使用截留分子量为 3 千道尔顿的离心过滤器，将每个样品的缓冲液置换为 3 毫升 pH 7.5 的磷酸盐缓冲液，以去除过量的试剂和副产物，然后在 4 摄氏度下使用带有 35 度固定角转子的离心机以 7,500 RCF 离心，将样品浓缩至 500 微升。按照上述步骤重复操作两次。用铝箔覆盖部分标记的样品管，并向其中加入 6.1 µL 新鲜配制的 1 M DMAB 溶液。样品涡旋混匀后，向试管中加入 12.3 µL 新鲜配制的 1 M 天然丰度甲醛溶液。将反应混合物在 4 摄氏度下振荡两小时。加入与上一步相同等分的 DMAB 和天然丰度甲醛，并在 4 摄氏度下继续振荡反应混合物过夜，缓冲液置换后总反应时间为 18 至 24 小时，所用缓冲液为 50 毫摩尔磷酸钠缓冲液。取每份样品 10 微升等分试样转移至洁净的微量离心管中，并将样品在 -20 摄氏度下保存，用于 MALDI 质谱分析。接下来，向四个15毫升的锥形管中各加入375微升预先配制的2摩尔硼酸钠缓冲液。用帕拉膜封住管口，并在帕拉膜上戳几个小孔。将这些管子放入冻干瓶中，并冷冻样品。样品冷冻后，将其从冻干机

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Research

科研

JoVE Journal

Chemistry

化学

鉴定还原甲基化蛋白上13C-二甲基氮端胺的核磁共振共振的方法

通过还原性二甲基化对肽段进行稳定同位素标记（ReDi 标记）是一种快速、经济的基于质谱的定量蛋白质组学准确分析策略。本文展示了一种利用 ReDi...

使用还原性二甲基化进行稳定同位素标记的定量蛋白质组学

许多神经系统和全身性疾病会改变哺乳动物大脑的神经化学特性。通过脑组织粗提物，可高效获得特征性的脑代谢物谱。为此，采用高分辨率核磁共振波谱法，能够对代谢物浓度（代谢组学）进行详细的定量分析。...

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本文介绍了一种利用核磁共振波谱法（NMR）鉴定内在无序蛋白多位点磷酸化的方法，并以Tau蛋白为例进行说明。重组Tau蛋白经同位素标记并修饰 体外...

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蛋白质精氨酸（R）甲基化是一种广泛存在的翻译后修饰，可调控多种生物通路。当与修饰肽富集的生物化学方法相结合时，质谱技术是全局分析R-甲基化蛋白质组的最佳手段。本文描述了在人类细胞中高置信度鉴定全局R-甲基化的实验流程。...

一种基于质谱的蛋白质组学方法用于全局且高置信度的蛋白质精氨酸甲基化分析

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本文介绍了一种应用顺磁弛豫增强核磁共振波谱法检测内在无序蛋白中弱且瞬时的分子间和分子内相互作用的实验方案。...

利用顺磁弛豫增强技术检测和表征内在无序蛋白的自关联行为

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利用核磁共振波谱技术探索精氨酸甲基化修饰组

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解析糖-蛋白质相互作用：核磁共振（NMR）大显身手

肽-金属配合物结构与配位测定的1D与2D 1H NMR方法

学习利用pH选择性还原甲基化与氨肽酶降解两种方法，对溶菌酶N端赖氨酸的α和ε位二甲基胺NMR信号进行归属。该技术可明确解析蛋白质N端修饰位点的核磁共振共振峰。

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