Name: 设计丝绸蚕丝蛋白合金生物医用材料 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-13T14:15:00.000+00:00
Duration: 11 min 14 s
Description: 学习利用蚕丝蛋白溶液制备可调谐生物医用合金材料的方法。本研究展示如何通过混合不同比例的野生蚕丝与家蚕丝蛋白溶液，结合电子电路转移技术，开发具有生物相容性和可降解性的新型植入式医疗器械材料。

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作者感谢罗文大学对本研究的支持。XH 还感谢塔夫茨大学的 David L. Kaplan 博士以及美国国立卫生研究院 P41 组织工程资源中心（TERC）提供的前期技术培训。&#160;

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<li>Teng, W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+silk-elastin+like+protein+polymer+displays+elasticity+comparable+to+elastin%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Recombinant silk-elastin like protein polymer displays elasticity comparable to elastin.</a> Biomacromolecules. 10, 3028-3036 (2009).</li>
<li>Foo, C. W. P., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+engineering+of+fibrous+proteins%2C+spider+dragline%2C+silk+and+collagen%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Delivery+Rev%22%5BJournal%5D)">Genetic engineering of fibrous proteins, spider dragline, silk and collagen.</a> Adv Drug Delivery Rev. 54, 1131-1143 (2002).</li>
<li>Hu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Charge-Tunable+Autoclaved+Silk-Tropoelastin+Protein+Alloys+That+Control+Neuron+Cell+Responses%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Funct.+Mater%22%5BJournal%5D)">Charge-Tunable Autoclaved Silk-Tropoelastin Protein Alloys That Control Neuron Cell Responses.</a> Adv. Funct. Mater. 23, 3875-3884 (2013).</li>
<li>Hu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomaterials+derived+from+silk-tropoelastin+protein+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Biomaterials derived from silk-tropoelastin protein systems.</a> Biomaterials. 31, 8121-8131 (2010).</li>
<li>Hu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+elasticity+and+surface+roughness+on+myogenic+and+osteogenic-differentiation+of+cells+on+silk-elastin+biomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The influence of elasticity and surface roughness on myogenic and osteogenic-differentiation of cells on silk-elastin biomaterials.</a> Biomaterials. 32, 8979-8989 (2011).</li>
<li>Hu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomaterials+from+ultrasonication-induced+silk+fibroin-hyaluronic+acid+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Biomaterials from ultrasonication-induced silk fibroin-hyaluronic acid hydrogels.</a> Biomacromolecules. 11, 3178-3188 (2010).</li>
<li>Gil, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Swelling+behavior+and+morphological+evolution+of+mixed+gelatin%2Fsilk+fibroin+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Swelling behavior and morphological evolution of mixed gelatin/silk fibroin hydrogels.</a> Biomacromolecules. 6, 3079-3087 (2005).</li>
<li>Lu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+process+to+prepare+silk+fibroin%2Fgelatin+biomaterial+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Macromol.+Biosci%22%5BJournal%5D)">Green process to prepare silk fibroin/gelatin biomaterial scaffolds.</a> Macromol. Biosci. 10, 289-298 (2010).</li>
<li>Lu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insoluble+and+flexible+silk+films+containing+glycerol%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Insoluble and flexible silk films containing glycerol.</a> Biomacromolecules. 11, 143-150 (2010).</li>
<li>Mandal, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silk+fibroin%2Fpolyacrylamide+semi-interpenetrating+network+hydrogels+for+controlled+drug+release%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Silk fibroin/polyacrylamide semi-interpenetrating network hydrogels for controlled drug release.</a> Biomaterials. 30, 2826-2836 (2009).</li>
<li>Yeo, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen-based+biomimetic+nanofibrous+scaffolds%2C+preparation+and+characterization+of+collagen%2Fsilk+fibroin+bicomponent+nanofibrous+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Collagen-based biomimetic nanofibrous scaffolds, preparation and characterization of collagen/silk fibroin bicomponent nanofibrous structures.</a> Biomacromolecules. 9, 1106-1116 (2008).</li>
<li>Holst, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate+elasticity+provides+mechanical+signals+for+the+expansion+of+hemopoietic+stem+and+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Substrate elasticity provides mechanical signals for the expansion of hemopoietic stem and progenitor cells.</a> Nat. Biotechnol. 28, 1123-1128 (2010).</li>
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<li>Qin, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+resilin+elasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Mechanism of resilin elasticity.</a> Nature Communications. 3, 1003(2012).</li>
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</ol>

无利益冲突声明。

生产“合金”蛋白体系中最关键的步骤之一是验证混合蛋白的相容性。否则，该体系仅是一种不相容的蛋白混合物或蛋白复合系统，不具备稳定且可调控的特性。可通过实验性的热分析方法来实现这一目的，并确认其合金特性。蛋白-蛋白相互作用可根据Flory-Huggins晶格模型进行分析。48 基于“溶剂”（主要蛋白质组分）与“溶质”（次要蛋白质组分）之间相互作用的模型，混合过程中“溶剂”与“溶质”之间的自由能变化决定了该混合物的混溶性。48通常，混溶性可分为三种不同情况：（a）完全混溶（宏观上形成单相材料），（b）亚稳态混溶（材料中形成部分混溶的相），（c）不混溶（保持原有的两相结构，分别为蛋白质A和蛋白质B的区域）3,48相应地，双蛋白质体系的玻璃化转变行为可以体现这些差异，并可通过相图模型理想地加以表达（图&#160;6）。例如，如果蛋白质 A 和 B 各自具有独立的玻璃化转变温度 Tg（A）和 Tg（B），分别图&#160;6 绿色和蓝色曲线），一个完全互溶的蛋白质合金体系在...

大自然已创造出利用有限数量的结构蛋白来生成可调节且多功能生物基质的策略。例如，弹性蛋白和胶原蛋白通常被共同使用 体内 以提供特定组织所需的可调节强度和功能1,2关键在于混合。混合是指以特定比例混合蛋白质，是一种通过调节和改变材料特性来构建简单材料系统的技术方法。3-5与合成工程策略相比6,7，混合还能提高材料的均匀性以及材料的加工性能，因为操作简便8-16因此，设计多功能且生物相容的蛋白合金材料已成为医学研究的新兴领域。该技术还将系统揭示天然蛋白质基质对细胞和组织功能的影响 体外 和 体内10,17通过优化不同蛋白质之间的分子界面，基于蛋白质的合金材料可具备多种物理功能，例如在不同温度下的热稳定性、对多种组织的弹性支撑、对不同器官的电敏感性，以及用于角膜组织再生的光学特性3,18-27这些研究的结果将为生物医学科学领域提供一种新型的蛋白质-材料平台，直接关联于可调控的组织修复与疾病治疗，并进一步推动可生物降解植入装置的发展，使其具备新颖的治疗与诊断功能。3.
许多天然结构蛋白具有关键的物理和生物活性特性，可作为生物材料基质的候选物质。来自不同蠕虫物种的丝蛋白、毛发和羊毛中的角蛋白、不同组织中的弹性蛋白和胶原蛋白，以及多种植物蛋白，是目前用于设计多样化蛋白质基材料中最常见的结构蛋白（图1）18-27。通常，由于这些蛋白具有独特的重复性一级氨基酸序列，能够形成不同的分子二级结构（例如，丝蛋白的β折叠或角蛋白的卷曲螺旋）3,28-35。这些特性促进了在生物界面处形成具有独特功能的自组装宏观结构，使其成为宝贵的生物聚合物材料资源。本文以两种结构蛋白为例（野生柞蚕丝来源的蛋白A和家养桑蚕丝来源的蛋白B），展示制备多种蛋白合金生物材料的一般性实验流程。所演示的实验方案包括三部分：第一部分为蛋白相互作用的预测与模拟，第二部分为蛋白合金溶液的制备，第三部分为蛋白合金体系的构建及其在光学、电学和药物学领域的应用。
<img alt="天然纤维概述：毛发角蛋白、竹子、羊毛角蛋白、弹性蛋白、桑蚕丝、柞蚕丝。" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50891/50891fig1highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
图1. 实验室中常用于设计蛋白基材料的各种结构蛋白原料，包括来自不同蠕虫物种的丝蛋白、毛发和羊毛来源的角蛋白、不同组织来源的弹性蛋白，以及多种植物蛋白。

<table><tbody><tr><td>Q100 差示扫描量热仪 (DSC)</td><td>TA Instruments, New Castle, DE, USA&lt;br/&gt;</td><td>N/A</td><td>可使用任何带有计算热容软件的DSC仪器。</td></tr><tr><td>SS30T 真空溅射系统&amp;nbsp;</td><td>T-M Vacuum Products, Inc., Cinnaminson, NJ, USA</td><td>N/A</td><td>配备定制部件；可使用任何类型的溅射系统进行镀膜。</td></tr><tr><td>VWR 1415M 真空烘箱</td><td>VWR International, Bridgeport, NJ, USA</td><td>N/A</td><td>可使用任何类型的真空烘箱对样品进行物理交联。</td></tr></tbody></table>

设计丝-丝蛋白合金材料用于生物医学应用

Designing Silk-silk Protein Alloy Materials for Biomedical Applications

纤维状蛋白质具有不同的序列和结构，已被广泛应用于生物传感器、纳米医学、组织再生和药物递送等生物医学领域。通过设计基于这些蛋白质分子尺度相互作用的材料，有助于开发出具有可调控性能的新型多功能蛋白质合金生物材料。相较于传统的合成聚合物，此类合金材料体系还具有在体内可生物降解、生物相容性好以及性能可调等优势。本文以野生柞蚕丝（Antheraea pernyi）与家养桑蚕丝（Bombyx mori）的蛋白质共混体系为例，提供了与上述主题相关的实用实验方案，包括如何利用计算方法预测蛋白质-蛋白质相互作用、如何制备蛋白质合金溶液、如何通过热分析验证合金体系，以及如何制备多种功能性的合金材料，如带有衍射光栅的光学材料、具有电路涂层的电学材料，以及用于药物释放与递送的药用材料。这些方法可为基于不同蛋白质合金设计下一代多功能生物材料提供重要信息。

典型的蛋白质-蛋白质相互作用（例如，蛋白质A与蛋白质B之间）可能包含电荷-电荷（静电）吸引、氢键形成、疏水-亲水相互作用，以及两种蛋白质特定结构域之间的偶极、溶剂、反离子和熵效应图2)3因此，从本质上讲，我们可以通过计算机模拟来预测这些相互作用的效果。
<img alt="蛋白质相互作用示意图：电荷、氢键、疏水相互作用。分子结合研究。" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50891/50891fig2highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 2"> 
图2. 蛋白质A与蛋白质B之间的相互作用。 这些相互作用通常基于两种蛋白质特定结构域之间的电荷-电荷（静电）吸引、氢键形成或疏水-亲水相互作用。
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共混是一种高效的方法，可用于制备具有广泛性能和多种特性的生物材料。通过预测不同天然丝蛋白之间的分子相互作用，可以设计出具有可调机械韧性、电响应性、光学透明性、化学可加工性、生物降解性或热稳定性的新型丝蛋白-丝蛋白合金平台。

纤维状蛋白质具有不同的序列和结构，已在生物医学领域（如生物传感器）中得到多种应用，……

本实验的总体目标是演示如何利用丝素蛋白复合薄膜与电子电路制备多种蛋白质合金材料。以两种不同种类的蚕茧为原料，首先分别再生出各自的蛋白质溶液，以此为例实现上述目标。第二步是将两种不同比例的蛋白质溶液混合，制备一系列混合溶液。接下来，采用薄膜制备技术在玻璃基底上制备电子电路。最后一步是将混合溶液涂覆到玻璃基底上，并将电子电路转移至干燥的蛋白质中。与传统的合成聚合物材料相比，复合薄膜中的蛋白质材料可在人体内提供更好的生物相容性、生物降解性以及可调控性。通过以不同比例混合蛋白质，是一种简便的技术途径，可制备出具有可调物理、化学或生物学特性的合金材料。将该技术扩展至植入式生物医学系统，可实现电子监测，从而增强医疗诊治与治疗效果。此外，该技术还可用于开发在完成使命后可被人体吸收的装置。在本视频中，我们将以野生柞蚕丝和家养桑蚕丝的蛋白质混合物为例，介绍与此相关的实用操作方案，包括如何制备蛋白质溶液以及如何利用电子电路加工成膜材料。与蒸发等其他方法相比，我们的电路涂层技术的主要优势在于，在涂层过程中，蛋白质材料不会受到直接高温或辐射热的影响。开始此操作时，取三克重的未经处理的野生tssa蚕丝蚕茧并将其剪碎。用蒸馏水注满一个两升的玻璃烧杯，然后将该烧杯放置于加热平台上。用铝箔覆盖并加热至沸腾。移去铝箔盖子，缓慢加入三克碳酸氢钠至沸水中，使其完全溶解。待碳酸哽钠完全溶解后，将野蚕丝茧放入沸水中，继续煮沸两到三小时。煮沸后，用刮勺小心地将蛋白质纤维从溶液中取出，并挤压以去除多余的水分。接着，将纤维浸入装有冷蒸馏水的两升烧杯中，每次清洗30分钟，共清洗两次，以彻底去除纤维表面的杂质残留。清洗完成后，在通风橱中将纤维干燥至少12小时。将48.784克硝酸钙在玻璃烧杯中加热至65摄氏度，使其熔融形成液体，用于溶解野蚕丝蛋白纤维。然后按照每1克纤维加入10毫升溶剂的比例混合纤维与溶剂。在95摄氏度下溶解纤维5至12小时后，将野蚕丝溶液倒入12毫升透析管中，并在2升蒸馏水中透析。频繁更换蒸馏水，以去除溶液中的硝酸钙溶剂。三天后，从透析盒中收集蛋白质溶液，并将其放入可耐受 13,000 RPM 的离心管中。随后在 4°C 条件下，以 3,500 RPM 离心一小时。完成后再重复三次以去除残留物。收集另一种天然蛋白（如家养桑蚕丝）后，将最终溶液存放在4°C冰箱中。使用适当的皂剂和溶解溶剂重复上述过程，直至获得浓度已测定的最终蛋白水溶液。接下来，使用移液器缓慢混合一份重量百分比的野生蚕丝溶液与一份重量百分比的家养蚕丝溶液，并将最终溶液置于 4 摄氏度保存，以避免蛋白质聚集。为了在玻璃基底上制备电路图案，首先使用去脂溶剂（如 Hinox）及超声波清洗器对载玻片清洗五分钟，随后分别用丙酮清洗五分钟，再用甲醇清洗五分钟。使用由180升液氮杜瓦瓶蒸发产生的干燥氮气吹干载玻片。此时，将基底材料引入沉积室，并将负载锁抽真空至30毫托（mTorr）的压力。然后打开负载锁与主沉积室之间的闸阀，将基底材料引入沉积室中。打开氩气和压力调节器，将压力控制至所需的沉积压力，以去除靶材预溅射表面的氧化层和污染物，持续数分钟。打开快门后，以特定的沉积速率将金属溅射到基底上，以达到所需的厚度。溅射过程完成后，从腔室中取出镀膜的玻璃载片。使用匀胶机将正性光刻胶旋涂在薄膜表面。光刻胶旋涂完成后，在90°C下软烘5分钟以干燥光刻胶。完成后，将带有器件图案的接触式掩模版紧密贴合在光刻胶表面。将光刻胶置于1000瓦的紫外光源下照射10秒。随后，将胶片放入光刻胶显影液中，直至投影图像显现。图像一出现，立即将胶片浸入去离子水中，以终止显影液对未曝光光刻胶的作用。然后用干燥的氮气吹干薄膜。将薄膜置于120摄氏度的烘箱中加热15分钟，以对光刻胶进行坚膜。待薄膜冷却后，将其放入刻蚀液中，直至未被光刻胶保护的金属层剥离。将薄膜浸入水中以终止刻蚀。随后，用丙酮冲洗薄膜以去除固化的光刻胶，再用甲醇冲洗薄膜，并用干燥氮气吹干。当涂覆好的玻璃准备就绪后，将不同的蛋白质合金溶液滴加到玻璃表面。使用移液器在通风橱中干燥至少12小时，以在玻璃上获得蛋白质合金薄膜。随后，用镊子将带有薄金属图案的蛋白质合金薄膜从玻璃基底上剥离下来。为了获得不溶性蛋白质合金材料，将干燥的薄膜置于真空烘箱中，温度设为60摄氏度，压力为25千帕，并在腔体底部放置一个盛水的培养皿。抽空烘箱中的空气，使水蒸气充分作用于样品至少两小时。待真空释放后，将样品从烘箱中取出，用镊子从基底上剥离不溶于水的薄膜。最后，测试蛋白合金薄膜上金属图案的电阻，并将其与玻璃基底上的原始图案进行比较。典型的蛋白质-蛋白质相互作用可能包括静电吸引、氢键、疏水-亲水相互作用，以及蛋白质特定结构域之间的偶极-溶剂-反离子和熵效应。这些相互作用的影响可以通过拉伸模拟过程中的计算模拟进行预测。一种蛋白质可形成类似弹簧的弹性网络，为材料提供超强弹性；而另一种蛋白质则可作为具有强物理交联能力的颗粒，用于材料中。不同结构域中可诱导产生动态的结构转变，以实现能量的存储与释放，或提供额外的机械支撑。蛋白质合金溶液可被加工成多种具有可调特性的生物材料，包括适用于热学、力学、光学、电学、化学或生物医学应用的材料基质。在本实验中，采用两端法和四端法测量了蛋白质薄膜上电路在室温下的电阻率。在双端测量中，薄膜的电阻率为3.6×10⁻⁷ Ω·m，约为体材料的20倍。相较于体材料，薄膜测得的电阻率更高是典型现象，这是由于电流路径已受限，且载流子难以避开缺陷所致。通过调节蛋白质组分的比例，我们可以调控最终材料的生物物理特性，例如其弹性、强度、表面粗糙度或表面电荷。这些特性最终会影响附着于材料上的组织的功能与行为。因此，蛋白质合金体系为我们提供了一条未来制备具有可调功能的可植入医疗器械或材料的新途径。观看本视频后，您应能充分了解如何在这些材料上制备电路，我们希望文章中提供的实验方案将对未来多个生物医学领域的科研人员和临床医生有所帮助。

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设计丝绸蚕丝蛋白合金生物医用材料

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