Name: 可重放截瘫胸主动脉阻断脊髓缺血再灌注的小鼠模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-03T21:55:00.000+00:00
Duration: 5 min 59 s
Description: 学习使用小鼠模型研究脊髓缺血再灌注损伤的方法，通过胸主动脉阻断诱导截瘫。该技术采用激光多普勒探针监测血流，结合胸骨切开术和血管夹闭，为开发神经保护策略提供可重复的实验平台。

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我们感谢胸外科研究与教育基金会对本项目提供的财务支持。

1. 术前准备与麻醉
<ol>
	<li>整个操作过程中务必遵守无菌技术。&#160;将所有器械摆放就位。</li>
	<li>在麻醉诱导前打开温控板，使其预热至适当温度（36.5 °C）。&#160;启动激光多普勒血流监测仪，使其在麻醉诱导期间完成启动。</li>
	<li>将小鼠放入诱导室。
	<ol>
		<li>在诱导过程中密切观察小鼠的呼吸频率。</li>
		<li>一旦观察到呼吸频率明显减慢，立即将小鼠从诱导室中取出。</li>
		<li>进行足趾夹捏测试，以评估麻醉深度是否充分。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>当小鼠达到适当麻醉状态后，将其置于仰卧位。</li>
	<li>将小鼠面部插入鼻罩，并将其所有四肢固定在加热台上。
	<ol>
		<li>需特别注意确保四肢处于解剖学位置固定，避免偏向一侧。&#160;若小鼠体位不当，在胸骨切开过程中将难以避免损伤胸廓内动脉。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用剪毛器或市售脱毛膏，去除胸骨中线区域及左下肢腹侧的毛发。
	<ol>
		<li>若使用脱毛膏，应避免停留超过30秒，以防发生碱性灼伤。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>滴定挥发性麻醉剂蒸发器浓度，以维持适当的麻醉深度。
	<ol>
		<li>使用高流量O2时，预期的异氟烷蒸发器浓度范围为1-5%。</li>
		<li>应调节挥发性麻醉剂浓度，在手术刺激期间维持麻醉深度，同时保留自主呼吸。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 直肠探针激光多普勒放置
<ol>
	<li>将润滑的直肠探头插入小鼠直肠内。&#160;固定于手术台。</li>
	<li>调节加热台，使直肠温度维持在 36.5 °C。</li>
	<li>在小鼠股动脉处做一小切口，并将皮肤从皮下组织分离。</li>
	<li>将激光多普勒探头置于股动脉上方。</li>
	<li>调整探头位置，直至灌注监测仪显示的灌注单位大于 800。
	<ol>
		<li>牢固固定探头。&#160;探头固定不当可能导致灌注测量值偏低。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 主动脉弓/锁骨下动脉的解剖
<ol>
	<li>在胸骨切迹上方做一条2 cm的皮肤切口，并轻轻将皮肤与皮下组织分离。</li>
	<li>游离下颌下腺。
	<ol>
		<li>若发生出血，可用棉签轻轻按压止血。</li>
		<li>在无血管平面沿中线将下颌下腺切开。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用镊子轻轻抬起胸骨，使用剪刀沿胸骨中线做1 cm的正中胸骨切开术。任何偏离中线的操作都可能导致难以控制的胸廓内动脉出血。</li>
	<li>在胸骨两侧边缘各放置5-0牵引缝线，并将胸骨向两侧牵开，将缝线固定于手术床上。避免将牵引缝线放置过偏外侧，以防发生气胸。</li>
	<li>沿气管钝性分离带状肌。可用剪刀切断左侧带状肌以改善术野暴露。</li>
	<li>从周围组织中游离胸腺。继续钝性分离直至显露大血管。操作需格外谨慎，防止进入胸膜腔。</li>
	<li>在主动脉弓和左锁骨下动脉上放置血管夹。</li>
	<li>确认远端血流已适当阻断。此时可见灌注单位减少&#62;90%。
	<ol>
		<li>持续阻断4–8分钟，根据需要调整时间。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>移除血管夹，并在关闭胸腔前确认止血完全。</li>
</ol>
4. 胸骨切开术的关闭与皮肤处理
<ol>
	<li>移除小鼠左侧的牵引缝线。</li>
	<li>使用右侧牵引缝线关闭胸骨切口。
	<ol>
		<li>单根胸骨缝线（使用先前放置的牵引缝线）足以完成胸骨闭合。&#160;额外添加缝线是不必要的，且会增加气胸和出血的风险。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用连续的5-0缝线缝合皮肤。</li>
</ol>
5. 恢复与术后评估
<ol>
	<li>将小鼠转移至恢复笼中。笼子应放置在加热垫上，以提高恢复环境的周围温度，减少热量散失。</li>
	<li>密切观察小鼠是否出现呼吸困难或癫痫发作的迹象。根据机构指南给予镇痛处理。&#160;若观察到小鼠出现癫痫或呼吸困难，应立即实施安乐死。
	<ol>
		<li>CO2 安乐死舱是我们首选的方法。&#160;颈椎脱位是另一种可选方案，如果 CO2 不可用。</li>
		<li>完全恢复通常需要1-2小时，具体时间取决于所用挥发性麻醉剂的种类及其浓度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将小鼠放回正常笼具中。将食物和水放置在笼底。</li>
	<li>在12小时评估神经功能状态&#160;使用Basso小鼠运动量表进行间隔评估8.</li>
</ol>

<ol><li>Conrad, M. F., Ye, J. Y., Chung, T. K., Davison, J. K., Cambria, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+cord+complications+after+thoracic+aortic+surgery%3A+long-term+survival+and+functional+status+varies+with+deficit+severity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vasc.+Surg%22%5BJournal%5D)">Spinal cord complications after thoracic aortic surgery: long-term survival and functional status varies with deficit severity.</a> J. Vasc. Surg. 48, 47-53 (2008).</li>
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<li>Kwon, B. K., Tetzlaff, W., Grauer, J. N., Beiner, J., Vaccaro, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiology+and+pharmacologic+treatment+of+acute+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Spine.+J%22%5BJournal%5D)">Pathophysiology and pharmacologic treatment of acute spinal cord injury.</a> Spine. J. 4, 451-464 (2004).</li>
<li>Cheshire, W. P., Santos, C. C., Massey, E. W., Howard, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+cord+infarction%3A+etiology+and+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Spinal cord infarction: etiology and outcome.</a> Neurology. 47, 321-330 (1996).</li>
<li>Kakinohana, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+paraplegia+after+spinal+cord+ischemic+injury+requires+caspase-3+activation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Delayed paraplegia after spinal cord ischemic injury requires caspase-3 activation in mice.</a> Stroke. 42 (8), 2302-2307 (2011).</li>
<li>Wang, Z., Yang, W., Britz, G. W., Lombard, F. W., Warner, D. S., Sheng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+simplified+spinal+cord+ischemia+model+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Development of a simplified spinal cord ischemia model in mice.</a> J. Neurosci. Methods. 189, 246-251 (2010).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((model+of+ischemic+spinal+cord+injury+with+delayed+paralysis+caused+by+aortic+cross-clamping%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">model of ischemic spinal cord injury with delayed paralysis caused by aortic cross-clamping.</a> Anesthesiology. 113, 880-891 (2010).</li>
<li>Kang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+systemic+hypothermia+on+a+murine+model+of+thoracic+aortic+ischemia+reperfusion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vasc.+Surg%22%5BJournal%5D)">The effects of systemic hypothermia on a murine model of thoracic aortic ischemia reperfusion.</a> J. Vasc. Surg. 52, 435-443 (2010).</li>
<li>Li, J., Benashski, S., McCullough, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-stroke+hypothermia+provides+neuroprotection+through+inhibition+of+AMP-activated+protein+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Post-stroke hypothermia provides neuroprotection through inhibition of AMP-activated protein kinase.</a> J. Neurotrauma. 28 (7), 1281-1288 (2011).</li>
</ol>

作者声明&#160;无竞争性财务利益。

继发于脊髓缺血&#160;再灌注的截瘫是由一系列病理机制复杂且尚未完全阐明的疾病所致9。尽管此类情况最常发生于胸腹主动脉手术后，但其他多种损伤因素，如&#160;主动脉夹层、创伤、栓塞现象、血管炎以及全身性低血压10，也可导致截瘫。&#160;为了进一步理解此类损伤机制并为未来防治提供潜在靶点，动物模型已成为不可或缺的研究工具。
出现此并发症的患者表现为即时性或延迟性瘫痪。该模型及其他模型能够充分模拟临床上观察到的瘫痪双相分布特征11。中度缺血（4 min）导致延迟性瘫痪，而长时间缺血（8 min）则引起即时且永久性瘫痪。
与需要进行侧开胸术的模型相比，本模型具有优势12,13。胸骨正中切开术的暴露方式可保持胸膜腔的完整性，避免了气管插管或重建胸膜腔负压的需要。&#160;在临床上，胸骨切开术相比侧开胸术术后疼痛显著减轻，可能减少术后镇痛药物的使用需求。
该模型并非没有局限性。与其他模...

下肢瘫痪仍是胸腹腔手术后常见的并发症。这种损伤被称为脊髓缺血-再灌注损伤（SCIR），在高达20%的高危患者中可导致瘫痪1。左心转流、腰椎脑脊液引流、&#160;低温循环阻断以及肋间动脉再植等手术辅助措施已降低了该并发症的发生率2；然而，仍有大量患者受到影响。
临床上，脊髓缺血再灌注损伤表现为干预后即刻或延迟出现的瘫痪3。&#160;然而，由于缺乏对损伤机制的深入认识，对该损伤的理解受到限制。&#160;因此，一旦损伤发生，可用于减轻损伤的治疗手段十分有限。
因此，我们采用了一种小型动物——小鼠的脊髓缺血与再灌注损伤模型，以更深入地表征其发病机制。&#160;迄今为止的大多数研究均使用较大的动物模型来表征此类损伤，主要包括大鼠4、兔5和猪6模型。&#160;然而，这些模型受限于高昂的成本、操作复杂性、可重复性差异较大，以及最重要的一点——缺乏可用于基因操作的技术手段。&#160;在已发表的动物模型中，最可靠的是在兔身上进行腹主动脉肾下段阻断。&#160;然而，人类前角脊髓神经元的血液供应通常来自更近端的血管分支7。&#160;这些模型中脊髓血管解剖结构的变异性，增加了将其研究结果转化为临床应用的难度。
本文介绍了一种与临床相关且易于实施的胸主动脉阻断后即刻或延迟性截瘫的动物模型。通过小切口暴露主动脉弓&#160;胸骨切开术创伤较小，且能以极低的发病率和死亡率获得高度可重复的结果。尽管该模型存在一定的挑战和技术细节，但通过仔细的解剖和组织处理，可成功建立后肢的模型&#160;肢体瘫痪，可轻松实施。

<table><tbody><tr><td>VMS 麻醉机</td><td>MDS基质</td><td></td><td></td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Vet One</td><td>13985-528-60</td><td>通过鼻罩 2.0%&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>诱导室</td><td>兽医设备</td><td>941444</td><td></td></tr><tr><td>加热板</td><td>Vestavia Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>激光多普勒监测仪</td><td>Moor Instruments</td><td>VMS-LDF1</td><td></td></tr><tr><td>5-0 缝合线，聚酯</td><td>Surgidac</td><td>VD-551</td><td>锥形针</td></tr><tr><td>显微解剖夹</td><td>生物医学研究仪器</td><td>14-1030, 14-1060</td><td></td></tr><tr><td>手术器械</td><td>精细外科手术器械</td><td></td><td>镊子，持针器</td></tr></tbody></table>

通过胸主动脉阻断在脊髓缺血-再灌注小鼠模型中可重复地诱导截瘫

Reproducable Paraplegia by Thoracic Aortic Occlusion in a Murine Model of Spinal Cord Ischemia-reperfusion

背景 
下肢瘫痪仍是主动脉介入手术后常见的并发症。由于对潜在病理机制的理解不足，导致减少此类损伤发生率的技术进步受到阻碍。&#160;当前模型可稳定地在胸主动脉阻断后诱导出可重复的下肢瘫痪&#160;现象。
方法 
成年雄性 C57BL6 小鼠使用异氟烷进行麻醉。通过颈胸切口暴露主动脉，在不进入胸膜腔的情况下辨认降胸主动脉和左锁骨下动脉。对这些动脉进行游离后，立即关闭切口（假手术组）或分别阻断 4 分钟（中度缺血）或 8 分钟（长时间缺血）。随后关闭胸骨切口和皮肤，将小鼠转移至保温床进行恢复。&#160; 恢复后，在 48 小时内每 12 小时进行一次功能分析。
结果 
假手术组小鼠未表现出明显的后肢异常&#160;肢体功能缺损。经4分钟中度缺血处理的小鼠在术后12小时仅表现出轻微功能缺损，随后在48小时进展为完全性瘫痪。经历长时间缺血的小鼠则立即出现瘫痪，在术后任何时间点均未观察到后肢运动。术中及术后未观察到&#160;手术死亡率
结论 
在小鼠模型中，可实现可重复的下肢瘫痪，无论其为即时性或延迟性。此外，通过采用胸骨正中切开术并进行精细解剖，可获得较高的存活率和良好的可重复性。

小鼠接受假手术（n=3）或主动脉阻断4分钟（n=3）至8分钟（n=3）。术后小鼠通过Basso小鼠评分进行评估（图1）。接受假手术的小鼠在术后任何时间点均未出现可观察到的功能缺损。经历中度缺血（4分钟）的小鼠在术后12小时后肢功能接近正常，但在48小时内逐渐出现功能下降，最终完全瘫痪。经历长时间缺血（8分钟）的小鼠在术后立即出现完全瘫痪，且无任何功能恢复（图2）。
<img alt="静态平衡评分表；踝关节运动的操作定义；评估指南。" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50910/50910fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50910/50910fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
图1. 后肢运动功能Basso评分<...

对脊髓缺血-再灌注损伤缺乏机制性理解，阻碍了在高风险主动脉手术后预防截瘫的辅助措施的进一步发展。因此，建立动物模型势在必行。本论文展示了在小鼠模型中通过胸主动脉阻断后可重复地诱导出下肢瘫痪。

背景  
下肢瘫痪仍是主动脉介入手术后常见的并发症。由于对潜在病理机制的认识不足，阻碍了……

以下实验的总体目标是研究脊髓缺血在murn模型中的影响。首先，在股动脉上方放置激光多普勒探头，随后进行胸骨切开术以暴露主动脉弓和左锁骨下动脉。然后仔细解剖主动脉和锁骨下动脉，以充分减少脊髓的动脉血流。获得结果。cho 是一种基于 Baso 小鼠评分的术后神经功能缺损。与现有的其他方法（如侧胸切开术）相比，该技术的主要优势在于不侵犯胸膜腔。该方法有助于探讨脊髓病理生理学、脊髓缺血再灌注损伤等相关问题，并为药物干预提供潜在可能。该技术的应用前景涵盖预防脊髓缺血后截瘫的治疗策略。尽管该方法可为胸外科手术中常见的截瘫问题提供研究思路，也可应用于其他导致急性脊髓缺血的疾病过程，例如低血压或血管病变。通常，初次接触该技术的研究人员在分离主动脉弓时会遇到困难，因为操作需极为谨慎，以避免动物死亡、出血或气胸。我们最初是在采用侧开胸入路时遇到若干困难后开始思考该技术的改进方案；尽管该方法在文献中已有广泛报道，但在我们的动物实验中却伴随较高的死亡率。该方法的可视化演示至关重要，因为在纵隔解剖过程中需格外谨慎，以防止术中死亡。根据文本方案麻醉小鼠后，确认其已充分镇静，并去除胸部中线及左下肢腹侧表面的毛发，将润滑过的直肠探头插入小鼠直肠，并固定于手术台。调节加热垫，使目标直肠温度维持在36.5摄氏度。接下来，在股动脉上方做一个小切口，并将皮肤从皮下组织分离。然后将激光多普勒探头置于股动脉上方。调整探头位置，直至灌注监测仪显示灌注单位超过800，以进行主动脉弓和锁骨下动脉的解剖分离。在胸骨切迹上方做一长约2厘米的皮肤切口，并轻轻将皮肤与皮下组织分离。若发生出血，需游离下颌下腺。使用棉签在无血管区域轻轻施加压力。使用镊子沿中线切开下颌下腺。轻轻抬起胸骨，用剪刀沿胸骨中线小心地进行长约1厘米的胸骨正中切开术。在胸骨边缘每侧各放置5-0牵引缝线一根，将胸骨向两侧牵拉，并将缝线固定于手术床上。接下来，使用钝性分离沿气管游离带状肌。然后用剪刀切开左侧带状肌以改善暴露。将胸腺从周围组织中解剖分离。继续钝性分离，直至观察到大血管。操作时需格外小心，避免进入胸膜腔，随后在主动脉弓和左锁骨下动脉上放置血管夹。确认远端血流已适当阻断，表现为灌注单位减少超过90%。继续阻断四到八分钟。时间结束后，移除血管夹，确认止血后关闭胸骨切口和皮肤。首先移除小鼠左侧的牵开缝线。使用合适的牵引缝线关闭胸骨切口，并用连续的5-0缝线缝合皮肤。将小鼠置于带有加热垫的笼子中恢复，之后再放回正常笼子，确保其可以正常获取食物和水。密切观察小鼠是否出现呼吸困难的迹象，如有需要，应根据实验方案实施安乐死。最后，使用Baso小鼠评分量表评估动物的运动功能。每隔12小时，小鼠接受假手术或主动脉阻断术，阻断时间为4至8分钟。术后，根据此处所示的Baso小鼠评分系统对动物进行评分。该图显示，接受假手术的小鼠在术后任何时间点均未出现可观察到的功能缺陷。接受中度缺血处理的小鼠在术后12小时后肢功能接近正常，但随后功能进行性下降，至48小时时完全瘫痪。而接受长时间缺血处理的小鼠在术后立即出现完全瘫痪，且无任何功能恢复。观看本视频后，您应能够充分了解如何安全地解剖主动脉弓，并有效减少脊髓的动脉血流。

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