Name: 成神经细胞迁移的小鼠急性脑片在体内电穿孔产后和时间推移成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-25T21:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: 了解成神经细胞迁移的研究方法，通过体内电穿孔技术在小鼠侧脑室导入GFP质粒，制备急性脑切片并进行延时成像，实现神经发生过程中细胞动态追踪与定量分析。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

M.S. 和 Y.Z. 获得伦敦国王学院（KCL）及 KCL-中国博士生奖学金的支持。M.O. 获得英国生物技术和生物科学研究生理事会博士生奖学金的资助。我们感谢 Masaru Okabe 和 Jun-ichi Miyazaki 提供 pCX-EGFP 质粒，以及 Alain Chedotal 和 Athena Ypsilanti 在电穿孔实验方面提供的宝贵建议。

本实验程序遵循英国国内事务部法规（《动物科学实验法案》1986年）。科研人员应遵守其所在机构及国家动物管理机构制定并批准的指导原则。
1. 出生后电穿孔
1.1. 玻璃毛细管、DNA 溶液和电穿孔仪的准备
<ol>
	<li>准备用于 DNA 注射的拉制玻璃毛细管（外径：1.5 mm，内径：0.86 mm）。（Sutter P-97 毛细管拉制仪的参考设置为：加热温度 283；拉力 50；速度 90；时间 50）。在毛细管上标记出对应体积约为 2 µl 的位置。</li>
	<li>将电穿孔仪的电压设置为 5 次方波脉冲，每次脉冲持续 50 毫秒，电压 100 V，脉冲间隔 850 毫秒（100 V，脉冲开启 50 毫秒，关闭 850 毫秒，共 5 次脉冲）。</li>
	<li>使用无内毒素的 Tris-EDTA 缓冲液或 PBS 将高纯度（OD 260/280 &#62; 1.80）、无内毒素的质粒 DNA 稀释至终浓度为 1–2 µg/µl。建议在 DNA 溶液中加入 0.1% 快绿染料（成功注射后，染料应在脑室中扩散）。</li>
	<li>准备 5–7 mm 的电极、电极凝胶，并预热加热板。</li>
</ol>
1.2. 电穿孔
<ol>
	<li>从笼中取出一只出生后第2天的小鼠幼崽，通过吸入异氟烷（流量约为0.6 L/min）进行麻醉。</li>
	<li>约1分钟后，通过夹捏足部观察反应以判断麻醉状态。若无任何运动反应，则进行脑室内注射。</li>
	<li>使用连接毛细管的吸管，吸取1-2 µl DNA并加载至毛细针中。</li>
	<li>在冷光源下，用非惯用手的拇指和食指夹住幼鼠头部。轻轻向后拉头部皮肤，以帮助确定正确的注射位点。</li>
	<li>设想一条连接眼点与颅骨解剖标志点人字点（lambda）的虚拟直线图1A）。将毛细管针插入此线从人字缝起约三分之一处（距线段中点约1 mm）15将毛细管插入约2 mm深度，注意避免在脑组织中过深穿入。</li>
	<li>通过口部缓慢吹气将质粒注入（也可使用连接至毛细管的注射器）。操作过程中，务必确保手指未对脑组织施加过大压力，以免影响质粒注射的成功率。</li>
	<li>当毛细管中仅剩少量DNA溶液时停止注射。建议注射量少于1 µl，以避免颅内压有害升高。</li>
	<li>将两个电极均涂上凝胶，并将电极放置于注射了DNA的大脑半球外侧，正极置于该侧图1A。为了将DNA整合到喙侧SVZ，将电极放置在注射点稍靠前的位置。通过调整电极位置，可在SVZ的不同区域实现电穿孔的区域特异性。22,25.</li>
	<li>通过按压脉冲脚踏开关启动电流传递。电穿孔完成后，检查电穿孔仪显示屏上的电压（电压值不应低于90 V，因为较低电压&#160;数值与电穿孔效率低下相关。</li>
	<li>在加热垫上用氧气复苏幼崽数分钟，然后将其放回笼中，远离母鼠。确保母鼠将幼崽叼回并与其他幼崽聚集在一起。电穿孔后，将幼崽与其母鼠共同饲养4至7天，再进行下一步操作。</li>
</ol>
2. 急性脑片培养物的制备
2.1. 溶液与工具的准备
<ol>
	<li>需要准备以下溶液（也可使用高糖 DMEM 用于解剖和成像17）： 
	解剖液（500 ml） 
	Gey's 平衡液 - 500 ml 
	45% 葡萄糖 - 5 ml 
	成像液（10 ml） 
	45% 葡萄糖 - 0.110 ml 
	HEPES&#160;1 M - 0.100 ml 
	青霉素/链霉素 - 0.100 ml 
	胎牛血清 - 0.500 ml 
	B27 - 0.100 ml 
	谷氨酰胺 - 0.200 ml 
	无酚红 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）- 8.89 ml</li>
	<li>将成像液预热至 37 °C。</li>
	<li>将 Millicell 插入式培养小室放入含 1 ml 成像液的 35 mm 玻底培养皿中，并置于 37 °C、5% CO2 的湿润培养箱内。</li>
	<li>准备振动切片机配件（螺丝刀、切片室、刀片、胶水）。</li>
	<li>准备解剖工具：剪刀、小刮匙、直头镊子。</li>
	<li>准备切片操作工具：小号画笔或软质接种环（规格：10 µl）、塑料巴斯德吸管、冰盒以及若干 6 cm 塑料培养皿。</li>
	<li>将解剖液预冷至 2–4 °C。</li>
</ol>
2.2. 脑切片的制备
<ol>
	<li>用预冷的解剖液填充一个6 cm的培养皿，并将其置于冰上（用于保存 freshly cut 的脑片）。</li>
	<li>经颈椎脱位处死幼鼠后，使用剪刀将其头部剪下。用手术刀去除头皮，沿从嗅球（OB）至小脑的正中矢状缝剪开颅骨，用镊子轻轻掀开颅骨瓣，确保完全暴露脑组织。随后用解剖铲小心地将脑组织完整剥离，注意避免损伤组织。解剖操作需迅速而轻柔（尽可能在1分钟内完成）。&#160;我们优先采用颈椎脱位法，因为药物或气体麻醉剂的终末麻醉可能影响神经母细胞的迁移特性以及脑片培养物的健康状态，而这些脑片需在动物处死后尽快进行成像。</li>
	<li>用刀片将脑组织沿中线切成两半（图2）。丢弃未注射的一侧脑半球，或将其用于其他实验。</li>
	<li>在振动切片机的持样器上贴一小块胶带，并使用尽可能少的胶水将脑半球固定于其上（图2）。此举可防止因反复涂抹胶水而损坏持样器表面。</li>
	<li>让胶水干燥数秒钟。</li>
	<li>将持样器放入盛有预冷解剖液的振动切片机槽中，使嗅球朝向刀片（图2）。</li>
	<li>使用适当的参数开始切割脑半球。推荐以下设置：切片厚度300 µm；速度~3-5；频率~9。建议采用高频率和低速度以避免切片损伤。</li>
	<li>使用小号画笔或柔软的接种环收集切片。仅保留可见嗅球（OB）的切片（通常每脑可得2-3片）。通常，包含大部分迁移路径（RMS）的切片位于底部表面约300 µm处。</li>
	<li>在标准荧光显微镜下检查切片的GFP信号（需翻转切片以观察两面的荧光），选择在大部分RMS区域呈现明亮荧光的切片。</li>
</ol>
2.3. 培养脑切片
<ol>
	<li>在细胞培养操作台中，剪除脑片最尾端的三分之一，并使用精细直头镊子或显微解剖刀去除任何胶水残留。</li>
	<li>用塑料巴斯德吸管轻轻吸取脑片（将吸管尖端剪去一部分以形成更大的开口，从而避免损伤脑片），并将脑片置于预热的Millicell插入式培养插件中央。</li>
	<li>确保荧光信号最强的一面与Millicell插入式培养插件接触（以便使用倒置显微镜进行成像）。</li>
	<li>用移液器吸除插件表面多余的解剖液。</li>
	<li>将脑片培养物置于37 °C/5% CO2培养箱中静置至少1小时，然后再进行成像。</li>
</ol>
3. 神经母细胞迁移的延时成像
<ol>
	<li>至少在成像前2小时，打开Perkin Elmer UltraViewVoX共聚焦转盘系统、尼康Ti-E倒置显微镜、Hamamatsu C10600-10B（ORCA-R2）冷却型数字CCD相机，以及设定为恒温37 °C的加热系统（Solent Scientific）。</li>
	<li>打开 Volocity 软件的采集模块并点击 &#34;VIz&#34; 按钮并选择用于成像的激光器。</li>
	<li>在制备脑切片后的2小时内，将含有脑切片的玻璃底培养皿放入显微镜载物台上的成像室中。</li>
	<li>使用尼康CFI Super Plan Fluor ELWD 20X/0.45物镜，在适当的荧光光源下选择并聚焦待成像的脑片区域（例如 注射部位后 RMS 的第一段降支，或 RMS 的肘部区域，或神经母细胞进入 OB 前肘部之后的区域。</li>
	<li>通过以下操作设置延时成像：
	<ol>
		<li>在显微镜上，点击 L100 按钮以启动激光对样品的扫描。</li>
		<li>在 Volocity 中，通过选择适当的激光打开 UltraVIEW 激光转换器（例如 488 nm 激光用于 GFP。</li>
		<li>根据荧光信号的强度设置曝光时间（通常为100-500毫秒）和激光强度（通常为20-30%）。</li>
		<li>调整图像的数字增益以改善细胞的可视化。</li>
		<li>选择用于成像的z轴层间间隔 内部 脑切片（通常在100-120 µm范围内）。选择含有适量孤立细胞的区间，以尽可能避免细胞重叠（这将有利于后续的追踪分析）。</li>
		<li>选择每个z轴层叠图像之间的间距（通常为2-4 µm）。</li>
		<li>选择每次z轴层扫描捕获之间的时间间隔（例如 3 分钟）和总成像持续时间（例如 3 小时。</li>
		<li>点击 &#34;保存&#34; 单击图标以保存成像参数的更改。</li>
		<li>按下录制按钮以开始成像。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>同一天内交替成像对照样本和实验样本（例如载体/药物处理或转染不同质粒）。</li>
</ol>
4. 分析神经母细胞迁移
<ol>
	<li>在 Volocity 定量模块中，打开完成延时实验后创建的目标库。选择 &#34;扩展焦距&#34; 从左上角的方框（图 4A，步骤1）。</li>
	<li>点击 &#34;测量&#34; 按 Tab 键以显示测量窗口（图4A，步骤 2）。</li>
	<li>屏幕左下方可见任务列表。拖动 &#34;追踪&#34; （在以下条件下呈现） &#34;其他&#34; 列表底部的标题）上方的空白区域。这将弹出一个名为 &#34;追踪&#34; 屏幕左上角图4A，步骤 3）。</li>
	<li>选择 &#34;要点&#34; 来自 &#34;输入&#34; 轨迹窗口中的标签（图 4A，步骤 4）。</li>
	<li>单击点工具（Point Tool）图 4A，步骤5）。</li>
	<li>通过鼠标点击细胞体的中央区域，开始追踪迁移的成神经细胞，并持续追踪细胞运动，直至达到延时成像的最后一个时间点（例如，对于一段3小时的视频，为第61个时间点）。</li>
	<li>选择以获取数据 &#34;创建测量项目&#34; 来自测量菜单（图4B，步骤6-7）。屏幕中央将出现一个窗口。</li>
	<li>在此窗口中，选择 &#34;一种新的测量项目称为：&#34; 并输入一个名称（图 4C，步骤8）。请记住选择 &#34;所有时间点&#34; 在按下“确定”按钮之前选择该选项图4C，步骤9）。在延时文件下将出现一个测量项目文件，其中包含用于定量分析的参数（例如 迁移距离、速度、位移和位移速率</li>
	<li>双击测量项目文件以窗口形式打开它（图4D，步骤10）。</li>
	<li>要可视化已分析细胞的单个轨迹，请选择 &#34;追踪点&#34; 来自 &#34;显示&#34; 选项（图 4D，步骤11）。</li>
	<li>右键单击测量项目文件，将其导出为文本文件，随后可在 Excel 等程序中导入以分析迁移参数。</li>
	<li>为了测量在拍摄期间每个细胞在连续帧之间的运动及停顿，在“测量项目”文件中选择 &#34;显示&#34; 选项 &#34;点&#34; 或 &#34;种群&#34; 并点击 ID（每条轨迹都有一个唯一的 ID）。按照步骤 4.10 中所述方法导出生成的文件。</li>
</ol>

<ol><li>Ming, G. L., Song, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+neurogenesis+in+the+mammalian+brain%3A+significant+answers+and+significant+questions%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Adult neurogenesis in the mammalian brain: significant answers and significant questions.</a> Neuron. 70, 687-702 (2011).</li>
<li>Deng, W., Aimone, J. B., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+neurons+and+new+memories%3A+how+does+adult+hippocampal+neurogenesis+affect+learning+and%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">New neurons and new memories: how does adult hippocampal neurogenesis affect learning and.</a> 11, 339-350 (2010).</li>
<li>Lazarini, F., Lledo, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+adult+neurogenesis+essential+for+olfaction%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Is adult neurogenesis essential for olfaction?</a> Trends Neurosci. 34, 20-30 (2011).</li>
<li>Arvidsson, A., Collin, T., Kirik, D., Kokaia, Z., Lindvall, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+replacement+from+endogenous+precursors+in+the+adult+brain+after+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Neuronal replacement from endogenous precursors in the adult brain after stroke.</a> Nat. Med. 8, 963-970 (2002).</li>
<li>Emsley, J. G., Hagg, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((alpha6beta1+integrin+directs+migration+of+neuronal+precursors+in+adult+mouse+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">alpha6beta1 integrin directs migration of neuronal precursors in adult mouse forebrain.</a> Exp. Neurol. 183, 273-285 (2003).</li>
<li>Sundholm-Peters, N. L., Yang, H. K., Goings, G. E., Walker, A. S., Szele, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subventricular+zone+neuroblasts+emigrate+toward+cortical+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuropathol.+Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Subventricular zone neuroblasts emigrate toward cortical lesions.</a> J. Neuropathol. Exp. Neurol. 64, 1089-1100 (2005).</li>
<li>Doetsch, F., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Network+of+tangential+pathways+for+neuronal+migration+in+adult+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Network of tangential pathways for neuronal migration in adult mammalian brain.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 14895-14900 (1996).</li>
<li>Ming, G. L., Song, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+neurogenesis+in+the+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Adult neurogenesis in the mammalian central nervous system.</a> Annu. Rev. Neurosci. 28, 223-250 (2005).</li>
<li>Pathania, M., Yan, L. D., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+symphony+of+signals+conducts+early+and+late+stages+of+adult+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">A symphony of signals conducts early and late stages of adult neurogenesis.</a> Neuropharmacology. 58, 865-876 (2010).</li>
<li>Belvindrah, R., Nissant, A., Lledo, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+neuronal+migration+changes+the+fate+of+developing+neurons+in+the+postnatal+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Abnormal neuronal migration changes the fate of developing neurons in the postnatal olfactory bulb.</a> J. Neurosci. 31, 7551-7562 (2011).</li>
<li>Gotts, J. E., Chesselet, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+subventricular+zone+expansion+after+focal+cortical+ischemic+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of subventricular zone expansion after focal cortical ischemic injury.</a> J. Comp. Neurol. 488, 201-214 (2005).</li>
<li>Goings, G. E., Sahni, V., Szele, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migration+patterns+of+subventricular+zone+cells+in+adult+mice+change+after+cerebral+cortex+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Migration patterns of subventricular zone cells in adult mice change after cerebral cortex injury.</a> Brain Res. 996, 213-226 (2004).</li>
<li>Romanko, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+the+mammalian+subventricular+zone+in+cell+replacement+after+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Roles of the mammalian subventricular zone in cell replacement after brain injury.</a> Prog. Neurobiol. 74, 77-99 (2004).</li>
<li>Saito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+electroporation+in+the+embryonic+mouse+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system.</a> Nat. Protoc. 1, 1552-1558 (2006).</li>
<li>Boutin, C., Diestel, S., Desoeuvre, A., Tiveron, M. C., Cremer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+in+vivo+electroporation+of+the+postnatal+rodent+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Efficient in vivo electroporation of the postnatal rodent forebrain.</a> PloS One. 3, e1883(2008).</li>
<li>Barnabe-Heider, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+manipulation+of+adult+mouse+neurogenic+niches+by+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Genetic manipulation of adult mouse neurogenic niches by in vivo electroporation.</a> Nat. Methods. 5, 189-196 (2008).</li>
<li>Platel, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMDA+receptors+activated+by+subventricular+zone+astrocytic+glutamate+are+critical+for+neuroblast+survival+prior+to+entering+a+synaptic+network%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">NMDA receptors activated by subventricular zone astrocytic glutamate are critical for neuroblast survival prior to entering a synaptic network.</a> Neuron. 65, 859-872 (2010).</li>
<li>Pathania, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-132+enhances+dendritic+morphogenesis%2C+spine+density%2C+synaptic+integration%2C+and+survival+of+newborn+olfactory+bulb+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">miR-132 enhances dendritic morphogenesis, spine density, synaptic integration, and survival of newborn olfactory bulb neurons.</a> PloS One. 7, e38174(2012).</li>
<li>dal Maschio, M., M,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-performance+and+site-directed+in+utero+electroporation+by+a+triple-electrode+probe%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">High-performance and site-directed in utero electroporation by a triple-electrode probe.</a> Nat. Commun. 3, 960(2012).</li>
<li>Oudin, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocannabinoids+regulate+the+migration+of+subventricular+zone-derived+neuroblasts+in+the+postnatal+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Endocannabinoids regulate the migration of subventricular zone-derived neuroblasts in the postnatal brain.</a> J. Neurosci. 31, 4000-4011 (2011).</li>
<li>Lacar, B., Young, S. Z., Platel, J. C., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+and+recording+subventricular+zone+progenitor+cells+in+live+tissue+of+postnatal+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Imaging and recording subventricular zone progenitor cells in live tissue of postnatal mice.</a> Front. Neurosci. 4, (2010).</li>
<li>Feliciano, D. M., Lafourcade, C. A., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+subventricular+zone+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Neonatal subventricular zone electroporation.</a> J. Vis. Exp. (72), e50197(2013).</li>
<li>Nam, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+features+of+postnatal+subventricular+zone+cell+motility%3A+a+two-photon+time-lapse+study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Dynamic features of postnatal subventricular zone cell motility: a two-photon time-lapse study.</a> J. Comp. Neurol. 505, 190-208 (2007).</li>
<li>James, R., Kim, Y., Hockberger, P. E., Szele, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subventricular+zone+cell+migration%3A+lessons+from+quantitative+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Subventricular zone cell migration: lessons from quantitative two-photon microscopy.</a> Front. Neurosci. 5, 30(2011).</li>
<li>Fernandez, M. E., Croce, S., Boutin, C., Cremer, H., Raineteau, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+electroporation+of+defined+lateral+ventricular+walls%3A+a+novel+and+rapid+method+to+study+fate+specification+during+postnatal+forebrain+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Dev%22%5BJournal%5D)">Targeted electroporation of defined lateral ventricular walls: a novel and rapid method to study fate specification during postnatal forebrain neurogenesis.</a> Neural Dev. 6, 13(2011).</li>
<li>Saha, B., Ypsilanti, A. R., Boutin, C., Cremer, H., Chedotal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plexin-b2+regulates+the+proliferation+and+migration+of+neuroblasts+in+the+postnatal+and+adult+subventricular+zone%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Plexin-b2 regulates the proliferation and migration of neuroblasts in the postnatal and adult subventricular zone.</a> J. Neurosci. 32, 16892-16905 (2012).</li>
<li>Sanai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corridors+of+migrating+neurons+in+the+human+brain+and+their+decline+during+infancy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Corridors of migrating neurons in the human brain and their decline during infancy.</a> Nature. 478, 382-386 (2011).</li>
<li>Tattersfield, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenesis+in+the+striatum+of+the+quinolinic+acid+lesion+model+of+Huntington%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neurogenesis in the striatum of the quinolinic acid lesion model of Huntington's disease.</a> Neuroscience. 127, 319-332 (2004).</li>
<li>Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+selection+for+high-expression+transfectants+with+a+novel+eukaryotic+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector.</a> Gene. 108, 193-199 (1991).</li>
<li>Lledo, P. M., Alonso, M., Grubb, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+neurogenesis+and+functional+plasticity+in+neuronal+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Adult neurogenesis and functional plasticity in neuronal circuits.</a> Nat. Rev. Neurosci. 7, 179-193 (2006).</li>
<li>Khlghatyan, J., Saghatelyan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-lapse+imaging+of+neuroblast+migration+in+acute+slices+of+the+adult+mouse+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Time-lapse imaging of neuroblast migration in acute slices of the adult mouse forebrain.</a> J. Vis. Exp. (67), e4061(2012).</li>
<li>Snapyan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vasculature+guides+migrating+neuronal+precursors+in+the+adult+mammalian+forebrain+via+brain-derived+neurotrophic+factor+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Vasculature guides migrating neuronal precursors in the adult mammalian forebrain via brain-derived neurotrophic factor signaling.</a> J. Neurosci. 29, 4172-4188 (2009).</li>
<li>Platel, J. C., Heintz, T., Young, S., Gordon, V., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tonic+activation+of+GLUK5+kainate+receptors+decreases+neuroblast+migration+in+whole-mounts+of+the+subventricular+zone%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Tonic activation of GLUK5 kainate receptors decreases neuroblast migration in whole-mounts of the subventricular zone.</a> J. Physiol. 586, 3783-3793 (2008).</li>
<li>Schaar, B. T., McConnell, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoskeletal+coordination+during+neuronal+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Cytoskeletal coordination during neuronal migration.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 13652-13657 (2005).</li>
<li>Valiente, M., Marin, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+migration+mechanisms+in+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.Opin.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Neuronal migration mechanisms in development and disease.</a> Curr.Opin. Neurobiol. 20, 68-78 (2010).</li>
<li>Comte, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galectin-3+maintains+cell+motility+from+the+subventricular+zone+to+the+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Galectin-3 maintains cell motility from the subventricular zone to the olfactory bulb.</a> J. Cell Sci. 124, 2438-2447 (2011).</li>
<li>Sonego, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fascin+regulates+the+migration+of+subventricular+zone-derived+neuroblasts+in+the+postnatal+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Fascin regulates the migration of subventricular zone-derived neuroblasts in the postnatal brain.</a> J. Neurosci. 33, 12171-12185 (2013).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

神经前体细胞沿吻侧迁移流的高效迁移可确保其后续成熟为功能性神经元10。在人类婴儿期，可观察到大量朝向嗅球的神经前体细胞迁移流，这些细胞可能在人类出生后的早期脑发育中发挥重要作用27。此外，这些细胞能够靶向脑内受损及发生神经退行性变的区域4,28。因此，实时监测基因操作对成神经细胞动态的影响，对于全面理解成神经细胞迁移的引导与调控机制至关重要。
本文介绍了一种通过将体内出生后电穿孔技术与急性脑切片培养的延时共聚焦转盘显微镜成像相结合，以监测SVZ来源的成神经细胞迁移的实验方案。具体而言，我们展示了如何通过在SVZ区域电穿孔导入编码GFP的质粒，对迁移中的神经前体细胞进行标记。根据研究目的的不同，可使用多种类型的质粒（例如，表达其他荧光蛋白，或与感兴趣的野生型/突变型蛋白、CRE重组酶或shRNA共同表达的质粒）。我们强烈推荐使用含有鸡β-肌动蛋白CAG启动子29的质粒用于体内表达。对电穿孔动物获取的脑切片进行成像，还可用于在电穿孔后较长时间点（...

在哺乳动物大脑中，新生神经元的产生（神经发生）主要在出生后两个区域进行，即侧脑室的室下区（SVZ）和海马齿状回的颗粒下区1。近年来积累的大量证据表明，出生后神经发生在海马和嗅球的记忆功能中具有关键作用1-3。尤为重要的是，由于出生后神经发生与退行性神经系统疾病密切相关，且神经母细胞具有向脑损伤部位迁移的能力，因此在治疗方面具有潜在应用价值4-6。
室下区（SVZ）最近被确认为一个关键的神经发生微环境。SVZ来源的成神经细胞通过吻侧迁移流（RMS）迁移到嗅球（OB），这是出生后大脑中最长的迁移过程1,7,8。哺乳动物的SVZ/RMS/OB系统已成为研究神经发生不同阶段（如增殖、迁移和分化）的有用模型1,8。许多生长因子和细胞外信号调控SVZ的神经发生及沿RMS的细胞迁移，但其细胞内分子机制仍远未完全阐明1,9。沿RMS的正常迁移对新生神经元的后续成熟至关重要10。此外，一些研究表明，SVZ来源的成神经细胞可从RMS迁出，到达脑损伤部位4-6,11-13。因此，研究调控成神经细胞迁移的信号机制，不仅对理解神经发生具有重要意义，也为潜在的治疗应用奠定了基础。
在此，我们描述了一种通过标记SVZ神经前体细胞的详细方案 体内 出生后电穿孔并利用延时旋转盘共聚焦显微镜，在急性脑切片培养中监测其沿喙侧迁移流（RMS）的迁移过程。电穿孔技术广泛应用于从胚胎期到成年阶段的发育研究14-18它是靶向和操控SVZ神经前体细胞的强大工具，相较于病毒载体的立体定位注射或转基因模型的构建，具有成本更低、耗时更短的显著优势。1,15,19,20该操作是一种相对简单的非手术方法，具有较高的存活率。在采用LoxP系统的小鼠遗传模型中，通过电穿孔技术导入表达shRNA或CRE重组酶的质粒，可用于靶向目的基因或实现对侧脑室下区（SVZ）前体细胞的永久性标记，因此是成体神经发生研究中的有力工具。21,22.
由于当前技术限制，对完整大脑中 RMS 神经母细胞迁移进行成像仍然具有挑战性。然而，可通过共聚焦旋转盘延时显微镜对急性脑切片进行观察，该系统能够高度模拟 in vivo 状态，并适用于药理学干预23,24。将 in vivo 乳后电穿孔技术与延时成像相结合，将有助于阐明调控神经母细胞运动性的分子机制，并推动促进脑修复的新策略的发展。

<table><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Millipore 细胞培养插件</td><td>Millipore</td><td>PICM0RG50</td><td></td></tr><tr><td>35 mm 玻底培养皿</td><td>MatTek</td><td>P35G-0-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Gey's 平衡培养基</td><td>Sigma</td><td>G9779-500ML</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖，45%</td><td>Sigma</td><td>G8769-100ML</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375-25G</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素溶液（Pen/Strep）</td><td>GIBCO</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FCS）</td><td>GIBCO</td><td>10109-163</td><td></td></tr><tr><td>B27 添加剂</td><td>&lt;a&gt;Invitrogen Life Technologies&lt;/a&gt;</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺（L-Glutamine）</td><td>&lt;a&gt;Invitrogen Life Technologies&lt;/a&gt;</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>DMEM（无酚红）</td><td>GIBCO</td><td>31053-028</td><td></td></tr><tr><td>快绿染料（Fast Green）</td><td>Sigma</td><td>F7252-5G</td><td></td></tr><tr><td>注射用玻璃毛细管</td><td>Harvard Apparatus</td><td>30-0057</td><td></td></tr><tr><td>吸液管</td><td>Sigma</td><td>A5177</td><td></td></tr><tr><td>Sutter P-97 毛细管拉制仪</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>ECM830 方波电穿孔仪</td><td>Harvard Apparatus</td><td>45-0052</td><td></td></tr><tr><td>7 mm 铂金镊式电极（Platinum Tweezertrodes）</td><td>Harvard Apparatus</td><td>45-0488</td><td></td></tr><tr><td>脚踏开关 Model 1250F</td><td>Harvard Apparatus</td><td>45-0211</td><td></td></tr><tr><td>电极导电凝胶</td><td>Cefar Compex</td><td>6602048</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷（Isoflurane）</td><td>Merial</td><td>AP/DRUGS/220/96</td><td></td></tr><tr><td>振动切片机（Vibratome）</td><td>Leica</td><td>VT1000S</td><td></td></tr><tr><td>胶水</td><td>Roti coll</td><td>Roti coll 1</td><td></td></tr><tr><td>UltraViEW VoX 转盘共聚焦显微系统</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td>定制系统（可使用多激光光源），配备 Hamamatsu ORCA R2 C10600-10B CCD 相机</td></tr><tr><td>Volocity 软件</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td>图像采集、定量与可视化模块</td></tr><tr><td>显微镜用环境培养室</td><td>Solent Scientific</td><td></td><td>定制</td></tr><tr><td>Ti-E 倒置显微镜</td><td>Nikon</td><td></td><td>建议使用 CFI Super Plan Fluor ELWD 20X/0.45 NA 物镜，适用于本文所述应用</td></tr></tbody></table>

体内 新生期电穿孔与小鼠急性脑切片中神经母细胞迁移的实时成像

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

脑室下区（SVZ）是出生后大脑中主要的神经发生微环境之一。在此区域，神经前体细胞增殖并产生神经母细胞，这些神经母细胞能够沿吻侧迁移流（RMS）向嗅球（OB）迁移。这种长距离迁移对于新生神经元在嗅球内的后续成熟至关重要，但调控该过程的分子机制仍不明确。研究调控神经母细胞迁移能力的信号通路，不仅有助于理解神经发生的 fundamental 步骤，还可能具有治疗性再生潜力，因为这些神经母细胞能够靶向损伤、中风或退行性病变所影响的脑区。
在本文中，我们描述了一种详细的实验方案 体内 出生后电穿孔及小鼠RMS中神经母细胞迁移的连续时间成像。出生后电穿孔可高效转染侧脑室下区（SVZ）前体细胞，这些细胞继而产生沿RMS迁移的神经母细胞。利用共聚焦转盘显微镜对急性脑片培养物进行连续时间成像，可在高度接近体内生理环境的条件下监测神经母细胞的迁移过程 体内 条件。此外，可对神经母细胞的运动性进行追踪和定量分析。例如，我们描述了如何使用 体内 通过在出生后对表达GFP的质粒进行电穿孔，以标记并可视化沿RMS迁移的成神经细胞。在利用LoxP系统的条件性基因敲除小鼠中，电穿孔导入表达shRNA或CRE重组酶的质粒也可用于靶向目的基因。此外，可通过药物学手段干预急性脑切片培养，以研究不同信号分子在成神经细胞迁移中的作用。通过结合 体内 通过延时成像结合电穿孔技术，我们希望阐明调控神经母细胞迁移的分子机制，并为促进脑修复的新方法开发提供贡献。

在成功电穿孔后通常4-8天，可沿嗅鞘通路（RMS）观察到SVZ来源的迁移性成神经细胞的标记（图1B）。也可选择更长的时间点，但由于大多数细胞已进入嗅球（OB），RMS中可观察到的细胞数量会减少。成神经细胞在电穿孔后约2-3周开始在嗅球中获得成熟颗粒细胞的典型形态和特征（未显示）。电穿孔后的小鼠幼崽脑切片在培养约1小时后，可稳定成像长达3-4小时。如先前报道23,26，成神经细胞可表现出复杂的迁移动力学行为（图3 和 视频1），可通过细胞追踪进行定量分析（图4）。
<img alt="Neural pathway diagram A, fluorescent microscope image B; brain section regions SVZ, Ctx, OB marked." fo:content-width="6in" src="/files/...

神经母细胞迁移是出生后神经发生过程中的基本事件。我们描述了一种通过高效标记神经母细胞的方案 体内 出生后电穿孔及通过急性脑切片的时间推移成像对其迁移过程进行可视化观察。我们还提供了通过视频追踪进行神经母细胞动力学定量分析的方法描述。

室下区（SVZ）是出生后大脑中的主要神经发生微环境之一。在此区域，神经前体细胞增殖并产生……

本实验的总体目标是可视化并分析新生小鼠大脑中神经母细胞沿吻侧迁移流的迁移过程。首先，将编码绿色荧光蛋白的DNA质粒通过电穿孔技术导入小鼠侧脑室。第二步，制备电穿孔后小鼠的脑切片。接下来，选择 GFP 信号最强的脑片进行培养。最后一步是使用转盘共聚焦显微镜对含有 GFP 标记的迁移性成神经细胞的脑片进行活细胞延时成像。最终，通过延时录像对成神经细胞的迁移进行细胞追踪和定量分析。该方法有助于解答神经发生领域中的关键问题，例如干细胞来源的成神经细胞在出生后大脑中的迁移是如何被引导和调控的。与现有的病毒载体递送等方法相比，该技术的主要优势在于操作更简便、成本更低且耗时更短。此外，该方法可实现对成神经细胞的稀疏标记，从而能够对其迁移动力学进行详细分析。开始此操作时，将电穿孔仪的电压设置为五个方波脉冲，每个脉冲持续50毫秒，电压为100伏，脉冲间间隔850毫秒。然后使用连接至毛细管的吸管吸取1至2微升DNA，并加载到毛细管针中。接下来，从鼠笼中取出一只出生后第2天的小鼠幼崽，并通过吸入异氟烷进行麻醉。随后，用非优势手的拇指和食指夹住幼鼠的头部。轻轻向后拉头部的皮肤，以帮助确定正确的注射位点。设想一条连接眼睛与颅骨解剖标志点人字缝（Lambda）的虚拟直线。然后从 Lambda 点开始，沿该线约三分之一处插入毛细针，深度约为两毫米，通过嘴部缓慢吹气注入质粒。在此过程中，确保手指不要对脑组织施加过大压力。当毛细管中仅剩少量 DNA 溶液时，停止注射。然后在两个电极上涂上凝胶，并将正极置于注射了DNA的大脑半球外侧。若需将DNA导入喙侧脑室下区（Rostral SVZ），则将电极置于注射点稍靠前的位置。接着，踩下脉冲脚踏开关以启动电流传递。然后用纸巾擦去幼鼠头部的凝胶，在加热垫上用氧气复苏几分钟。随后将其放回笼中，并置于远离母鼠的位置。确保母鼠将幼鼠叼回并与其他幼仔重新聚集在一起。在此步骤中，将微孔细胞培养插件放入含有1毫升成像培养基的35毫米玻璃底培养皿中。然后将培养皿置于37摄氏度、5%二氧化碳的湿化培养箱中。断头处死幼鼠后，用手术刀去除头皮。接下来，从小脑至嗅球沿正中矢状缝切开颅骨。在颅骨上再做几个横向切口，用镊子轻轻移除颅骨瓣。确保完全暴露整个脑组织，并使用刮匙小心地将其分离取出，特别注意不要损伤组织。随后，用剃刀片将半脑切开，并弃去未注射的一侧半脑。接着，在振动切片仪的持样架上贴一小片胶带，使用尽可能少的胶水将脑半球固定于其上。开始将脑半球切成300微米厚的切片。然后使用小号画笔或柔软的接种环收集切片。随后，在标准荧光显微镜下检查切片的两面，观察GFP信号，并挑选出沿大部分吻侧迁移流显示出明亮荧光的切片。在自培养罩内，切除脑片最中央的三分之一部分，并去除任何胶水残留。接着，使用塑料移液管吸取脑片，将其放置于预热的MilliCell插入式培养小室中心。用Gilson移

in-vivo-postnatal-electroporation-time-lapse-imaging-neuroblast

Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

成神经细胞迁移的小鼠急性脑片在体内电穿孔产后和时间推移成像

我们描述了一种在小鼠前脑中进行神经元迁移实时视频成像的实验方案。通过在急性活体脑片中利用宽场荧光成像技术，并以相对较短的时间间隔快速采集图像，记录经病毒标记或移植的神经前体细胞的迁移过程，以研究细胞迁移的不同阶段，包括静止期和迁移期的持续时间以及迁移速度。...

成年小鼠前脑急性脑片中神经母细胞迁移的延时成像

来源： Wiegreffe, C., 等  利用胚胎小鼠脑组织切片培养进行迁移神经元的延时共聚焦成像 子宫内 电穿孔 J. Vis. Exp. (2017)...

转导小鼠胚胎脑切片中皮层神经元径向迁移的延时成像

神经母细胞迁移是出生后神经发生过程中的关键步骤。本方案可用于研究候选调控因子在神经母细胞迁移中的作用，方法是利用DNA/短发夹RNA（shRNA）核转染技术，结合从啮齿类动物出生后前脑迁移流中分离的神经母细胞进行三维迁移实验。...

啮齿类动物成神经细胞的核转染以研究成神经细胞迁移 体外

本方案提供了直接观察径向迁移皮层神经元的操作指南。In utero...

In Utero 电穿孔法结合脑片培养对小鼠胚胎脑中迁移神经元进行延时共聚焦成像

本文提供了一种低成本且可靠的方法，可从小鼠胚胎制备适用于共聚焦显微镜和活体成像技术的电穿孔脑组织切片培养物。...

Ex Utero 电穿孔及胚胎小鼠脑组织切片培养用于迁移性GABA能中间神经元的活体成像

本方案展示了一种简单且可靠的用于研究的方法 原位 轴突生长与生长锥动态。该方法描述了如何制备 离体...

在体 可视化急性离体胚胎脑切片培养中轴突生长与生长锥动态

在大脑皮层发育过程中，神经元和胶质细胞起源于衬于脑室壁的室管膜区，并向脑表面迁移。许多基因参与了这一过程。本方案介绍了对迁移中的神经元和胶质前体细胞进行活细胞延时成像的技术。...

胚胎小鼠脑切片中迁移神经元和胶质前体细胞的延时成像

本方案描述了一种针对出生后大脑优化的器官型脑片实验方法，可用于对嗅束迁移流中神经母细胞迁移进行高分辨率的时间推移成像。...

一种用于出生后大脑神经元迁移高分辨率延时成像的器官型脑片实验方法

本视频展示了一种方法，该方法结合了电穿孔技术和共聚焦显微镜技术，用于对发育中的斑马鱼前脑中的单个神经前体细胞进行活体成像。体内水平上对前脑神经前体细胞在克隆水平的发育过程分析可通过此方法实现。...

延时活体成像观察发育中斑马鱼前脑内克隆相关神经前体细胞

我们展示了一种 体内 电穿孔转染方案，用于在多种出生后年龄段的小鼠中转染单个或少量成簇的视网膜神经节细胞（RGCs）及其他视网膜细胞类型。该方法实现了对出生后RGCs的标记与遗传操作 体内...

小鼠视网膜神经节细胞的转染 体内 电穿孔

了解成神经细胞迁移的研究方法，通过体内电穿孔技术在小鼠侧脑室导入GFP质粒，制备急性脑切片并进行延时成像，实现神经发生过程中细胞动态追踪与定量分析。

体内新生期电穿孔与小鼠急性脑切片中神经母细胞迁移的实时成像

探索更多视频

体内 新生期电穿孔与小鼠急性脑切片中神经母细胞迁移的实时成像

探索更多视频

体内新生期电穿孔与小鼠急性脑切片中神经母细胞迁移的实时成像