鉴定 13C-二甲基 N-末端胺对还原甲基化蛋白的 NMR 共振的方法

该程序的总体目标是分配 α 和 ε 碳。13 二甲基胺末端赖氨酸的 NMR 共振，溶菌酶的残基。这是通过首先在低 pH 值和高 pH 值下用亚几何量的碳 13 甲醛对溶菌酶进行还原甲基化来实现的。

第二步是将自然丰度过高的低 pH 值和高 pH 值样品还原甲基化，使甲醛完成甲基化。最后一步是将还原甲基化样品缓冲液交换成 D 2 O 缓冲液，用于 NMR 分析。在第二种方法中，目标是通过溶菌酶样品的氨基肽酶降解来实现的。

第二步是用过量的碳 13 甲醛对截短的蛋白质样品进行还原甲基化，然后进行缓冲液置换以进行 NMR 分析。最终，NMR 波谱用于显示不存在碳 13 甲基共振以进行分配。与现有方法相比，该技术的主要优点是它允许明确分配 α 和 SSON 二甲基层联以及蛋白质内部赖氨酸的 ML 共振标记三个带有 F-L-S-L-P-H 和 HPH 的一毫升微量离心管将三个溶菌酶样品溶解在先前制备的 pH 值为 6 的缓冲溶液中， 7.5 和 10 的最终浓度为 5 毫克/毫升。

用铝箔覆盖管子，以防止它们因光照而降解。在此之后，将 6.1 微升先前制备的一摩尔二甲基胺钻孔复合物溶液添加到 FLS 管中，将 3.2 微升相同的溶液添加到 LPH 和 HPH 管中。轻轻涡旋混合物后，向 FLS 样品中加入 12.3 微升先前制备的 1 摩尔碳 13 甲醛溶液，向 L-P-H-N-H-P-H 样品中加入 6.1 微升相同的溶液。

在 4 摄氏度下摇动反应混合物 2 小时。重复前面的步骤，将相同等分试样的 DMAB 和碳 13 甲醛添加到相应的试管中。将反应混合物在 4 摄氏度下摇动过夜，总反应时间为 18 至 24 小时，振荡后将每个样品的缓冲液与 pH 值为 7.5 的 3 毫升磷酸盐缓冲液交换，以去除多余的试剂和副产物，使用截留分子量为 3 千道尔顿的离心机，使用带有 35 度固定角转子的离心机在 4 摄氏度和 7 摄氏度下浓缩至 500 微升， 500 RCF。

在此之后重复前面的步骤两次。用铝箔覆盖部分标记的样品管，并向其中加入 6.1 微升新鲜制备的一摩尔 DMAB 溶液。样品涡旋后，向试管中加入 12.3 微升新鲜制备的 1 摩尔天然丰度甲醛溶液。

在 4 摄氏度下摇动反应混合物 2 小时。加入与上一步相同的 DMAB 和天然丰度甲醛等分试样，并在 4 摄氏度下摇动反应混合物过夜，与 50 毫摩尔磷酸钠缓冲液交换缓冲液后，总反应时间为 18 至 24 小时。将每个样品的 10 微升等分试样转移到干净的微量离心管中，并将样品储存在零下 20 摄氏度用于 MALDI MS 分析。

接下来，将 375 微升先前制备的 2 摩尔硼酸钠缓冲溶液加入四个 15 毫升锥形管中。对管的顶部进行封口膜，并在封口膜上戳孔。将试管放入冻干瓶中并冷冻样品。

样品冷冻后，将烧瓶放在冻干机上晾干，然后从冻干机移液管中取出样品 15 毫升 D 2 O，并按照此标签混合，三个 4 毫升锥形管，其中包含离心过滤器，带 F-L-S-L-P-H 和 HPH。将每个样品的大约 500 微升添加到相应的过滤管中。然后加入 3 毫升 50 毫摩尔钠酸盐缓冲液。

向每个试管中加入 pH 值 8.5。使用带有 35 度固定角转子的离心机在 4 摄氏度和 7， 500 RCF 下将样品浓缩至 500 微升。清空每个过滤器下的捕集阱后，向样品中再加入 3 毫升缓冲液，并将其浓缩至 500 微升。

使用 bissy acid 蛋白测定重复前面的步骤四次。确定每个样品的浓度。用 50 毫摩尔钠空隙缓冲液稀释溶菌酶样品，得到 150 微摩尔的最终浓度。

接下来，将每个样品的 530 微升转移到 5 毫米 NMR 管中。然后制备 80 毫摩尔的碳 13 储备溶液，在 D 2 O 中标记 1 2 DI 氯乙烷，用 D 2 O 将溶液稀释至 24 毫摩尔，然后将其转移到同轴插入管中用作 NMR 参考。运行 A 后：一维质子碳 H-S-Q-C-N-M-R 积分每个共振的峰面积。

在超纯水中制备每毫升 5 毫克的溶菌酶溶液。将 250 μL 溶菌酶溶液转移到干净的 1 mL 离心管中。然后加入 25 微升 pH 值为 8 的 0.1 摩尔三方溶液和 6 微升 2 点 16 微克/毫升的溶液。

将 romanis 蛋白水解氨基肽酶溶液加入离心管。将混合物在 37 摄氏度下孵育 6 小时。孵育后，向样品中再加入 6 微升氨基肽酶溶液，得到 1 摩尔比的氨基肽酶，在 37 摄氏度下再孵育 20 小时。

然后，使用 C 18 离心柱对 30 μL 样品进行脱盐，并在每 0.1%TFA 的 80% ACEDONITE 试验中洗脱样品，将样品储存在零下 20 摄氏度。对于 maldi MS 分析，如前所述制备剩余的蛋白质样品进行 NMR，已在低 pH 值下对溶菌酶证明 pH 诱导的化疗选择性还原碳 13 甲基化反应。在高 pH 值下，反应更喜欢末端 α 胺而不是侧链ε胺，反之亦然，如 NMR 波谱所示。

在 pH 值为 10 时反应的溶菌酶样品没有峰 7，表明峰 1 至 6 属于ε二甲基氨基，峰 7 是末端 α 二甲基氨基。Alpha Amin 赞成还原碳。当碳 13 甲醛的用量降低到 2 比 7 的摩尔比时，在 pH 值为 6 时观察到 13 甲基化，并且样品没有进一步与天然丰度甲醛反应，如图所示，低 pH 值下的甲基化是单甲基胺和二甲基胺的混合物。

三个氨基显示碳 13 dim 甲基化，表明这些基团的反应速度比显示碳的基团快。三个碳的 13 单甲基 13 二甲基胺。峰 7 的强度最高，被指定为 N 端 α 二甲基胺基团，证实了峰 7 的分配。

使用样品在高 pH 值下反应，能够改变 N 末端 α 氨基的还原甲基化速率。可以应用用于分配 NMR 驻留的 MS 辅助方法。在 pH 值为 10 时被还原碳 13 甲基化的溶菌酶样品用胰蛋白酶消化并用 maldi TOF MS 分析，因为 α 氨基没有被还原碳 13 甲基化。

在这些条件下，四甲基化 N 末端肽的 MS 同位素谱可用于定量掺入 N 末端ε二甲基氨基的碳 13 的百分比。碳 13 标记的 DIM 甲基化 N 末端肽 6 6 2 给出了按比例缩放的碳百分比。13 掺入同一溶菌酶样品的 27% NMR 分析得出峰 6 碳 13 掺入 33% 的百分比，表明峰 6 是末端赖氨酸ε碳 13 二甲基胺 Maldi，未处理和氨基肽酶处理的溶菌酶样品的 TOF 质谱如图所示。

用作阳性对照的胰岛素与其天然形式 5731.2 相比，平均主电荷比较低。处理后的溶菌酶显示从 14305.8 到 13930.5 的变化，对应于溶菌酶、赖氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸的前三个末端残基的丢失。此处显示的是未处理和氨基肽酶处理的还原碳 13 甲基化溶菌酶样品与受控光谱相比的 NMR 光谱，氨基肽酶处理样品的光谱显示峰 6 和 7 的强度降低，另一个峰标记为 7 A从该数据中，峰 6 和 7 可以成对分配为赖氨酸， α 和 ε 二甲基胺。

在尝试此程序之前，重要的是要考虑蛋白质的溶解度、各种 ph 值，并相应地调整方案。