Name: 早期变质插入技术昆虫飞行行为监控 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 19 min 14 s
Description: 学习早期变质插入技术，在Manduca sexta蛹期植入电极，实现神经肌肉组织的机械稳定与电学可靠耦合，用于研究昆虫飞行神经生理学动态。该技术为昆虫神经生理学研究提供了重要方法。

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A.B. 感谢美国国家科学基金会对网络物理系统项目（1239243）和本科教育处（1245680）的资助；同时也感谢美国国防高级研究计划局（DARPA）对本研究早期阶段的支持。本研究的早期工作由 A.B. 在康奈尔大学 Amit Lal 教授的实验室中完成。A.B. 感谢 Ayesa Sinha 和 Lal 教授在该阶段提供的实验指导和创意启发。Manduca sexta（Linnaeus 1763）来自美国北卡罗来纳州达勒姆市杜克大学生物系维持的种群。实验所用蛾类均在其羽化后5天内使用。我们感谢 Triangle Biosystems International 公司，特别是 David Juranas 和 Katy Millay，提供了出色的技术支持以及 Neuroware 系统的使用。我们还感谢 Will Caffey 在实验过程中提供的帮助。

注意：本实验方案所需材料与试剂的来源详见下表“试剂”部分。
1. 准备用于记录电极连接的印刷电路板（PCB）
注意：为了提供一种实用的实验操作步骤，需将导线电极焊接到印刷电路板（PCB）上，以便将这些电极插入扁平柔性电缆（FFC）连接器中。
<ol>
	<li>裁剪一块 0.5×5 cm2 的覆铜板。</li>
	<li>使用细头记号笔，在板上绘制三个 0.1×5 cm2 的矩形焊盘，作为蚀刻掩模图案。</li>
	<li>在通风橱或通风良好的区域中，使用印制电路板（PCB）蚀刻剂蚀刻暴露的覆铜板。用惰性胶带覆盖裁切部分约 1 cm 长度。向量筒烧杯中加入至少 100 ml 的 PCB 蚀刻剂，并用透明胶带将覆铜板固定在烧杯内壁，使覆铜板的一半浸入蚀刻剂中。</li>
	<li>将烧杯置于旋转平台上，持续 20 分钟。</li>
	<li>将覆铜板从蚀刻剂中取出，放入盛有水的烧杯中浸泡 10 分钟。</li>
	<li>用纸巾蘸取异丙醇，擦除标记，暴露出未被蚀刻的铜焊盘。</li>
	<li>将印制电路板切割成若干边长约 1 cm 的小方块。</li>
	<li>使用锋利刀片将两段带涂层的退火不锈钢丝（涂层直径 0.11 英寸，裸丝直径 0.008 英寸）各切成 3 cm 长。这些不锈钢丝即为将插入昆虫胸腔的活性电极。</li>
	<li>使用刀片从每根导线的两端去除 4–5 mm 的塑料涂层。建议在显微镜下操作。</li>
	<li>截取一段 0.7 cm 长的绝缘不锈钢丝，作为接地电极的尖端延长部分。用刀片小心去除涂层，或如步骤 1.9 所述，使用电烙铁加热熔化涂层。</li>
	<li>为接地连接，截取一段长度为 4.5 cm 的柔性导线（利兹线或电感线）。</li>
	<li>将步骤 1.10 中制备的 0.7 cm 不锈钢丝焊接到步骤 1.11 中制备的接地连接导线上。接地连接末端应露出一段不锈钢尖端。</li>
	<li>使用惰性胶带将制备好的电极板牢固地固定在焊接工作区。用胶带遮蔽电极板上除 1–2 mm 以外的所有焊盘区域，仅留出将要焊接电极的位置。该被遮蔽且无焊料的焊盘末端将插入步骤 4.1 中所述的 FFC 连接器。</li>
	<li>对齐三根电极导线，使每根导线的一端可焊接到电极板上对应的焊盘。在电极焊盘上涂抹不锈钢助焊剂，以利于焊接。</li>
	<li>将各暴露的电极焊接到焊盘上。</li>
	<li>将电极先后浸入丙酮和异丙醇中各 10 分钟，以清除焊渣。使用超声波清洗仪可提高清洁效果。</li>
</ol>
2. 手术植入至 烟草天蛾（Manduca sexta） 蛹
注意：昆虫在昼夜交替期间最为活跃。因此，应使用自动插座定时器在昆虫培养箱内建立人工昼夜循环，设定为模拟7小时黑暗和17小时光照的周期。
<ol>
	<li>每天检查烟草天蛾（Manduca sexta）蛹，以确定合适的电极插入时间。通常在翅膀出现深色斑点约一天后，蛹即适合进行电极插入。</li>
	<li>为使蛹麻醉，将其置于冰箱（4°C）中约6小时。</li>
	<li>准备电极插入的工作区域。工作区应配备异丙醇、尖头镊子、刀片和30 G皮下注射针头。可选地，可使用氰基丙烯酸酯胶水以增强电极的固定效果。</li>
	<li>通过将针头、镊子和电极浸入或擦拭异丙醇进行消毒。</li>
	<li>将蛹从冰箱中取出，并转移至工作区。</li>
	<li>确定胸部对应目标肌群的位置。本示例研究的重点是负责翅膀上拍运动的背腹肌。</li>
	<li>使用锋利刀片，轻轻在体壁外层划出一个1×1 cm2的矩形区域，并用镊子缓慢剥离该区域的表皮。</li>
	<li>（可选）使用真空装置清除胸部暴露区域的翅毛。</li>
	<li>将针头缓慢插入中胸约5 mm深，插入位置应位于翅膀与胸部连接处，形成两个针对目标肌群的穿刺点。</li>
	<li>使用镊子将两个记录电极引导插入上述两个穿刺点中。</li>
	<li>（可选）为提高机械稳定性，用导线涂抹器在胸部每个穿刺点周围充分涂抹氰基丙烯酸酯胶水，并清理电极周围的毛发。</li>
	<li>准备一个成虫羽化用的笼子，笼壁和顶部应覆盖适当材料（粗糙且有纹理），以便昆虫羽化后能够攀爬。可使用打孔纸板盒或包装纸。</li>
	<li>准备一根长约6 cm、直径约2 mm的刚性固定棒。塑料搅拌棒、棉签或金属丝均可用于此步骤。</li>
	<li>小心地将此固定棒从喙管下方的孔洞中穿入。</li>
	<li>将固定棒两端固定在笼壁表面，防止蛹滚动。将蛹置于笼内，使中胸朝上。过度移动可能导致电极损伤、血淋巴流失或使插入失效。</li>
</ol>
3. 将接地电极插入烟草天蛾（Manduca sexta）
注意：应将接地（参考）电极插入腹部或胸部的远端部位，以避免信号耦合。该插入操作可在蛹发育的后期阶段进行，也可在昆虫羽化后进行。无论计划在蛹期还是成虫期插入接地电极，都必须在蛹期制备好接地电极的开窗位置。
<ol>
	<li>对于蛹期插入：在剥离活动电极周围的中胸表皮后（见步骤2.7），使用30 G皮下针头在靠近胸部的腹部背侧外角质层上刮出另一个矩形区域（约0.5×0.5 cm2）。按照第2节所述技术，将接地电极插入此窗口。</li>
	<li>对于成虫期接地电极插入：昆虫羽化后，将其置于4 °C冰箱中6至24小时以固定不动。 
	后续步骤在蛹期和成虫期插入中均相同。</li>
	<li>准备插入操作区域，包括异丙醇、尖头镊子、30 G皮下针头、氰基丙烯酸酯粘合剂、一段用于涂胶的金属丝、热灼器（可选）以及牙科蜡棒（可选）。</li>
	<li>在记录电极后方约1-2 cm处的腹部后段，确定一个插入点。</li>
	<li>缓慢插入针头以刺破腹部，形成电极插入位点。</li>
	<li>用镊子小心地将接地电极插入该位点，并施加压力使其深入3-4 mm。固定电极位置，并用金属丝将胶水涂抹于插入部位周围。</li>
	<li>（可选）为增强机械稳定性，可使用热灼器在尖端熔化收集一小滴蜡（2-3 mm），将尖端靠近插入部位并加热，使蜡包裹电极并牢固固定其位置。</li>
</ol>
4. 适配板的制备
注意：需要使用转接板通过 FFC（扁平柔性电缆）连接器将电极板连接到无线记录前置放大器。为此，需按照步骤 1.1 至 1.7 制备一块与电极板类似的电路板。
<ol>
	<li>将FFC连接器焊接到已准备好的电路板一端。</li>
	<li>将三根30 AWG（美国线规）导线焊接到另一端的三个焊盘上。</li>
	<li>根据下一阶段的说明，将三个微型连接器焊接到适配板上的三个焊盘，用于示波器读数。</li>
	<li>将这三根导线的另一端焊接到前置放大器连接器上。</li>
	<li>将前置放大器电路板固定在悬浮框架的顶部。</li>
</ol>
5. 使用示波器进行预录制（可选）
注意：为了评估电极的可靠性并观察信噪比，可在部署无线记录系统之前获取有线示波器记录。应使用转接板上的微型导线连接器进行此项操作。
<ol>
	<li>将示波器连接至细胞外神经记录放大器。将放大器参数设置为高通截止频率 1 Hz，低通截止频率 20 kHz，增益为 100。</li>
	<li>将适配板上的每个雌性微型导线连接器连接至放大器的输入通道。</li>
	<li>当昆虫处于活跃状态（黎明时段）时，将其从饲养笼中取出。在测量前，在昆虫下方放置一张纸巾供其静止休息。</li>
	<li>使用镊子将电极板滑入适配板上的 FFC 接口。当昆虫静止时，观察示波器上平坦且低电压的基线；当昆虫拍打翅膀时，可观察到肌电图（EMG）尖峰信号。 
	注：有关示波器结果的代表性示例，请参见第 6 节：使用无线记录系统观察昆虫飞行。</li>
	<li>根据需要调整示波器的显示参数。捕获示波器上的数据并保存。</li>
</ol>
6. 使用无线记录系统观察昆虫飞行
注意：可构建一种电磁悬浮平台，用于在束缚状态下对烟草天蛾（Manduca sexta）飞行期间进行无线肌电（EMG）信号记录。该悬浮平台由一个框架构成，设计用于平衡束缚装置。悬浮结构使得框架及附着其上的昆虫在测试过程中可自由偏航，而无需受束缚导线的限制。该框架可通过熔融沉积成型（FDM）设备快速原型制造。需在框架底部安装磁铁，使其可通过基座平台中的一组磁铁实现悬浮。昆虫通过连接至框架顶部悬挂的FFC连接器进行固定。该悬浮平台置于LED刺激场内，刺激场由60块面板构成，每块面板包含5×7阵列的独立LED。该系统基于果蝇视觉刺激环境构建的成熟方法15,16,17。刺激场由微控制器控制，可模拟顺时针与逆时针旋转，并可调节旋转速度。
<ol>
	<li>通过将头戴装置连接到悬浮平台上的适配器板连接器，设置无线记录系统。</li>
	<li>当昆虫处于活跃状态时（最好在其黎明活动期），将其从笼中取出。</li>
	<li>使用镊子小心地将电极板插入悬浮框架上的FFC接收端口中，使昆虫在装置内稳定悬浮。</li>
	<li>将磁棒靠近头戴装置上的磁性开关以激活无线数据传输。蓝色指示灯亮起，表示头戴装置已激活。</li>
	<li>关闭房间灯光以实现完全黑暗环境。可使用红灯为房间提供照明。在计算机上打开遥测数据采集软件，并选择相应的预加载配置文件（如提供）。启动数据采集以开始查看信号。</li>
	<li>在无线记录系统上选择相应的用户界面以观察EMG信号，确保无线连接和电极工作可靠。</li>
	<li>打开所有LED实验区组件：稳压直流电源和微控制器。微控制器可调节循环光模式的每分钟转速，并可控制光旋转的方向。</li>
	<li>在实验区内缓慢平衡悬浮平台。仔细将框架对准悬浮底座中心，否则框架会迅速被拉向地面，可能导致昆虫受伤。</li>
	<li>启动视频记录系统。</li>
	<li>选择软件界面中的相应记录选项卡。设定记录时间和文件保存路径。选择适当的输出设置以保存数据。点击开始按钮，在软件中启动记录会话。这将保存可导入数值计算环境的数据文件。</li>
	<li>观察昆虫是否沿LED移动方向飞行。反转LED方向，并确认昆虫随之反向飞行。可根据需要重复此操作多次。</li>
</ol>

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</ol>

作者在本研究中无利益冲突。

在手术植入记录电极的过程中，有几个关键步骤会影响后续实验步骤中的数据记录能力。记录电极应在蛹体背部出现翅斑后一天插入。如果插入操作在此时间点之后两天或更久才进行，昆虫的组织将没有足够时间在电极周围发育并使其稳定。这可能导致成虫阶段植入电极发生移动，从而造成记录结果不可靠。
记录电极插入蛹期飞行肌的深度不得超过5 mm，否则血淋巴会从插入点渗出，导致飞行肌发育较弱。如果出现血淋巴渗出，应立即停止操作，让蛹恢复24小时后再尝试插入电极。在将电极插入蛹体前，应彻底清除插入部位的所有翅毛，以防止毛发进入插入孔并干扰电极与组织之间的接触界面。
为了确保成年蛾翅膀的健康，应在羽化前一天使用镊子重新清理插入部位的翅毛。此外，建议使用镊子松动之前用皮下注射针头切开的角质层窗口边缘，以帮助蛾在次日顺利羽化。如果角质层窗口边缘附近有胶水或血淋巴干涸，蛾在羽化后将无法充盈其翅膀，该样本将无法用于实验。
尽管插入时间以天数给出，但由于变温动物的变态发育时间进程取决于饲养温度，这些时间可能会略有差...

将电极甚至带有电子系统的装置植入昆虫体内，用于遥测记录，一直是研究神经系统在自然飞行过程中如何发挥作用的主要方法1。然而，在昆虫体内附着或植入人工系统面临诸多挑战，尤其是可能干扰昆虫的自然飞行行为。成虫体表附着或外科手术植入的人工平台并不可靠，因为昆虫身体产生的惯性力和应力可能导致植入装置发生位移。此外，体表附着或手术植入的电极也容易被昆虫识别为异物而遭到排斥。同时，植入操作需要去除昆虫外骨骼周围的鳞片和刚毛，还需穿透较厚的角质层以实现神经连接，这可能造成附带的组织损伤，从而影响昆虫的正常飞行。上述种种因素使得外科手术或体表植入操作成为一项复杂而精细的任务。为缓解在昆虫体外附着控制与传感系统所带来的上述问题，本文将介绍一种涉及变态发育过程的新型方法。
完全变态昆虫的变态发育始于幼虫（或若虫）向成虫的转变，并经历一个中间的蛹期（图1）。这一变态过程涉及广泛的组织重编程，包括组织退化继而重塑。该转变使陆生幼虫发育为能够表现出多种复杂行为的成虫2,3。
已有研究表明，昆虫在早期变态阶段接受极端的寄生性外科手术后仍可存活4,5。在此类手术中，发育过程中的组织发生使得手术创口能够在较短时间内得到修复。基于这些观察结果，研究人员开发出一种新技术，即在变态生长的早期阶段植入电导性电极（图1）6。该方法可实现电极在昆虫体表的生物力学稳定附着，同时也能与昆虫的神经及神经肌肉系统建立高度可靠的接口7。该技术被称为“早期变态植入技术”（Early Metamorphosis Insertion Technology，EMIT）8。
在组织系统完全重建后，蛹期形成的结构会随成虫的羽化而显现。飞行肌群可占胸部总质量的65%，因此是EMIT实验方法相对便捷的目标组织9。在基本的翅拍动过程中，驱动飞行的背纵肌（dl）和背腹肌（dv）形态发生变化，从而引起翅关节几何结构的改变以产生升力10。因此，dl与dv肌肉的功能协调一直是飞行神经生理学领域的研究热点。将昆虫固定于电子编程的视觉环境中，是研究复杂运动行为神经生理机制最常用的方法11,12。由发光二极管面板构成的圆柱形实验场已被用于构建此类虚拟现实环境，其中飞行昆虫被固定于中央，通过动态更新周围全景视觉显示来模拟运动。对于果蝇（Drosophila）等体型较小的昆虫，通常通过将金属针固定于昆虫背部胸部，并将该针置于永磁体下方实现固定13,14。该方法仅能借助高速摄像机进行视觉观察，从而量化运动反应，无法开展任何电生理分析。此外，该方法难以有效悬浮体型更大、更重的烟草天蛾（Manduca sexta）。为解决这一问题，我们采用了磁悬浮框架技术，即利用电磁力使底部附有磁体的轻质框架实现悬浮。结合市售的神经信号放大器与LED阵列，该系统为控制烟草天蛾（Manduca sexta）的飞行运动输出并记录其相关电生理活动提供了有效平台。

<table><tbody><tr><td>包被不锈钢丝</td><td>A-M Systems</td><td>791900</td><td>0.008&amp;rsquo;&amp;rsquo; 裸线，0.011&amp;rsquo;&amp;rsquo; 包被，经退火处理</td></tr><tr><td>柔性电极导线</td><td></td><td></td><td>可使用利兹线（Litz）或电感线。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>表面贴装FFC连接器</td><td>Hirose Connector</td><td>FH28E-20S-0.5SH(05)</td><td></td></tr><tr><td>镊子</td><td>Grobet USA</td><td></td><td>使用前需用70%酒精清洁。</td></tr><tr><td>Kim-Wipes 擦拭纸</td><td>Kimberly-Clark Worldwide</td><td>34155</td><td>可使用任意尺寸的精细擦拭纸巾。</td></tr><tr><td>聚四氟乙烯胶带</td><td></td><td></td><td>5 mm 宽的聚四氟乙烯胶带。</td></tr><tr><td>皮下注射针头</td><td>Becton Dickinson &amp; Co.</td><td>30511</td><td>可使用20–30 G的皮下注射针头。视频中展示的是30 G针头。</td></tr><tr><td>刚性固定棒</td><td></td><td></td><td>可使用多种材料（&lt;em&gt;例如&lt;/em&gt;，咖啡搅拌棒）</td></tr><tr><td>昆虫羽化笼</td><td></td><td></td><td>塑料宠物笼，内衬包装纸或类似缓冲材料，需有通风孔。</td></tr><tr><td>热灼器</td><td>Advanced Meditech International</td><td>CH-HI CT2103 (tip)</td><td>可选设备，用于加热牙科蜡。</td></tr><tr><td>牙科蜡</td><td>Orthomechanics LC., Broken Arrow, Oklahoma</td><td></td><td>可选材料，用于稳定昆虫上的电极。</td></tr><tr><td>磁悬浮平台</td><td></td><td></td><td>自行设计并利用3D打印技术制作的定制框架。</td></tr></tbody></table>

早期变态期植入技术用于昆虫飞行行为监测

Early Metamorphic Insertion Technology for Insect Flight Behavior Monitoring

早期变态植入技术（EMIT）是一种新颖的方法，可在昆虫变态发育过程中将其微加工的神经肌肉记录与驱动平台整合到体内。在此过程中，植入物随着变态期间组织的重塑而融合于神经肌肉系统的结构与功能之中。当昆虫发育成熟时，植入物随之显现，且在蛹期发育过程中，组织在电子元件周围生长，形成生物电与生物力学性能增强的组织界面。相较于成虫阶段植入所引发的创伤效应，这种相对更可靠且稳定的界面将有利于众多研究者探索昆虫运动的神经基础。本文中，我们将电极植入烟草天蛾（Manduca sexta）的间接飞行肌内。这些主要的飞行动力肌群——背腹肌与纵背肌，位于胸部背侧，负责驱动翅膀，为上下拍打提供机械动力。目前已有研究致力于探究这两组肌肉的相对收缩如何在神经生理学层面协调偏航（yaw）动作。为了表征飞行动态，通常将昆虫通过导线固定，并利用数字相机记录其飞行行为。我们还开发了一种新颖的方法，将烟草天蛾（Manduca sexta）固定于磁悬浮框架上，使昆虫与市售的无线神经信号放大器相连。该装置可用于限制昆虫仅在偏航方向上自由运动，同时传输来自背腹肌与纵背肌群的相关肌电图信号。

整体EMIT流程的示意图见图1，展示了天蛾变态周期的主要阶段以及相应的电极植入步骤。电极植入应在羽化前4至7天的晚期蛹阶段进行。这使得肌纤维能够在电极周围发育，从而将植入物牢固地固定在昆虫体内。
完成晚期蛹期阶段插入的典型结果如图2所示，其中两个记录电极和接地电极均已插入。
完成成年阶段插入后的典型结果如图3所示，其中两个有源电极和接地电极均已插入。
用于诱导 Manduca sexta 飞行过程中转向的LED arena如图4所示。通过编程微控制器以控制LED阵列垂直图案的旋转速度，LED图案的角速度设定为7.3度每秒。将磁悬浮平台置于LED arena的中心，使昆虫能够自由地响应LED阵列而转动。
图5显示了在翅膀拍打前后，通过...

我们介绍一种在烟草天蛾（Manduca sexta）早期变态阶段植入电极的新型外科手术方法。该技术可实现与神经肌肉组织在机械上的稳定性和电学上的可靠连接，用于研究飞行神经生理学动态。我们还介绍一种用于束缚昆虫偏航研究的新型磁悬浮平台。

早期变态插入技术（EMIT）是一种新型方法，用于将微加工的神经肌肉记录与刺激平台整合到……

大家好，我是来自阿尔伯特·博斯博士实验室的 Alex Derber，隶属于北卡罗来纳州立大学电气与计算机工程系。今天我们将演示一种在性器官发育早期变态阶段植入电极的新型外科手术方法。在此过程中，即早期变态插入技术，植入的电极在昆虫蛹期变态阶段被整合到其组织中。该技术的主要优势在于，能够与昆虫的神经肌肉组织形成机械稳定且电学可靠的耦合，从而便于研究昆虫飞行的神经生理学。在成虫阶段，IC Mensa 经历一个约持续 40 天的变态生命周期。曼萨从卵阶段开始其生命周期。经过7到10天后，幼虫将孵化并达到第三龄幼虫阶段。共有五个龄期的幼虫阶段，在每个阶段中，幼虫都会进行能量获取和生长。第五次蜕皮后的5到6天，昆虫将进入早期蛹阶段。在蛹阶段，昆虫的组织会发生广泛的程序性退化，随后进行再生。为羽化为成年蛾做准备，昆虫需要经历17至19天的时间。在幼虫早期阶段，进入晚期幼虫阶段之前，我们在幼虫的背部胸部外科植入一个导电电极。组织会在植入的电极周围发育，从而将电极固定在昆虫体内。在数天的过程中，插入幼虫胸部的电极随着昆虫组织系统的全面重建，在最终成虫阶段（蛾）中成为昆虫身体的一部分。在变态发育过程中，将电极植入胸部的间接飞行肌中。这些肌肉群间接负责翅膀运动，包括背腹肌和背纵肌。本文将演示如何将电极插入背腹肌，该肌肉间接负责翅膀的上拍运动。通过此植入操作，我们将在昆虫进行“ya”运动时，无线记录其背腹肌的肌电图。昆虫被悬浮在电磁悬浮平台上，该平台位于一个可刺激其运动的LED环境中。早期变态期植入技术的操作流程首先需要构建一块印刷电路板，该电路板将作为植入电极与记录仪器之间的接口。将金属丝电极焊接到印刷电路板上，该电路板连接至一个扁平柔性电缆连接器。首先，使用细头永久性记号笔和剪刀，用同一支细头永久性记号笔标记并裁剪一块0.5厘米×5厘米的覆铜板。用记号笔在覆铜板上绘制三个0.1厘米×5厘米的矩形区域作为蚀刻掩模图案。使用直尺等直边工具沿铜箔层压板切口的整个长度进行标记。确保标记清晰粗实，且彼此不重叠。如果标记线相互重叠，电极将发生短路。连接扁平柔性电缆连接器时，应将覆铜板切割件移至通风区域进行操作，最好在通风橱中对覆铜板进行标记蚀刻，以免使电路板报废。操作印刷电路板蚀刻剂时需谨慎，因其具有毒性，如误食或吞咽可造成伤害，且接触皮肤可能引起刺激。将聚四氟乙烯胶带贴于覆铜板切割件的一端，沿长度方向覆盖约一厘米。接下来，使用透明胶带将铜箔层压板切片固定在量杯内壁，使铜箔条的一半浸入蚀刻液中。将量杯置于旋转平台上，旋转 20 分钟。取出蚀刻后的铜箔层压板，放入盛有水的量杯中浸泡 10 分钟。为清洗残留物，将异丙醇涂抹在一块精密擦拭纸上，擦拭标记处以露出未蚀刻的铜焊盘。彻底清除永久性记号笔的所有痕迹。将印刷电路板裁切成边长约一厘米的小方块。现在电路板已蚀刻完毕，需要准备电极以进行连接。建议在显微镜的辅助下完成这些步骤。使用锋利的刀片，将带涂层的不锈钢丝切割成两段，每段长三厘米；该不锈钢丝涂层部分直径为0.11英寸，裸露部分直径为0.008英寸。这些不锈钢丝是将插入昆虫胸部的活性电极。使用剃刀片从每根金属丝的两端各去除四到五毫米的塑料涂层。接下来，进行切割。取一段长 0.7 厘米的绝缘不锈钢丝，用于制作接地电极的尖端延伸部分。用剃刀刀片轻轻刮除涂层，操作方式与前一步骤相同，或使用电烙铁加热熔化涂层。接着，将一段利茨线剪切成 4.5 厘米长。电感线也可用于此焊料。将先前准备好的0.7厘米长的不锈钢尖端连接到Lititz接地连接线上。接地连接端应露出不锈钢尖端。使用聚四氟乙烯胶带将刻蚀好的电路板固定在焊接工作区。将胶带贴在电路板上，使焊盘留出一到两毫米的裸露部分，以便将电极焊接到电路板上。焊盘上被胶带遮蔽、无需焊接的末端将插入FCC连接器中。使用聚四氟乙烯胶带对齐三根电极导线，使每根导线的一端能够焊接到电极板上相应的焊盘。两个工作电极应焊接到电路板边缘附近的焊盘上，接地电极应焊接到中心焊盘上。在电极焊盘上涂抹不锈钢助焊剂以方便焊接。注意避免因焊料过多而导致焊盘连接处短路。将电极分别浸入丙酮和异丙醇中，各清洗10分钟。为了清除焊料残留物，可将溶液分别倒入不同的培养皿或烧杯中。为提高清洁效果，可在浸入过程中将电极置于超声波清洗仪中，并使用清洁溶液。昆虫在昼夜交替期间最为活跃。因此，应使用自动插座定时器在昆虫培养箱内建立人工昼夜循环。定时器应设置为模拟7小时黑暗和17小时光照的周期。每天观察曼杜卡果蝇的眼睛，以确定合适的接种时间。复眼大约在翅膀出现后一天即可进行植入。在封口前七至四天进行深色斑点的植入最为成功。底部颜色较深的复眼已准备好进行电极的外科植入，以麻醉个体。将它们置于4摄氏度冰箱中约六小时。接下来，准备显微操作的工作区域。工作区域应包括异丙醇、锋利的镊子刀片和30号皮下注射针头。可选择使用氰基丙烯酸酯粘合剂以增强电极的固定效果，并通过将镊子和电极浸入异丙醇或用其擦拭的方式进行消毒。六小时后将眼球从冰箱中取出，并转移至工作区。确定背侧胸部对应于目标肌群的位置。本研究关注负责翅膀上拍运动的背腹肌。使用锋利的刀片或皮下注射针头，轻轻在体壁外角质层上划出一个 1 厘米 × 1 厘米的方形区域。然后用镊子缓慢剥离这些碎片。使用镊子去除胸部暴露区域的翅毛。可选择性地使用真空装置辅助清洁过程。应尽可能彻底清除毛发，以避免对插入的电极造成干扰。缓慢将针头插入胸部翅膀附着处的中胸区域约五毫米，形成两个针对肌群的插入点。请记住穿刺孔的位置，因为一旦丢失将难以再次找到。将蛹固定在桌面上，并可选择使用镊子引导两个记录电极进入这两个插入点，以增强机械稳定性。用导线涂抹器在胸部每个插入点周围彻底清理毛发，并大量涂抹氰基丙烯酸酯粘合剂。为昆虫准备ELO用的笼子，笼壁和顶部覆盖粗糙且有纹理的材料，以便昆虫攀爬。羽化后，可使用带孔的纸板箱或包装纸。准备一个刚性固定装置，使用长约六厘米、直径两毫米的细棒。小心地将此细棒穿过突出部分下方的孔洞。塑料搅拌棒。此步骤可使用棉签或金属丝。将棒的两端固定在笼子表面，使蛹无法滚动。将蛹放置在笼内，使中胸朝上。过度移动可能导致电极损坏、失去活力或使插入无效。接地电极应插入腹部或胸部远端部位。为避免信号串扰，可在幼虫发育的后期阶段或昆虫羽化后进行插入操作。无论选择在幼虫阶段还是成虫阶段插入，接地电极的插入位置都需在此幼虫阶段进行准备。本文演示的是成虫阶段接地电极的插入操作。将蛾置于4°C的冰箱中6小时。进行冷处理固定时，准备操作工作区，包括异丙醇、尖头镊子、30号皮下注射针头、氰基丙烯酸酯胶水、用于涂胶的金属丝，可选的热灼器和可选的牙科蜡棒。与之前相同，在接触蛾体前，先将皮下注射针头浸入异丙醇中；将蛾体固定后，在靠近记录电极后腹部约1至2厘米处选定注射位点，缓慢插入针头以刺穿腹部，形成注射通道。针头插入深度不应超过四毫米。如果在插入部位出现血淋巴，说明针头插入过深，导致实验成功率降低。使用镊子小心地将接地电极插入插入部位，并施加压力，使其深入至三到四毫米。固定电极位置，并用导线在插入部位周围涂抹胶水（此步骤可选）。为进一步增强插入部位的机械强度，可使用热灼器，在尖端收集一小块2至3毫米的蜡滴。将尖端靠近插入部位并加热，使蜡包裹电极并将其牢固固定。冷却后，让昆虫恢复一天时间以从插入操作中恢复，然后再进行实验。需要使用一块带有扁平柔性电缆连接器的转接板，将昆虫上的电极板连接至三角Biosystems国际头级单元。该转接板采用蚀刻铜覆层板制成，需按照此前在焊台处制备电极板边缘的步骤进行准备，并在制备好的板一端焊接一个扁平柔性电缆连接器。可将一个10针扁平柔性电缆连接器焊接到电路板上，使连接器两侧的两对引脚和中间的一对引脚分别与三个铜焊盘接触。然后将三根30美国线规的连接导线焊接到三个焊盘上。在电路板的另一端，将三个微型连接器焊接到适配板上的三个焊盘上，用于连接示波器读取信号，具体方法如上所述。在下一阶段，将两个连接器垂直于电路板边缘放置。中心连接器应略微向上倾斜，远离电路板平面，并将这三根导线的另一端连接至头部连接器。由 Triangle Biosystems International 提供。然后应将头端电路板固定在悬浮框架的顶部，以提高电极的可靠性并观察信噪比。可获取有线示波器记录。在部署无线记录系统之前，将示波器连接至多通道交流神经记录放大器。将放大器参数设置为高通截止频率1赫兹，低通截止频率20千赫兹，增益为100。将转接板上的每个雌性迷你导线连接器连接至放大器的输入通道。从饲养笼中取出植入电极板的昆虫。当组织处于活跃状态时，可将一块组织置于飞蛾下方使其 resting（静息），然后使用镊子将电极板滑入适配器板上的扁平柔性电缆连接接口。移除昆虫下方的组织，观察肌电图尖峰信号的产生。当昆虫拍打翅膀时，用示波器捕获并保存数据。该图显示了使用示波器在翅膀拍打前后从某块肌肉获取的肌电位信号。信号经过了一百倍放大处理，并使用了1赫兹的高通滤波器和20千赫兹的低通滤波器，以及静息期处理。未观察到肌肉电位。翅膀拍打过程中肌肉电位的频率约为15至20赫兹。在完成并验证示波器测量后，应采集无线肌电图（EMG）信号。可构建电磁悬浮平台，用于在束缚状态下雄性六足昆虫飞行期间无线记录EMG信号。悬浮平台由一个用于平衡系线装置的框架构成。自由漂浮的悬浮状态使得框架以及其上的昆虫能够 ya。在不使用系线导线约束的测试过程中，该框架可通过熔融沉积成型机进行快速原型制作。这个带有磁体的框架由基座平台中的一系列电磁铁悬浮支撑。该悬浮平台位于LED arena内部，arena由60块面板构成，每块面板包含5×7阵列的独立LED。arena由APIC 18 F 45 20微控制器控制，可模拟顺时针和逆时针旋转，并可调节旋转速度。设置 TBSI 无线记录系统。将 TBSI 头级连接到悬浮平台上的转接板连接器。在昆虫活跃时（最好在其黎明活动期）将其从笼中取出。使用镊子。小心地将电极板插入悬浮框架上的扁平柔性电缆接口中，使昆虫稳定地悬挂在装置内。将磁力笔靠近头部支架上的磁性开关，以激活无线数据传输。指示灯将亮起蓝光，表明头部固定装置已激活并准备就绪，可进行记录。关闭房间内的灯光以确保完全黑暗，并在计算机上打开 TBSI Neuro Aware 软件。您可以使用红灯为房间提供额外照明。选择适当的配置文件。本实验步骤中使用的配置文件为默认的 W five 设置。然后点击初始界面左上角的“开始运行”按钮。开始观察信号时，选择 TBSI 记录系统中的所有通道窗口标签，以观察肌电图（EMG）信号。为确保可靠的无线连接和电极正常工作，请打开所有 LED arena 组件、稳压直流电源和微控制器。缓慢调节悬浮平台，使其在 arena 内保持平衡。在 nor aware 界面左侧面板中选择“二进制”选项卡。设定录制时间及文件保存位置。选择适当的输出设置以保存您的数据。单击开始按钮，以在TBSI记录软件中启动记录会话。这将把您的文件保存为.next文件，该文件可导入常用的数据处理程序中。观察昆虫是否朝与LED移动方向相对应的方向飞行。反转LED的移动方向，并确认昆虫是否随之改变飞行方向。可根据需要重复此操作多次。图中箭头指示LED图案的旋转方向。箭头变为黄色。当昆虫完成逆时针转向时，箭头变为蓝色；当昆虫完成顺时针转向时。所示的影片播放速度比正常速度快50%。该图显示了在静止期翅膀拍打前和拍打期间，通过无线仪器从一块肌肉获取的肌电位信号。未观察到肌电位。翅膀拍打期间的肌电位频率约为15至20赫兹。这里我们刚刚展示了一通道记录。然而，使用该装置进行的多通道记录可用于观察飞行过程中多个肌群之间的协调活动。我们刚刚向您展示了如何在雄性个体从蛹期向成虫期转变的早期阶段进行电极植入。在瞳孔期的后期阶段进行插入操作至关重要，以确保插入时间既不过早也不过晚。否则，可能难以获得稳定的电极装置。我们还向您展示了如何组装必要的电子元件，以便在昆虫被悬浮于LED arena中时，对间接飞行肌进行无线EMG数据记录。感谢观看，祝您的实验顺利成功。

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