微波辅助聚乙二醇和树脂上肽的功能化及其在链式聚合和水凝胶形成中的应用

本实验的总体目标是将甲基丙烯酸酯基团引入聚乙二醇和多肽分子中，以用于后续的链式聚合反应及水凝胶合成。该过程首先将甲基丙烯酸酐与未功能化的前体物质在闪烁瓶中混合。第二步是利用微波能量对聚乙二醇或多肽进行功能化修饰。

接下来，将 PEG DM 溶解于氯甲烷中，或从树脂上裂解肽链，同时使用酸性裂解液去除所有侧链保护基团。最后一步是在乙醚中沉淀 PEG DM 或甲基丙烯酰胺功能化的肽。

最终通过质子核磁共振（proton NMR）或基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（Maldi time of flight mass spectrometry）来验证PEG或肽大环的成功功能化。大家好，我叫Amy Van Hove。我是罗切斯特大学生物医学工程系的一名博士研究生。

与现有方法（如将聚乙二醇与甲基丙烯酰氟反应）相比，该技术的主要优势在于反应速度显著更快，且更加环保。大家好，我叫Brandon Wilson，是罗切斯特大学化学工程专业的一名本科生。

该方法有助于解答生物材料领域中的关键问题，例如如何利用聚乙二醇二甲基丙烯酸酯（PEG dimethacrylate）制备水凝胶，以调控治疗性细胞及分子的递送。大家好，我是罗切斯特大学生物医学工程系助理教授 Danielle Benoit。该技术的应用前景在于开发多种疾病的治疗方法，因为所合成的化合物可用于细胞和药物递送应用。

在开始此操作之前，将所需玻璃器皿在烘箱中预先干燥一小时，以防止在大型乳清舟中受到水分污染。称取五克分子量介于1000至100,000道尔顿之间的聚乙二醇（PEG）。如果存在，应在化学通风橱中从闪烁瓶的瓶盖上移除塑料部件。

将甲基丙烯酸酐以10倍摩尔过量加入已剪开的闪烁瓶中。然后将聚乙二醇（PEG）加入该瓶中。接着，将瓶盖轻轻拧上，并将瓶子放入微波炉中。

戴上耐热手套，将微波炉调至最大功率加热五分钟。每隔30秒从微波炉中取出一次小瓶，然后完全拧紧瓶盖，并涡旋振荡样品30秒。

将小瓶放回微波炉前，先松开瓶盖。重复这些步骤，直至溶液已微波处理满五分钟。从微波炉中取出小瓶后，松开瓶盖，使 PEG DM 冷却至室温。

然后将 PEG DM 溶解于 10 至 15 毫升二氯甲烷中。加入十倍体积的预冷乙醚沉淀 PEG DM，持续 20 分钟。使用直径七厘米的布氏漏斗和 500 毫升抽滤瓶进行过滤。

通过真空过滤收集聚乙二醇二甲基丙烯酸酯（PEG DM）。随后，将过滤后的 PEG DM 转移至一个 50 毫升的锥形管中，并用大口径针头在管盖上穿孔以通气。将该管置于真空干燥箱中，过夜干燥 PEG DM。

将试管从真空干燥箱中取出后，用冰乙醚沉淀溶解聚乙二醇二甲基丙烯酸酯（PEG DM）。过滤并收集产物后，为去除未反应的甲基丙烯酸酐，以与之前相同的方式将PEG DM置于真空干燥箱中干燥。进行核磁共振氢谱（¹H NMR）分析时，取约10毫克PEG DM样品置于闪烁瓶中，并加入约1毫升氘代氯仿。

样品溶解后，将其转移至一支洁净的核磁管中。随后采集质子核磁共振谱，并在室温下对样品进行至少64次扫描，以获得足够的数据分辨率。通过固相合成法合成目标肽后，将其保留在树脂中的DMF中，并于4摄氏度下保存，直至使用前。

然后使用直径七厘米的布氏漏斗（配滤纸）和250毫升抽滤瓶，通过过滤收集肽树脂。取下闪烁瓶盖上的塑料部件，将树脂转移至瓶中。用一次性移液管加入适量甲基丙烯酸酐，恰好浸没树脂即可。将瓶盖轻轻拧上但不完全紧闭，放入微波炉中，设定时间为三分钟。

在最大功率下，佩戴耐热手套，每15至20秒将小瓶从微波炉中取出一次。完全拧紧瓶盖后，涡旋震荡样品15秒。在将小瓶放回微波炉前，需先松开瓶盖。

重复以上步骤，直至溶液已微波加热满三分钟。将离心管盖稍松开，使用少量 DMF 和直径七厘米的布氏漏斗，使肽溶液冷却至室温。使用滤纸和 250 毫升抽滤瓶。

从样品瓶中收集用于裂解和深度保护的肽树脂。将肽树脂转移至一个新的闪烁瓶中，用于含有0.25毫摩尔精氨酸的肽。分别加入0.25毫升三异丙基硅烷、3,6-二氧杂-1,8-辛二硫醇、去离子水以及18.0毫升三氟乙酸（TFA）。

然后在室温下将反应混合物置于实验室摇床上旋转反应4小时。反应结束后，加入10倍体积预冷的乙醚沉淀肽。将溶液均分至四个50毫升锥形管中，在3,200 G离心10分钟以收集肽；离心后弃去乙醚，将肽重新悬浮于100毫升新鲜乙醚中，并分装至两个50毫升锥形管。

重复离心步骤。在最后一次离心后，将肽分别用50毫升新鲜乙醚重悬两次，共进行四次乙醚洗涤，倾去废乙醚，并将肽在真空条件下干燥过夜。为进行基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF）分析，取1至2毫克肽样品置于1.5毫升离心管中，加入1毫升MALDI溶剂溶解样品。

随后，用多溶剂配制浓度为 10 毫克/毫升的 α-氰基-4-羟基肉桂酸基质溶液。将肽溶液与基质溶液等体积混合，取 1 微升混合液点样于 MALDI 样品靶板上的三个不同位置。使用加热枪将样点烘干。

然后重新点样并干燥每个样品。最后，采集基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱数据，并确认由于甲基丙烯酰胺基团添加到肽链的末端，分子量增加了68克每摩尔。此处显示的是采用微波辅助法进行该反应所得的两千伏尔特线性聚乙二醇二甲基丙烯酸酯的功能化产物的核磁共振谱图。

可以通过末端甲基丙烯酸酯质子与中心PEG质子的实测值与理论值之比，利用质子核磁共振（NMR）分析计算功能化百分比。总体功能化率为91%，该PEG二甲基丙烯酸酯已充分功能化，适用于水凝胶合成。有关计算功能化百分比的详细信息，请参见文本方案，因为在肽类的质子核磁共振分析中会产生大量质子峰。

使用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF质谱）可更方便地研究肽的功能化。本实验中合成了肽G-K-R-G-D-S-G，并对其进行甲基丙烯酰胺功能化。在功能化前，将少量肽裂解以测定其分子量，结果显示分子量峰位于676克/摩尔，与该肽的理论分子量相符。其余肽样品在甲基丙烯酰胺功能化后进行裂解，功能化后的质谱分析显示分子量峰位于744克/摩尔，与甲基丙烯酰胺功能化肽的理论分子量一致。

为了验证PEG DM以及甲基丙烯酰胺功能化肽段的功能，制备了含有或不含0.5毫摩尔甲基丙烯酰胺功能化的GKRGDSG的PEG水凝胶。图中显示的是间充质干细胞（MSCs）在仅含PEG凝胶以及含有甲基丙烯酰胺功能化肽段的PEG凝胶上的代表性相差显微图像和活/死荧光染色图像。MSCs无法黏附于未功能化的PEG水凝胶表面，但在引入细胞黏附肽RGD后，细胞能够黏附并在水凝胶表面铺展。

活死染色图像并不能代表接种的MSC群体的存活率。相反，荧光图像旨在区分贴壁细胞与水凝胶拓扑结构中的微小变化，而这些变化仅通过相差显微镜观察可能难以分辨。有趣的是，在仅含PEG的凝胶上接种的未铺展细胞对钙黄绿素AM和碘化丙啶（AUM Homodimer）均呈阳性染色，表明这些细胞在成像时正处于死亡状态。

PEG水凝胶的众多优势之一在于其高度可调的特性，可通过改变PEG的具体组成来实现调控。如本图所示，水凝胶使研究人员能够高度控制弹性模量等性质。已知PEG的分子量和质量百分比均可调控水凝胶的网络孔径、最终水凝胶的刚度以及包封药物的释放速率。

通过制备具有不同分子量PEG dm的水凝胶，并研究由此产生的水凝胶模量和网孔尺寸，验证了上述假设，即增加PEG的分子量。Macer导致水凝胶网孔尺寸增大以及水凝胶刚度降低。水凝胶的网孔尺寸和凝胶刚度还可通过改变PEG的质量百分比来调控。制备了不同质量百分比的PEG水凝胶。

线性10千道尔顿PEG DM的重量百分比及水凝胶的刚度和孔径大小的关系如图所示，增加PEG的重量百分比会导致水凝胶孔径显著减小，同时水凝胶刚度增加。使用不同分子量的PEG DM制备了包埋牛血清白蛋白的水凝胶。由于较高分子量PEG DM形成的水凝胶具有更大的孔径，牛血清白蛋白从其中的释放速度更快。

观看本视频后，您应能够充分理解如何利用微波辅助法合成 PEG DME accolade，以及如何通过质子核磁共振（¹H NMR）评估其功能化程度。掌握该方法后，还可进一步利用水解可降解基团的开环反应，探究水凝胶降解对细胞功能的影响。您还应充分理解如何利用该技术选择性地将甲基丙烯酰胺功能基团引入肽序列的末端，以及如何通过飞行时间质谱（multi time-of-flight mass spectrometry）评估此类功能化修饰。

感谢观看。