小鼠在虚拟现实环境中导航时的双光子钙成像

以下实验的总体目标是在小鼠探索虚拟现实环境时，完成慢性双光子成像的关键操作。为此，需对双光子显微镜进行改造，以实现对行为活动小鼠的快速、稳定成像。接下来，搭建一个可进行运动追踪的气浮式 treadmill。

然后构建一个虚拟现实环境，该环境使用与显微镜同步的LED投影仪，以最大限度减少光线泄漏。由于运动伪影减少、光线泄漏降低以及光损伤边缘最小化，从而获得了良好且稳定的图像记录。尽管该方法可用于测量虚拟现实环境中导航时的神经活动，但它也可轻松适应多种需要视觉刺激的不同行为范式。

所有动物实验均经巴塞尔州兽医部门批准，并遵循其指南进行。本实验中使用的双光子显微镜配备了一个扫描头，包含一个8 kHz或12 kHz的共振扫描器和一个标准的检流计扫描器。该配置可在750 × 400像素下实现每秒40或60帧的成像速度，并减少由脑组织运动引起的图像失真、光漂白和光毒性。

采用压电式高速Z轴步进器，可在多个深度依次采集时间交错的图像。使用机械快门以减少扫描路径转折点处激光对组织的照射，该快门需具备可调性以设定其开启宽度。根据共振扫描器的振幅，将内径至少为10毫米的气源管连接至 treadmill 的球体支架，并在主气源与球体支架之间接入一段BLE长度的管路，以降低噪声。

将一个直径为 20 厘米的聚苯乙烯泡沫球放入定制设计并经 3D 打印的球体支架中。如果行为范式仅需要前后运动，则在球体侧面插入一根针，例如 19 号皮下注射针头。为了限制球体在水平轴上的移动，可分别使用一个或两个光学计算机鼠标来追踪球体在两个或全部三个轴上的运动。

为准备虚拟现实环境，使用LED投影仪或LED背光计算机屏幕进行显示。在成像期间，集成一个门控电路以实现LED的快速闪烁。24千赫兹的闪烁频率远高于闪烁融合阈值，动物无法感知该频率以上的闪烁。

调整精确的闪烁频率和占空比，以将投影仪的光输出与用于瞳孔追踪的谐振扫描镜的转向点同步，使用基于CMOS的视频相机。确保该相机不含红外阻挡滤光片。在注射遗传编码的钙指示剂并植入颅窗后约两到三周，使用落射荧光照明检查颅窗植入物的清晰度及表达情况。

清晰可见且边界分明。表层血管边界的清晰程度是判断窗植入物是否适合在术后一到两天内进行成像的良好指标。进行双光子实验时，在样品处将激光功率测量并调整至50毫瓦以下。

然后打开球形跑步机的气流。接着，将动物的头部固定在球形跑步机上。初次进行头部固定的实验时，小鼠可能会有不适反应。

可通过短暂使用异氟烷对动物进行镇静来简化此操作。一旦动物适应了该操作流程，通常可在无需镇静的情况下完成固定。需要注意的是，在此过程中必须尽量减少动物所受到的应激。

然后将视觉显示系统尽可能靠近动物放置，同时仍确保能够接触动物。确保颅窗植入物无污物，必要时用水清洁，并在颅窗与水浸物镜之间涂抹透明超声耦合剂作为浸没介质以屏蔽光线。用黑色胶带包裹物镜和头杆一圈。

将虚拟环境区域移至最终位置，并调整视频摄像机以实现瞳孔追踪。最后，根据实验过程中使用的扫描振幅设置激光快门，并在实验完成后开始记录数据。根据所在机构的指导原则对动物实施安乐死。

使用遗传编码钙指示剂标记细胞群进行双光子钙成像时，成像质量在很大程度上取决于颅窗植入的质量。如本实验在病毒注射后检查颅窗透明度所示，应无肉芽组织或骨再生现象可见。此外，浅表血管的形态应保持不变，血管边界应清晰分明。同时，在落射荧光显微镜下应能清晰观察到标记细胞的感兴趣区域（BOI）。

理想情况下，制备样本应具有足够的稳定性，使得在帧对齐后，小鼠运动所引起的双光子图像畸变在图像中不可见。通过将投影仪的光输出与共振扫描镜的转向点精确同步，可以完全消除视觉刺激系统产生的杂散光。当不进行数据采集时，光源的闪烁频率应为扫描频率的两倍。

在此示例中，移除了遮光装置以说明视觉刺激期间橙色框内所示的漏光效应。观看本视频后，您应能够充分理解如何在穿越虚拟现实环境的小鼠中进行双光子成像。除了按照本文所述设置成像和虚拟现实系统外，此类实验成功的关键在于熟练掌握颅窗植入技术。

洁净的植入体是获得高质量图像和稳定记录的前提。