Name: 多不饱和脂肪酸的膳食补充剂秀丽隐杆线虫 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-29T16:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: 了解如何通过膳食补充多不饱和脂肪酸来改变秀丽隐杆线虫的脂肪酸组成，并使用气相色谱质谱联用技术进行分析。该方法有助于研究脂肪酸在发育和生理中的功能。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

感谢 Chris Webster 完成了代表性结果中图3所示的初步实验，感谢 Jason Watts 和 Chris Webster 对手稿提出的有益意见。本研究的资金由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目（R01DK074114）提供给 JLW。本研究中使用的一些线虫品系由线虫遗传学中心（Caenorhabditis Genetics Center）提供，该中心由 NIH 研究基础设施项目办公室（P40 OD010440）资助。

多不饱和脂肪酸对热、光和氧气敏感。因此，在制备脂肪酸补充培养板时需格外注意，避免脂肪酸暴露于过量的热和光条件下。含有0.1% Tergitol（NP-40）的NGM培养基经高压灭菌后部分冷却，随即在持续搅拌下加入脂肪酸钠盐。平板需在避光条件下晾干。随后可通过气相色谱法检测在这些平板上培养的C. elegans对脂肪酸的摄取情况。
1. 脂肪酸补充培养基的制备
<ol>
	<li>将培养基组分称量至适当大小的烧瓶中。每 1 L 加入 17 g Bacto-琼脂、2.5 g 胰蛋白胨、3 g NaCl、1 ml&#160;5 mg/ml 溶于乙醇的胆固醇，以及 10 ml&#160;10% 溶于水的Tergitol。</li>
	<li>加入最终所需体积 80% 的Millipore水，并将培养基连同空玻璃瓶（数量等于待测试的不同脂肪酸浓度数）以及合适的量筒一同灭菌。</li>
	<li>将培养基置于设定为 55 °C 的水浴中冷却。在培养基冷却的同时，采取安全防护措施打开玻璃小瓶，制备脂肪酸钠盐的工作液，确保玻璃碎屑不混入脂肪酸中。称取足量脂肪酸以配制 100 mM 的工作液。</li>
	<li>用纯化水将脂肪酸溶液调节至终浓度为 100 mM。脂肪酸钠盐完全溶解通常需要约 20–30 分钟。用氩气或氮气对脂肪酸工作液进行吹扫，因惰性气体可防止氧化。盖上瓶盖并将工作液避光保存，直至培养基冷却。</li>
	<li>（可选）若需制备RNAi培养基，此时称取氨苄青霉素和异丙基-β-D-硫代半乳糖苷 (IPTG) 溶液。</li>
	<li>当琼脂冷却至 55 °C 时，每 1 L 加入：1 ml 1 M MgSO4、1 ml 1 M CaCl2 和 25 ml 磷酸盐缓冲液（每 1 L 含 108.3 g KH2PO4 和 35.6 g K2HPO4，经高压灭菌）。若制备RNAi平板，则加入经滤膜除菌的氨苄青霉素和IPTG溶液。对于所有类型的平板，加入无菌水使培养基最终体积达到 1 L。</li>
	<li>在火焰旁将培养基转移至已灭菌且大小合适的量筒中，然后加入温热的无菌水至所需体积。再将培养基转移回初始烧瓶中，通过搅拌混合均匀。</li>
	<li>在火焰旁，使用已灭菌且大小合适的量筒，将培养基分装至若干个玻璃瓶中（数量等于待测试的浓度数）。将分装后的培养基置于水浴中保持液态，直至脂肪酸工作液完全溶解。</li>
	<li>取其中一瓶置于磁力搅拌器上，搅拌至培养基手感温热但不烫手。确保留有足够时间在培养基开始凝固前完成脂肪酸工作液的混匀和倒板操作。若搅拌器具有温度控制功能，将其设定为 55 °C。</li>
	<li>将 100 mM 脂肪酸工作液稀释至所需的终浓度。持续搅拌培养基，直至白色沉淀完全溶解（约 1 分钟）。之后培养基可能仍略显浑浊。</li>
	<li>（可选）若需制备RNAi培养基，将氨苄青霉素加入至终浓度 0.1 mg/ml，IPTG 加入至终浓度 2 mM。</li>
	<li>使用自动移液器和无菌 25 ml 移液管倒板，每 60 mm 培养皿加入 8 ml 培养基，每 100 mm 培养皿加入 25 ml 培养基。对剩余的玻璃瓶重复脂肪酸添加和倒板步骤。</li>
	<li>琼脂凝固后，用盒子盖住添加了脂肪酸的平板，或将其置于通风良好的抽屉中于室温避光保存，以防止光氧化。</li>
	<li>平板干燥两天后，接种 E. coli&#160;OP50。对于 60 mm 培养皿，加入 300 µl 过夜培养的OP50菌液（37 °C 培养）。若已制备RNAi平板，则在平板干燥四天后接种 300 µl RNAi细菌。由于不同实验室环境湿度差异，平板干燥时间可能需要相应调整。</li>
	<li>将平板置于黑暗环境中室温孵育，直至细菌菌膜完全干燥。</li>
</ol>
2. 通过补充二高-γ-亚麻酸诱导生殖细胞破坏
<ol>
	<li>C. elegans 在含有 0.3 mM DGLA (20:3n-6) 的培养板上生长后会因生殖细胞在幼虫期和成虫期均被破坏而出现不育现象。
	<ol>
		<li>通过用碱性次氯酸盐溶液处理产卵雌雄同体虫以制备同步化的 L1 幼虫群体（配制 10 ml&#160;溶液：0.5 ml&#160;5M NaOH、2.5 ml&#160;家用漂白剂和 7 ml&#160;H2O）。将产卵雌雄同体虫在此溶液中轻轻振荡，直至成虫溶解。卵将得以保留，并可通过低速离心收集沉淀。</li>
		<li>用 M9 缓冲液（3 g KH2PO4、6 g Na2HPO4、5 g NaCl、1 ml 1 M MgSO4，加 H2O 至 1 L；高压灭菌后加入 MgSO4）清洗卵悬液三次。为提供充足氧气，将卵重悬于 15 ml&#160;塑料管中，最终体积为 5 ml&#160;M9 缓冲液，并在摇床上振荡过夜。</li>
		<li>在接种 OP50 两天后，或铺 RNAi 细菌一天后，将 L1 幼虫转移至添加了 DGLA 的培养板中。将线虫在 20 °C 下培养三天，或直至其发育至成虫阶段。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>可使用解剖显微镜对成虫进行不育性评分，显微镜需具备足够高的放大倍数以观察子宫内发育中的胚胎。成功的生殖细胞丢失表现为子宫透明、无卵。</li>
	<li>也可通过固定并用核酸染料 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色来评估线虫。通过将线虫挑入载玻片凹槽中的一滴 M9 缓冲液即可实现快速 DAPI 染色9。
	<ol>
		<li>向凹槽中加入 1 ml 浓度为 0.2 ng/ml&#160;的 DAPI 95% 乙醇溶液，静置约 5 分钟。</li>
		<li>将线虫挑入载玻片上的一滴 VectaShield 封片剂中，然后加盖盖玻片。</li>
		<li>用封片剂密封盖玻片，并在 4 °C 黑暗条件下过夜孵育以获得最佳染色效果，但也可立即观察。使用配备紫外灯和滤光片的荧光显微镜观察生殖细胞核和发育中胚胎核的存在与否，并进行评分。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 通过气相色谱法确认脂肪酸的摄取
C. elegans 的总脂肪酸组成可通过生成脂肪酸甲酯（FAMEs），然后使用气相色谱法进行分离和定量来确定4。
<ol>
	<li>用清水将500–1,000条成虫从培养板上冲洗下来，并转移至一支硅化处理的13 mm × 100 mm玻璃螺口管中。</li>
	<li>让虫体依靠重力自然沉降，随后用玻璃巴斯德吸管尽可能吸除上清水相。</li>
	<li>用清水洗涤虫体一次，再尽可能吸除水分。</li>
	<li>通过加入1 ml&#160;含2.5% H2SO4的甲醇溶液，并在70 °C水浴中加热1小时，生成脂肪酸甲酯（FAMEs）。</li>
	<li>将试管从水浴中取出，冷却1分钟。</li>
	<li>加入1.5 ml&#160;水和0.25 ml&#160;正己烷，以萃取FAMEs。</li>
	<li>盖紧管盖并剧烈振荡。</li>
	<li>将试管放入台式临床离心机中，以最高速度离心1分钟&#160;，使正己烷与水相完全分离。</li>
	<li>将正己烷层（上层）小心转移至气相色谱（GC）小瓶内的插件中，注意避免带入任何水相。进行GC分析时，取1–2 μl溶于正己烷的FAMEs样品注入适合FAMEs分析的极性毛细管气相色谱柱。安捷伦7890气相色谱仪的进样口温度设为250 °C，载气流速为1.4 ml/min；色谱柱升温程序设定为初始温度130 °C，保持1分钟；随后以10 °C/min升温至190 °C，再以5 °C/min升温至210 °C，并保持1分钟。</li>
	<li>为确认DGLA已被摄取，应采用火焰离子化检测器（FID）或质谱（MS）检测FAMEs，并使用标准品对照鉴定C. elegans脂肪酸的组成。</li>
</ol>

<ol><li>Haeggstrom, J. Z., Funk, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipoxygenase+and+leukotriene+pathways%3A+biochemistry%2C+biology%2C+and+roles+in+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Rev%22%5BJournal%5D)">Lipoxygenase and leukotriene pathways: biochemistry, biology, and roles in disease.</a> Chem. Rev. 111, 5866-5898 (2011).</li>
<li>de Lorgeril, M., Salen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+health+effects+of+dietary+saturated+and+omega-6+and+omega-3+polyunsaturated+fatty+acids%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Med%22%5BJournal%5D)">New insights into the health effects of dietary saturated and omega-6 and omega-3 polyunsaturated fatty acids.</a> BMC Med. 10, 50(2012).</li>
<li>Spychalla, J. P., Kinney, A. J., Browse, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+an+animal+omega-3+fatty+acid+desaturase+by+heterologous+expression+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Identification of an animal omega-3 fatty acid desaturase by heterologous expression in Arabidopsis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 1142-1147 (1997).</li>
<li>Watts, J. L., Browse, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+dissection+of+polyunsaturated+fatty+acid+synthesis+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Genetic dissection of polyunsaturated fatty acid synthesis in Caenorhabditis elegans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 5854-5859 (2002).</li>
<li>Watts, J. L., Phillips, E., Griffing, K. R., Browse, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deficiencies+in+C20+Polyunsaturated+Fatty+Acids+Cause+Behavioral+and+Developmental+Defects+in+Caenorhabditis+elegans+fat-3+Mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Deficiencies in C20 Polyunsaturated Fatty Acids Cause Behavioral and Developmental Defects in Caenorhabditis elegans fat-3 Mutants.</a> Genetics. 163, 581-589 (2003).</li>
<li>Kahn-Kirby, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+Polyunsaturated+Fatty+Acids+Drive+TRPV-Dependent+Sensory+Signaling+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Specific Polyunsaturated Fatty Acids Drive TRPV-Dependent Sensory Signaling In Vivo.</a> Cell. 119, 889-900 (2004).</li>
<li>Brock, T. J., Browse, J., Watts, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+regulation+of+unsaturated+fatty+acid+composition+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Genetic regulation of unsaturated fatty acid composition in C. elegans.</a> PLoS Genet. 2, e108(2006).</li>
<li>Webster, C. M., Deline, M. L., Watts, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+response+pathways+protect+germ+cells+from+omega-6+polyunsaturated+fatty+acid-mediated+toxicity+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Stress response pathways protect germ cells from omega-6 polyunsaturated fatty acid-mediated toxicity in Caenorhabditis elegans.</a> Dev. Biol. 373, 14-25 (2013).</li>
<li>Kadyk, L. C., Lambie, E. J., Kimble, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((glp-3+is+required+for+mitosis+and+meiosis+in+the+Caenorhabditis+elegans+germ+line%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">glp-3 is required for mitosis and meiosis in the Caenorhabditis elegans germ line.</a> Genetics. 145, 111-121 (1997).</li>
<li>Watts, J. L., Browse, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dietary+manipulation+implicates+lipid+signaling+in+the+regulation+of+germ+cell+maintenance+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Dietary manipulation implicates lipid signaling in the regulation of germ cell maintenance in C. elegans.</a> Dev. Biol. 292, 381-392 (2006).</li>
<li>Pryor, W. A., Stanley, J. P., Blair, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoxidation+of+polyunsaturated+fatty+acids%3A+II.+A+suggested+mechanism+for+the+formation+of+TBA-reactive+materials+from+prostaglandin-like+endoperoxides%5BTitle%5D)+AND+%22Lipids%22%5BJournal%5D)">Autoxidation of polyunsaturated fatty acids: II. A suggested mechanism for the formation of TBA-reactive materials from prostaglandin-like endoperoxides.</a> Lipids. 11, 370-379 (1976).</li>
<li>Kniazeva, M., Shen, H., Euler, T., Wang, C., Han, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+maternal+phospholipid+composition+and+IP%283%29-dependent+embryonic+membrane+dynamics+by+a+specific+fatty+acid+metabolic+event+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Regulation of maternal phospholipid composition and IP(3)-dependent embryonic membrane dynamics by a specific fatty acid metabolic event in C. elegans.</a> Genes Dev. 26, 554-566 (2012).</li>
<li>Edmonds, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin%2FFOXO+signaling+regulates+ovarian+prostaglandins+critical+for+reproduction%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Insulin/FOXO signaling regulates ovarian prostaglandins critical for reproduction.</a> Dev. Cell. 19, 858-871 (2010).</li>
<li>O'Rourke, E. J., Kuballa, P., Xavier, R., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((omega-6+Polyunsaturated+fatty+acids+extend+life+span+through+the+activation+of+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">omega-6 Polyunsaturated fatty acids extend life span through the activation of autophagy.</a> Genes Dev. 27, 429-440 (2013).</li>
<li>Taubert, S., Van Gilst, M. R., Hansen, M., Yamamoto, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Mediator+subunit%2C+MDT-15%2C+integrates+regulation+of+fatty+acid+metabolism+by+NHR-49-dependent+and+-independent+pathways+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A Mediator subunit, MDT-15, integrates regulation of fatty acid metabolism by NHR-49-dependent and -independent pathways in C. elegans.</a> Genes Dev. 20, 1137-1149 (2006).</li>
<li>Lesa, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+chain+polyunsaturated+fatty+acids+are+required+for+efficient+neurotransmission+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Long chain polyunsaturated fatty acids are required for efficient neurotransmission in C. elegans.</a> J. Cell Sci. 116, 4965-4975 (2003).</li>
<li>Brock, T. J., Browse, J., Watts, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatty+acid+desaturation+and+the+regulation+of+adiposity+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Fatty acid desaturation and the regulation of adiposity in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 176, 865-875 (2007).</li>
<li>Goudeau, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatty+acid+desaturation+links+germ+cell+loss+to+longevity+through+NHR-80%2FHNF4+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Fatty acid desaturation links germ cell loss to longevity through NHR-80/HNF4 in C. elegans.</a> PLoS Biol. 9, e1000599(2011).</li>
<li>Yang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ARC%2FMediator+subunit+required+for+SREBP+control+of+cholesterol+and+lipid+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An ARC/Mediator subunit required for SREBP control of cholesterol and lipid homeostasis.</a> Nature. 442, 700-704 (2006).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

本文介绍了一种向秀丽隐杆线虫（C. elegans）补充膳食不饱和脂肪酸的方法。如上所述，在制备添加多不饱和脂肪酸（PUFA）的培养板时需格外注意，由于多不饱和脂肪酸中的双键具有较高的反应活性，易受热和光的影响而发生氧化11。为避免氧化，应在培养基冷却至55 °C后，再将PUFA加入液态琼脂培养基中，并将培养板储存于避光环境中。
其他研究者曾使用 DMSO 或乙醇作为载体将游离脂肪酸引入 C. elegans，或通过显微注射直接将脂肪酸注入阴门12-14。在无需使用 Tergitol(NP40) 的情况下，通过在培养板中补充脂肪酸已实现对突变表型的部分挽救14-15。显然，存在多种有效的方法可将脂肪酸导入 C. elegans，但由于在大多数实验中并未监测线虫对脂肪酸的摄取情况，因此难以比较各种方法的效率。我们发现，本方法能够对从少量到数万条不等的线虫群体实现稳定且高效的不饱和脂肪酸补充。
我们发现，监测外源...

脂肪酸不仅是细胞膜的重要结构组分，也是高效的能量储存分子。此外，脂肪酸可由脂肪酶从细胞膜上切割下来，并通过酶促修饰生成信号效应分子1。天然存在的多不饱和脂肪酸（PUFAs）含有两个或两个以上cis构型的双键。ω-3脂肪酸与ω-6脂肪酸的区别在于其双键相对于脂肪酸甲基端的位置不同。健康的饮食需要同时摄入ω-6和ω-3脂肪酸。然而，西方饮食中特别富含ω-6脂肪酸，而缺乏ω-3脂肪酸。较高的ω-6与ω-3脂肪酸比例与心血管疾病和炎症性疾病风险增加相关，但特定脂肪酸确切的有益和有害作用尚不明确2。线虫Caenorhabditis elegans在研究脂肪酸功能方面具有重要价值，因为它能够合成一系列ω-6和ω-3脂肪酸所需的所有酶，包括ω-3去饱和酶——这一活性在大多数动物中并不存在3,4。缺乏脂肪酸去饱和酶的突变体无法合成特定的多不饱和脂肪酸，从而导致多种发育和神经系统的缺陷4-6。
为了研究膳食脂肪酸的生理效应，我们建立了一种生化检测方法，该方法可与遗传分析相结合，利用C. elegans的突变体及RNAi基因敲低技术进行研究。特定多不饱和脂肪酸（PUFA）的补充是通过在倒平板前将脂肪酸钠盐溶液加入琼脂培养基中实现的。这使得E. coli食物来源吸收PUFA，并在其细菌膜中积累。当C. elegans摄食含有PUFA的细菌后，膳食补充足以挽救PUFA缺乏突变体的表型缺陷。大多数脂肪酸的补充对野生型动物无不良影响，然而，特定的ω-6脂肪酸，尤其是二高-γ-亚麻酸（DGLA, 20:3n-6），会导致C. elegans生殖细胞发生永久性破坏7,8。
气相色谱法用于监测添加的脂肪酸在细菌食物来源（OP50 或 HT115）以及线虫体内的摄取情况。E. coli 和线虫对脂肪酸的摄取效率更高，培养基中添加去垢剂 Tergitol（NP-40）可使脂肪酸在整个培养皿中均匀分布。我们发现，不饱和脂肪酸可被细菌和 C. elegans 有效摄取，而饱和脂肪酸的摄取效率则低得多。本文将逐步介绍如何在琼脂培养基中添加脂肪酸，以及如何利用气相色谱法监测线虫对脂肪酸的摄取情况。

<table><tbody><tr><td>细菌琼脂（Bacto-Agar）</td><td>Difco</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白胨（Tryptone）</td><td>Difco</td><td>211705</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>J.T. Baker</td><td>3624-05</td><td></td></tr><tr><td>特吉托尔（Tergitol）</td><td>Sigma</td><td>NP40S-500mL</td><td></td></tr><tr><td>胆固醇（Cholesterol）</td><td>Sigma</td><td>C8667-25G</td><td>（溶于乙醇，5 mg/mL）</td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>J.T. Baker</td><td>2504-01</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>J.T. Baker</td><td>1311-01</td><td></td></tr><tr><td>K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>J.T. Baker</td><td>3254-05</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>J.T. Baker</td><td>3246-05</td><td></td></tr><tr><td>二高-γ-亚麻酸钠（Sodium dihomogamma linolenate）</td><td>NuCHEK</td><td>S-1143</td><td></td></tr><tr><td>温热的无菌Millipore水</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>用于收集线虫的无菌水</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>用于DGLA储备液的无核酸酶水（Nuclease-free Water）</td><td>Ambion</td><td>AM9932</td><td></td></tr><tr><td>氨苄青霉素（Ampicillin）</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1760-25</td><td>溶于水，100 mg/mL（用于RNAi平板）</td></tr><tr><td>异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside, IPTG）</td><td>Gold Biotechnology</td><td>12481C100</td><td>溶于水，1 M（用于RNAi平板）</td></tr><tr><td>HSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>J.T. Baker</td><td>9681-03</td><td></td></tr><tr><td>甲醇（Methanol）</td><td>Fisher Scientific</td><td>A452-4</td><td></td></tr><tr><td>己烷（Hexane）</td><td>Fisher Scientific</td><td>H302-4</td><td></td></tr><tr><td>二氨基二苯基吲哚（diamindinophenylindole, DAPI）</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>VectaShield</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>玻璃烧瓶</td><td>Corning</td><td>4980-2L</td><td></td></tr><tr><td>可高压灭菌的带搅拌子玻璃瓶</td><td>Fisherbrand</td><td>FB-800</td><td></td></tr><tr><td>可高压灭菌的玻璃量筒</td><td>Fisherbrand</td><td>08-557</td><td></td></tr><tr><td>磁力搅拌器</td><td>VWR</td><td>97042-642</td><td></td></tr><tr><td>55+ &amp;deg;C 水浴锅</td><td>Precision Scientific Inc.</td><td>66551</td><td></td></tr><tr><td>螺口棕色玻璃小瓶</td><td>Sun SRI</td><td>200 494</td><td></td></tr><tr><td>氩气钢瓶</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>自动移液器辅助装置（Automated Pipette aid）</td><td>Pipette-Aid</td><td>P-90297</td><td></td></tr><tr><td>无菌血清移液管（25 ml）</td><td>Corning</td><td>4489</td><td></td></tr><tr><td>本生灯（Bunsen Burner）</td><td>VWR</td><td>89038-534</td><td></td></tr><tr><td>解剖显微镜</td><td>Leica</td><td>TLB3000</td><td></td></tr><tr><td>硅烷化玻璃管</td><td>Thermo Scientific</td><td>STT-13100-S</td><td>用于脂肪酸甲酯（FAMEs）衍生化</td></tr><tr><td>聚四氟乙烯（PTFE）螺口盖</td><td>Kimble-Chase</td><td>1493015D</td><td></td></tr><tr><td>临床台式离心机</td><td>IEC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GC压盖小瓶（GC Crimp Vial）</td><td>SUN SRi</td><td>200 000</td><td></td></tr><tr><td>GC小瓶内插管（GC Vial Insert）</td><td>SUN SRi</td><td>200 232</td><td></td></tr><tr><td>GC小瓶盖（GC Vial cap）</td><td>SUN SRi</td><td>200 100</td><td></td></tr><tr><td>气相色谱仪（Gas Chromatograph）</td><td>Agilent</td><td>7890A</td><td></td></tr><tr><td>质谱检测器（Mass Spectrometry Detector）</td><td>Agilent</td><td>5975C</td><td></td></tr><tr><td>气相色谱柱</td><td>Suppelco</td><td>SP 2380</td><td>30 m × 0.25 mm 熔融石英毛细管柱</td></tr></tbody></table>

在 caenorhabditis elegans 中补充多不饱和脂肪酸的饮食方案

Dietary Supplementation of Polyunsaturated Fatty Acids in Caenorhabditis elegans

脂肪酸对多种细胞功能至关重要。它们可作为高效的能量储存分子，构成膜的疏水核心，并参与多种信号通路。Caenorhabditis elegans 能够合成一系列 omega-6 和 omega-3 脂肪酸所需的所有酶。这一特性，结合其简单的解剖结构和丰富的可用遗传工具，使其成为研究脂肪酸功能的理想模型。为了研究介导膳食脂肪酸生理效应的遗传通路，我们建立了一种向 C. elegans 饮食中补充不饱和脂肪酸的方法。补充脂肪酸是一种有效改变线虫脂肪酸组成的方法，也可用于挽救脂肪酸缺乏突变体的缺陷表型。本方法使用添加了脂肪酸钠盐的线虫生长培养基琼脂（NGM）。在添加脂肪酸的培养板中，脂肪酸会整合到细菌食物来源的膜中，随后被取食这些细菌的 C. elegans 摄取。我们还描述了一种气相色谱分析方案，用于监测补充脂肪酸后线虫体内脂肪酸组成的变化。该方法可高效地用于大量或少量 C. elegans 群体的饮食补充，具有广泛的应用前景。

秀丽隐杆线虫（C. elegans）饮食中补充脂肪酸的能力受限于其细菌食物来源吸收并将其整合到细菌膜中的能力。为确定大肠杆菌（E. coli）OP50 将不同脂肪酸整合入其细胞膜的能力，将 OP50 分别接种于未添加补充物、添加 0.1 mM 和 0.3 mM 硬脂酸（18:0）、油酸钠（18:1n-9）或二高-γ-亚麻酸钠（DGLA, 20:3n-6）的培养基平板上。平板在室温下避光干燥 2 天，随后在 20 °C 培养 3 天。用火焰灭菌的刮刀轻轻刮取菌苔并收集至水中。细菌经离心沉淀后，用含 2.5% H2SO4 的甲醇处理以生成脂肪酸甲酯，随后依照实验方案第 3 步所述方法进行气相色谱-质谱（GC/MS）分析。结果表明，不饱和脂肪酸（油酸和 DGLA）在 OP50 中的整合量高于饱和脂肪酸硬脂酸（图 1A）。
此外，将L1期N2幼虫接种于同一批添加补充物的平板上，并在培养三天后收获 20 °C将线虫从培养板上冲洗下来，通过气相色谱-质谱法（GC/MS）分析整个线虫...

Caenorhabditis elegans 是研究多不饱和脂肪酸在发育和生理功能中作用的有用模型。本方案描述了一种高效地向 C. elegans 饮食中添加多不饱和脂肪酸的方法。

在 Caenorhabditis elegans 中补充多不饱和脂肪酸的饮食方案

脂肪酸对多种细胞功能至关重要。它们可作为高效的能量储存分子，构成膜的疏水核心，……

以下实验的总体目标是通过饮食手段改变秀丽隐杆线虫的脂肪酸组成，以研究脂肪酸的功能与调控机制。该目标通过在不饱和脂肪酸存在下培养线虫的食物来源来实现。随后，将添加了特定脂肪酸的细菌饲喂给秀丽隐杆线虫，使其吸收该脂肪酸并将其整合入虫体中。随后，分析海鞘中脂质的变化。通过气相色谱-质谱分析确认脂肪酸组成。最后，在喂食不饱和脂肪酸后，对蠕虫的不育性进行评分。获得的结果显示了脂肪酸组成改变对发育行为和基因表达变化所产生的生理效应。该方法有助于回答海葵发育与生理学领域的关键问题，因为我们可以利用遗传操作和饮食干预来改变脂肪酸组成，并监测其后果。通常，初次接触该方法的研究人员必须格外小心谨慎，由于不饱和脂肪酸对氧气和高温敏感，难以获得一致的实验结果。配制一升脂肪酸添加培养基时，将以下组分称量后加入烧瓶中。加入超纯水至800毫升，将培养基与若干个用于测试不同脂肪酸浓度的空玻璃瓶以及适当的量筒一同高压灭菌。在培养基冷却至55摄氏度时进行灭菌。通过小心打开玻璃小瓶以避免玻璃碎片混入粉末中，称取足量脂肪酸钠盐配制工作母液，加入适量纯化水配制成100毫摩尔/升的储备液。接下来，使用氩气或氮气对溶液进行吹扫，以防止脂肪酸氧化。然后盖上瓶盖，将小瓶避光保存，直至脂肪酸钠盐完全溶解。当混合物冷却至55摄氏度后，靠近火焰将溶液转移至无菌量筒中。在加无菌水定容至一升之前，将培养基转移回烧瓶并继续混匀。使用无菌量筒将培养基等分转移至每个待测脂肪酸浓度对应的已灭菌瓶中。然后将瓶子置于搅拌器上保持温热状态。使用无菌25毫升移液管将适当浓度的脂肪酸储备液混匀后倒入培养皿中，待培养皿凝固后，盖上盖子，并在避光、通风良好的区域于室温下保存。两天后，用大肠杆菌OP50接种培养皿，然后将培养皿置于黑暗环境中室温孵育，直至细菌菌膜干燥。通过用碱性次氯酸盐溶液处理野生型雌雄同体线虫，制备同步化的L1幼虫群体。将GR两性蠕虫轻轻在此溶液中摇动，直至成虫溶解。然后以低速离心沉淀虫卵。使用M九缓冲液洗涤虫卵三次。然后在15毫升离心管中，将它们重悬于5毫升M9缓冲液中，并摇动过夜。将L1幼虫接种到已铺有OP50并添加了0.3毫摩尔二高-γ-亚麻酸（DGLA）的培养板上，于20摄氏度培养三天，或直至幼虫发育至成虫阶段。使用解剖显微镜观察成虫线虫并记录不育表型。成功的生殖细胞丢失表现为无卵的透明子宫。或者，将线虫挑至表面皿中的一滴M9缓冲液内进行评分。然后加入1毫升浓度为0.2纳克/毫升的DAPY溶液覆盖表面皿，并孵育约5分钟。孵育结束后，将线虫挑至载玻片上的封片剂液滴中，盖上盖玻片，密封后于4°C避光保存过夜，或立即在荧光显微镜下观察以生成脂肪酸甲酯（fames）。为定量脂肪酸摄取量，使用水将500至1000条成虫从培养板上冲洗下来，并转移至硅化处理的13 mm × 100 mm玻璃螺口试管中。让蠕虫通过重力沉降，然后用玻璃移液管尽可能吸除水分。加入1毫升含2.5%硫酸的甲醇溶液，将离心管置于70摄氏度水浴中加热1小时；在通风橱中冷却1分钟后，加入1.5毫升水和0.25毫升正己烷以萃取产物。盖紧离心管并剧烈振荡。然后将离心管放入台式临床离心机中离心一分钟，以分离己烷与水相溶剂。将上层己烷相转移至气相色谱（GC）样品瓶中的插管内。进行气相色谱分析时，取1至2微升脂肪酸甲酯（FAMEs）注入适用于FAME分析的极性毛细管气相色谱柱中。将进样器温度设为250摄氏度，载气流速为1.4毫升每分钟。程序升温设置如下：初始温度130摄氏度，保持1分钟；然后以每分钟10摄氏度的速率升温至190摄氏度，再以每分钟5摄氏度的速率升温至210摄氏度，最后保持1分钟，以确保DGLA的吸收已完成。通过火焰离子化检测或质谱检测（MS检测），并结合标准品对组分进行分析，以鉴定海优雅（sea elegance）。海优雅饮食中脂肪酸的补充受限于其细菌食物来源吸收并整合脂肪酸进入细菌膜的能力，因此需评估大肠杆菌OP50将不同脂肪酸整合入其膜结构的能力。如本图所示，将OP50接种于不含补充物、含0.1毫摩尔和0.3毫摩尔浓度的硬脂酸、油酸钠和二高-γ-亚麻酸钠（sodium DGLA）的培养基中。通过气相色谱-质谱（GCMS）进行Fame分析表明，不饱和脂肪酸（包括油酸（OLEATE）和DGLA）在OP50中的整合水平高于饱和脂肪酸硬脂酸。此外，检测成虫期蠕虫中脂肪酸的含量表明，补充饱和脂肪酸对蠕虫组织中饱和脂肪酸的相对含量没有影响。然而，补充不饱和脂肪酸会增加这些脂肪酸的总体相对含量。这些数据表明，秀丽隐杆线虫（C. elegans）中补充脂肪酸的相对积累量与饮食来源的大肠杆菌（E. coli）中脂肪酸的相对积累量直接相关。正如我们先前所证实的，该图展示了二高-γ-亚麻酸（DGLA）诱导海洋秀丽线虫不育的剂量反应关系。在线虫脂质中，导致50%个体出现不育的DGLA浓度约为12%。有趣的是，线虫的遗传突变可改变其对DGLA的反应。这一现象基于最近的一项发现：胰岛素样生长因子依赖性应激通路能够影响DGLA诱导的生殖细胞破坏。我们向含有DAF-2胰岛素IGF受体或DAF-16 FOXO转录因子有害突变的线虫饮食中补充了二高-γ-亚麻酸（DGLA）。对各品系不育性进行评分的结果显示，在两种DGLA浓度下，DAF-2突变体线虫的生育能力正常，与野生型线虫相比，其生殖细胞损失极少或几乎没有。相比之下，当在含有0.15毫摩尔脂肪酸的培养板上喂养时，补充DGLA但vox O失活的线虫表现出比野生型更高比例的不育个体。在此实验流程基础上，研究人员可对补充了DGLA的秀丽隐杆线虫开展多种检测，例如基因表达研究、行为学检测，或发育与生殖分析。这些检测将揭示特定脂肪酸在这些过程中的作用。观看本视频后，您应能充分理解如何稳定地制备添加脂肪酸的培养基，以改变秀丽隐杆线虫的脂肪酸组成。

dietary-supplementation-polyunsaturated-fatty-acids-caenorhabditis

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

多不饱和脂肪酸的膳食补充剂<em&gt;秀丽隐杆线虫</em

本文介绍了一种利用灭活细菌在秀丽隐杆线虫（C.

基于固体平板的饮食限制方法 秀丽隐杆线虫

我们介绍了用于研究Caenorhabditis elegans脂质储存的可靠生化与显微方法。一种快速、简便的固定-染色法可利用亲脂性染料尼罗红（Nile...

秀丽隐杆线虫中脂肪含量的生化与高通量显微评估

本文中，我们描述了一种利用液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）从秀丽隐杆线虫（C.

秀丽隐杆线虫中前列腺素的提取与分析

本文介绍一种针对秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis...

一种基于 Caenorhabditis elegans 营养状态的铜回避行为检测方法

脂质丰度的定量与脂质分布的评估 秀丽隐杆线虫 通过尼罗红和油红O染色

本文介绍了一种从同一样本中同时分离 RNA、DNA...

Caenorhabditis elegans 中的核酸与蛋白质联合提取

蛋白质稳态的衰退是衰老的一个标志，会促进神经退行性疾病的发生。我们提出了一种实验方案，通过异源表达与荧光报告蛋白融合的多聚谷氨酰胺重复序列，定量测量两种不同组织中秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis...

量化组织特异性蛋白质稳态衰退在 Caenorhabditis elegans 中的变化

为了在组学研究中使用秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans，C. elegans），需要一种能够培养大量线虫种群的方法，以便在同一份样品上进行多种平台的检测，实现比较分析。本文介绍了一种在大规模培养板（LSCPs）上培养C.

大规模混合阶段的培养与检测 秀丽隐杆线虫 种群

受激拉曼散射（SRS）显微技术能够实现对特定化学基团的选择性、无标记成像，已被有效用于体内脂质分子的成像。本文简要介绍SRS显微技术的原理，并描述其在秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis...

无需标记的脂质储存动态成像：利用受激拉曼散射显微镜对秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）的研究

本实验方案描述了在线虫 Caenorhabditis elegans...

脂质补充对寿命延长及基因转录分析的影响 秀丽隐杆线虫

本方案描述了一种用于定量检测的实验方法 秀丽隐杆线虫...

通过测量细菌清除率定量秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）的食物摄入量

了解如何通过膳食补充多不饱和脂肪酸来改变秀丽隐杆线虫的脂肪酸组成，并使用气相色谱质谱联用技术进行分析。该方法有助于研究脂肪酸在发育和生理中的功能。

在 Caenorhabditis elegans 中补充多不饱和脂肪酸的饮食方案

探索更多视频