从成年啮齿类动物脑内常规和非常规区域培养神经干细胞

以下实验的总体目标是从成年啮齿类动物大脑的不同区域建立神经干细胞培养体系。首先，通过获取特定感兴趣区域的组织，检测其中神经干细胞的存在及其潜能；第二步，将组织处理成单细胞悬液，用于接种形成单层培养体系。

接下来，使用定义明确的培养条件选择性扩增神经干细胞，以验证其自我更新能力。体外实验结果表明，神经干细胞具有多向分化潜能，并揭示了不同因素如何影响其自我更新和命运决定。该方法有助于回答神经科学和再生医学领域的关键问题，例如内源性神经干细胞的定位及其调控策略。

当我们发现信号减弱通路时，首先想到了这一技术。该技术使我们既能鉴定出内源性神经干细胞，又能调控其数量。因此，我们将这一知识应用于建立来自大脑不同区域的这些细胞的稳定培养体系。

研究它们的特性，并提出问题：它们确实是干细胞吗？在计划解剖前两天，正确准备培养皿至关重要，需用浓度为每毫升75微克的多聚左旋鸟氨酸（poly L-ornithine）包被培养皿。然后将培养板在室温下孵育过夜。次日，吸除多聚左旋鸟氨酸溶液，并用三毫升磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤每个孔两次，每次洗涤五分钟。

随后可将培养板置于培养箱中保存长达三周。在去除最后一次洗涤液后，通过轻柔吹打加入用 PBS 按 1:250 稀释的纤维素苦味酸（fiber nin）。注意避免过度搅动溶液。然后在解剖当天将培养板于室温下孵育过夜。

吸弃纤连蛋白溶液，用 PBS 洗涤培养皿两次。将最后一次 PBS 洗涤后的培养板放回培养箱，等待解离的组织。未使用的培养板可在培养箱中保存最多一周，但切勿使其干燥，也避免震荡。

本方案的演示以三只成年大鼠为样本。首先，在处死第一只大鼠前，务必将脑切片块预先置于冰上冷却。然后，在冰上准备一个15毫升的圆锥形离心管，内含5毫升N2培养基和碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）。

从安乐死的大鼠体内取出脑组织后，将其放入含有冰冷 PBS 的 10 厘米培养皿中。随后将脑组织转移至第二个 PBS 培养皿中，确保无残留毛发或血液。接着将脑组织置于预冷的切片块中，并在靠近目标区域（即将获取细胞的区域）的位置插入一片新的洁净剃须刀片。

接着插入第二把干净的剃须刀片，使其与第一把剃须刀片相距3毫米。小心地将刀片从包埋块中提起，同时带起所需的目标切片部分。

将切片浸入磷酸盐缓冲液（PBS）中，使其从刀片上漂浮下来。现在使用5号镊子采集目标区域。本示例中的切片包含前连合。当然。

将切片收集到含有5毫升添加碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）的N2培养基的15毫升锥形管中。随后将溶液体积浓缩至1–2毫升。接着，在细胞培养超净台中，将1毫升移液枪头插入锥形管底部，利用约20次液体抽吸操作对组织进行机械性解离。

当溶液变为均一时停止振荡，静置几分钟，使较大的未解离组织沉降到管底。随后，将不含组织块的均一上清液转移至含有8.5毫升补充双倍培养基的锥形管中。混匀管内液体，并准备好预先配制的六孔板。

培养板。从孔中移除PBS，然后在接下来的10至14天培养期间，每孔加入三毫升细胞混合液，共三孔。自接种后24小时起，每隔一天更换一次新鲜的N2补充培养基，每隔一天在N2中加入新鲜的补充剂体积。

将培养基加入已存在于细胞上的培养基中。严格控制培养条件对于维持细胞未分化状态并促进其扩增至关重要。首次更换培养基后，仍残留大量细胞碎片以及血管组织。

然而，在接下来的几天内，出现了明显增殖的干细胞克隆。同时还存在一些更为细长的梭形细胞群体。这些并非神经干细胞，随着神经干细胞的增殖，它们最终被取代。

在接下来的两周内，神经干细胞生长得越来越密集，直至达到汇合状态。这些细胞培养物对多种干细胞标志物呈阳性反应，包括 SOX2、hESI 和 nestin，从而证实所筛选和扩增的细胞群体确实为神经干细胞。

进一步的验证是在从培养基中去除 FGF 后进行的，这使得细胞能够分化 10 天，形成神经元、星形胶质细胞以及所有少突胶质细胞。为诱导分化，将添加了补充物的 N2 培养基更换为未补充的 N2 培养基，并以此方式培养细胞 10 天，每 48 小时更换一次 N2 培养基。10 天后，吸去培养基，并每孔加入 2 毫升 4% 多聚甲醛固定细胞 20 分钟。

用三毫升 PBS 洗去固定剂，每次五分钟，共洗两次。第二次清洗后吸去 PBS，加入含有 5% 正常驴血清和 0.1% Triton X-100 的两毫升 PBS，以对细胞进行通透和封闭，室温孵育 20 分钟。在含有 5% NDS 的 PBS 中配制一抗混合液。

在此示例中，使用抗 T UJ 一抗体来鉴定神经元，而 GFAP 和 CPA 抗体则分别用于显示星形胶质细胞和少突胶质细胞。孵育 20 分钟后，吸除封闭液，向每个孔中加入 1.5 毫升一抗混合液，孵育细胞。

90分钟后加入室温孵育90分钟，用两遍PBS洗涤细胞，随后用含有5%NDS的PBS孵育一次，每次使用3毫升溶液，孵育5分钟。除去最后一次洗涤液后，向每个孔中加入1.5毫升含5%NDS的PBS配制的二抗溶液，然后将培养板置于避光环境中，室温孵育40分钟。

40分钟后，弃去二抗溶液，加入2毫升新配制的DPI染液，孵育3分钟。吸除DPI溶液后，用3毫升PBS洗涤细胞3次，每次5分钟。按照此步骤处理后，细胞即可用于显微镜观察。

其他方法，如蛋白质印迹（western blot），可用于检测药物处理或细胞分化过程中蛋白质表达及磷酸化水平的变化。该技术建立后，实际上为神经科学领域的研究人员开辟了道路，使其能够在包括小鼠、大鼠甚至灵长类动物在内的多种不同物种中测试并应用新的研究方法。