Name: 微流控的Picoinjection滴无金属电极 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-18T18:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: 学习微流控芯片的无金属电极皮升级液滴注射技术，通过高压电场精确控制试剂注入体积。该方法简化了器件制备流程，提高了生化应用的精确性和可靠性。

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本工作由加州大学旧金山分校（UCSF）生物工程与治疗科学系、加州定量生物科学研究所（QB3）以及罗杰斯家族基金会的“弥合差距奖”资助。

1. 使用计算机辅助设计（CAD）软件根据实验需求设计装置的尺寸和拓扑结构
注意：选择乳液通道的直径应小于球形液滴的直径。这会迫使液滴变为圆柱形或 &#34;香肠&#34; 形状，并实现更有效的皮升注射。根据我们的需求，针对直径为50 μm的液滴，设计了30 × 30 μm的通道。
<ol>
	<li>参照 Abate 描述的方法建立皮升注射位点模型 等.3 例外的是，金属电极的通道被移除，因为它们是不必要的。</li>
	<li>添加通道以作为法拉第护城河（图1)&#160;位于皮升注射位点与上游乳液之间，用于屏蔽液滴免受电场影响的结构。 
	注意：这可以防止意外合并。</li>
</ol>
2. 使用软光刻技术制备器件
<ol>
	<li>根据 CAD 文件，利用现有的商业服务制作透明光刻掩模。</li>
	<li>使用该光掩模，在硅晶圆上固化光刻胶以制备器件母模，具体方法如前所述4。</li>
	<li>将按 11:1 比例混合固化剂的 PDMS 倒入盛有器件母模的 5 cm 聚苯乙烯培养皿中。</li>
	<li>将带有 PDMS 的母模置于真空干燥器中约 15 分钟&#160;，以去除所有气泡。</li>
	<li>将 PDMS 器件置于 95 °C 烤箱中加热 1 小时以完成固化。或者，PDMS 也可在室温下静置 24 小时后固化。</li>
	<li>用手术刀沿边缘切割，并小心地从母模上剥离，从而取出器件。</li>
	<li>使用 0.5 mm 活检打孔器在 PDMS 上打出进样口和出样口孔洞。</li>
	<li>使用等离子体键合仪将器件键合到玻璃显微镜载玻片上4。</li>
</ol>
3. 准备一个气压控制泵以对含有液体的储液器加压
<ol>
	<li>调节泵的输出，使加压空气通过一段内径为2.7 mm的聚乙烯管排出。</li>
	<li>将管子末端套在鲁尔锁接头后部的凸嘴上，使其与鲁尔锁注射器接头相连。</li>
	<li>用环氧树脂填充鲁尔锁螺纹与管子之间的空隙以实现密封。</li>
	<li>安装一根27.5 G的针头。</li>
</ol>
4. 在含有2%（质量/质量）溶解的生物相容性表面活性剂的惰性氟化载油中，制备单分散的水包油型水相液滴乳液7
这些液滴中所含的特定试剂取决于具体应用
<ol>
	<li>准备重新注入时，将乳液吸入带有27.5 G针头的1 ml注射器中。</li>
	<li>将注射器固定在注射泵上，并将泵垂直放置（针头朝上）。 
	注意：此方向会使液滴在载油上方形成一层聚集。当启动泵时，下方的油层会推动液滴以高体积分数从注射器中排出。</li>
</ol>
5. 准备用于微流控芯片引入的试剂
<ol>
	<li>使用皮肤活检打孔器、针头或钻头，在15 ml离心管的管盖上打三个直径为0.5 mm的孔（任何带螺口盖的容器均可使用）。</li>
	<li>将一根直径为0.5 mm的金属丝电极和一段长约20 cm的PE-2导管分别插入其中两个孔中，使其延伸至管底。</li>
	<li>在剩余的一个孔中穿入一段长约2.5&#160;cm的PE导管（总长约20 cm），使其末端位于液面以上。</li>
	<li>用紫外光固化环氧树脂密封管盖顶部的所有缝隙。</li>
	<li>将皮下注射液体注入管中，并拧紧管盖。</li>
	<li>将气压控制泵的输出端通过针头插入较短导管的内腔进行连接，针头应紧密贴合。</li>
	<li>用1 ml注射器吸取1 M NaCl溶液，作为法拉第护城河使用。</li>
	<li>安装27.5 G针头，并将该注射器固定在注射泵上。</li>
	<li>另取一支1 ml注射器，吸入载液/隔离油，连接27.5 G针头后固定于另一注射泵中。</li>
</ol>
6. 准备用于皮升注射的微流控装置
<ol>
	<li>将来自注射流体容器的输出管路（较长的一段）连接到微流控芯片上的皮升注射流体入口端口。</li>
	<li>将装有1 M NaCl的注射器通过一段PE管路连接到微流控芯片上法拉第护城河的入口端口。</li>
	<li>将装有载油的注射器通过一段PE管路连接到微流控芯片的入口端口。</li>
	<li>将PE管路插入微流控芯片的乳液出口端口。管路末端应通入乳液收集容器，通常为1.5 ml离心管。</li>
	<li>将PE管路插入微流控芯片上法拉第护城河的出口端口。管路末端应通入一个非导电且电学隔离的容器，以防止短路。</li>
	<li>通过鳄鱼夹将高压（HV）放大器的输出端连接至浸没在皮升注射流体中的金属电极。</li>
	<li>通过鳄鱼夹将高压放大器的接地电极连接至装有1 M NaCl的注射器针头的金属部分。</li>
</ol>
7. 将试剂注入微流控芯片
<ol>
	<li>以 100 μl/hr 的流速向装置中引入 1 M NaCl（法拉第护城河）。</li>
	<li>根据装置尺寸，以适当的流速引入液滴乳液和载油。对于我们的演示装置，液滴和载油的流速分别为 200 和 400 μl/hr。流速应确保液滴以载油间隙分隔的规律间隔通过皮升注射器。</li>
	<li>调节施加于皮升注射流体的压力，使皮升注射孔处的流体压力与液滴通道达到力学平衡。 
	注意：在此压力（拉普拉斯压力）下，注射流体应凸入液滴通道，但不发生出芽或形成独立液滴（图 2）。在上述流速条件下，我们向注射流体施加约 13 psi 的压力，以在注射位点实现平衡。</li>
</ol>
8. 开始皮升注射
<ol>
	<li>当液滴通过注射孔口时，施加一个 0–10 V、10 kHz 的交流信号，并通过高压放大器将信号放大 1,000 倍（图 3）。</li>
	<li>通过改变施加电压的幅值来调节注射体积。 
	注意：较高的电压应能使更多液体注入液滴中。在我们的测试中，使用浓度为 10–500 mM 的 NaCl 注射溶液，在 100 至 3,000 V 的电压范围内可实现稳定且一致的注射（图 4）。</li>
</ol>

<ol><li>Kritikou, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((It%27s+cheaper+in+the+Picolab%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">It's cheaper in the Picolab.</a> Nat. Rev. Genet. 6 (9), (2005).</li>
<li>Ahn, K., Agresti, J., Chong, H., Marquez, M., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrocoalescence+of+drops+synchronized+by+size-dependent+flow+in+microfluidic+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Phys.+Lett%22%5BJournal%5D)">Electrocoalescence of drops synchronized by size-dependent flow in microfluidic channels.</a> Appl. Phys. Lett. 88 (26), (2006).</li>
<li>Abate, A. R., Hung, T., Mary, P., Agresti, J. J., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+injection+with+microfluidics+using+picoinjectors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U+S+A%22%5BJournal%5D)">High-throughput injection with microfluidics using picoinjectors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 107, 19163-19166 (2010).</li>
<li>Harris, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+a+microfluidic+device+for+the+compartmentalization+of+neuron+soma+and+axons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Fabrication of a microfluidic device for the compartmentalization of neuron soma and axons.</a> J. Vis. Exp. (7), (2007).</li>
<li>Duffy, D. C., McDonald, J. C., Schueller, O. J., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+prototyping+of+microfluidic+systems+in+poly%28dimethylsiloxane%29%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Rapid prototyping of microfluidic systems in poly(dimethylsiloxane).</a> Anal. Chem. 70 (23), 4974-4984 (1998).</li>
<li>O'Donovan, B., Eastburn, D. J., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrode-free+picoinjection+of+microfluidic+drops%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Electrode-free picoinjection of microfluidic drops.</a> Lab on a Chip. 12 (20), 4029-4032 (2012).</li>
<li>Holtze, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biocompatible+surfactants+for+water-in-fluorocarbon+emulsions%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Biocompatible surfactants for water-in-fluorocarbon emulsions.</a> Lab on a Chip. 8 (10), 1632-1639 (2008).</li>
<li>Chung, C., Lee, M., Char, K., Ahn, K., Lee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+dynamics+passing+through+obstructions+in+confined+microchannel+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Microfluid.+Nanofluid%22%5BJournal%5D)">Droplet dynamics passing through obstructions in confined microchannel flow.</a> Microfluid. Nanofluid. 9, 1151-1163 (2010).</li>
<li>Herminghaus, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamical+instability+of+thin+liquid+films+between+conducting+media%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Lett%22%5BJournal%5D)">Dynamical instability of thin liquid films between conducting media.</a> Phys. Rev. Lett. 83 (12), 2359-2361 (1999).</li>
<li>Priest, C., Herminghaus, S., Seemann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+electrocoalescence+in+microfluidics%3A+Targeting+a+single+lamella%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Phys.+Lett%22%5BJournal%5D)">Controlled electrocoalescence in microfluidics: Targeting a single lamella.</a> Appl. Phys. Lett. 89 (13), 134101-134103 (2006).</li>
<li>Florent, M., Siva, A. V., Hao, G., Dirk, E., Frieder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrowetting-controlled+droplet+generation+in+a+microfluidic+flow-focusing+device%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys%3A+Condens.+Matter%22%5BJournal%5D)">Electrowetting-controlled droplet generation in a microfluidic flow-focusing device.</a> J. Phys: Condens. Matter. 19 (46), (2007).</li>
<li>Eastburn, D. J., Sciambi, A., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Picoinjection+enables+digital+detection+of+RNA+with+droplet+rt-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Picoinjection enables digital detection of RNA with droplet rt-PCR.</a> PLoS ONE. 8 (4), (2013).</li>
</ol>

我们尚未完全理解实验中观察到的施加电压与注入体积之间关系的精确物理机制。本实验室的研究兴趣和专长领域并不适合深入探究这一悬而未决的问题。我们鼓励具备更多物理学和工程学专长的研究人员进一步探索这一现象。

注射体积与施加电压之间的关系受多种因素影响，包括装置尺寸、将皮升注射液输送至装置的管路长度、皮升注射液的摩尔浓度，以及液滴通过注射口时的速度。因此，我们建议在每次皮升注射运行前，通过在电压和摩尔浓度工作范围的边界测量注射体积，来表征体积与电压之间的关系。此外，在较高电压和较高注射液摩尔浓度条件下，我们观察到一种现象：皮升注射液不再在注射孔口处保持平衡状态，而是从孔口脱离并在流动通道中形成微小液滴。我们认为这种行为源于电湿润效应，即水相部分润湿疏水性通道，导致液体从孔口向外爬行并进入流动通道11。&#160;如果在达到目标注射体积之前即发生此类不稳定性，可考虑降低液滴通过注射口时的流速，并缩小液滴通道以延长注射持续时间。
除了显著简化器件的制备过程外，该技术还应有助于更复杂和组合式反应体系的实施。例如，使用我们的技术进行多次皮升级注射仅需在期望的注射位点增加皮升级注射通道即可。相比之下，以往的方法则需要在所有位点同时引入皮升级注射通道及配套的金属电极。此外，先前的方法通过调节注射压力或液滴速度来相对缓慢地控制注射体积。而采用我们的方法，注射体积可通过电子方式调节...

在基于液滴的微流控技术中，微米尺度的水相液滴被用作 &#34;试管&#34; 用于生物反应。在微小液滴中进行反应的优势在于每个液滴仅消耗几皮升试剂，并且借助微流控技术，液滴可在千赫兹速率下生成和处理1.&#160;综合这些特性，可在数分钟内对数百万个反应中的单个细胞、核酸分子或化合物进行操作。&#160;μl&#160;总材料量。
对于此类应用，使用液滴时需要能够向液滴中添加受控体积试剂的技术，这类操作类似于将液体用移液器加入试管中。实现这一目标的一种方法是电聚并，即通过施加电场使试剂液滴与目标液滴融合。电场会破坏液滴界面上表面活性剂分子的排列，引发薄膜不稳定性，从而触发原本稳定的乳液发生聚并2。电场诱导的融合也被应用于皮升注射器（picoinjector）的设计中，该装置可在液滴流经加压通道时向其中注入试剂3。为了施加电场，皮升注射器设备采用金属电极，但将金属电极集成到微流控芯片中通常是一个复杂且容易出错的过程，因为液态焊料导线极易受到通道中气泡、灰尘及其他碎屑的影响，同时在设备组装过程中因应力或弯曲而产生裂纹也会导致失效。
本文介绍一种无需使用金属电极的皮升注射（picoinjection）方法，使器件制备更简单且更稳定。为触发皮升注射，我们利用注射液本身作为电极，因为大多数生物试剂含有溶解的电解质，具有导电性。我们还添加了一个&#34;法拉第护城河（Faraday Moat）&#34;，用于屏蔽器件的敏感区域并作为通用接地（图1）。该护城河通过提供接地，实现皮升注射位点上游液滴的电气隔离，防止意外的液滴融合。本技术的另一优势在于，注入液滴的体积取决于所施加电压的大小，因此可通过调节施加的信号来精确控制注射体积。
我们采用软光刻技术在聚二甲基硅氧烷（PDMS）中制备器件4,5。该方法同样适用于其他材料（如树脂、塑料和环氧树脂）制备的器件。通道的高度和宽度均为 30 μm，适合处理直径为 50 μm（65 pl）的液滴。通过聚乙烯管（内径/外径 0.3/1.09 mm）将试剂引入器件，该管插入由 0.50 mm 活检打孔器在器件制备过程中形成的端口，方法类似于先前报道的方案5。注射液的具体组成取决于具体应用。液体只需含有足够浓度的溶解电解质，以提供足够的导电性，使电信号能够传递至皮升注射器。在台式测试中，我们发现离子浓度高于 10 mM 即可满足要求6，但该数值以及液体电导率取决于具体器件的尺寸和所施加电压的大小。

<table><tbody><tr><td>1 ml 鲁尔锁&amp;trade; 注射器</td><td>BD Medical</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>Loctite 紫外固化胶粘剂</td><td>Henkel</td><td>35241</td><td></td></tr><tr><td>PE-2 管</td><td>Scientific Commodities</td><td>BB31695-PE/2</td><td></td></tr><tr><td>Novec HFE-7500</td><td>3M</td><td>98-0212-2928-5</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml 离心管</td><td>Eppendorf</td><td>22363531</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon 15 ml 管</td><td>BD Biosciences</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>气压控制泵</td><td>Control Air Inc.</td><td></td><td>建议使用由数据采集系统和控制软件调控的气压泵</td></tr><tr><td>注射泵</td><td>New Era</td><td></td><td>必须能够容纳 1 ml 注射器，并以低至 100 &amp;#956;l/hr 的流速运行</td></tr><tr><td>高压放大器</td><td></td><td></td><td>必须能够将 0.01 至 10 V 之间的信号放大 1,000 倍</td></tr><tr><td>等离子体键合/清洗仪</td><td>Harrick Plasma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3&amp;rdquo; 硅片</td><td>Sigma Aldrich</td><td>647535</td><td></td></tr><tr><td>PDMS</td><td>Dow Corning</td><td></td><td>应包含 Sylgard 184 及固化剂</td></tr><tr><td>SU-8 光刻胶</td><td>MicroChem</td><td></td><td>粘度取决于器件尺寸</td></tr></tbody></table>

无金属电极的微流控液滴皮升注射

Picoinjection of Microfluidic Drops Without Metal Electrodes

目前用于将试剂皮升注射（picoinject）到微流控液滴中的方法需要在微流控芯片中集成金属电极。这些电极的集成为器件制造过程增加了繁琐且易出错的步骤。我们开发了一种新技术，可消除皮升注射过程中对金属电极的需求。该技术利用注射液本身作为电极，因为大多数生物试剂含有溶解的电解质，具有导电性。通过去除电极，我们减少了器件制造的时间和复杂性，并提高了器件的稳定性。此外，在我们的方法中，注射体积取决于施加在皮升注射溶液上的电压，这使得我们能够通过调节施加的电压快速调整注射体积。我们证明了该技术可与包含常见生物化合物的试剂兼容，包括缓冲液、酶和核酸。

在皮升注射位点拍摄的显微图像显示，皮升注射液的电击足以触发注射过程（图2）。通过调节施加电压的幅值，可控制注射体积，较高的电压可实现更大的注射体积。我们绘制了三种典型摩尔浓度的注射液在不同施加电压幅值下的注射体积关系图（图3）。为展示本方法的速度，我们根据液滴是否含有荧光染料，选择性地对经过注射位点的液滴进行注射（视频1）。液滴以200 Hz的频率通过注射器，但最高可达10 kHz，具体速率取决于液滴检测装置的性能3。
我们将注射体积对施加电压的依赖性归因于以下事实：当液滴接近并经过皮升注射孔时，分隔液滴界面与注射位置处凸起的油层厚度减小8。电场诱导的薄膜不稳定性阈值电压与该油层厚度成正比9,10。因此，当液滴接近皮升注射器时，合并发生的时刻取决于电场强度的大小。较高的施加电压可使液滴与注射流体更早发生合并，从而导致更长的注射持续时间。由于注射体积取决于注射持续时间，因此它也依赖于施加的电压。
<p clas...

我们开发了一种无需金属电极即可对微流控液滴进行皮升级注射的技术。因此，采用该技术的装置更易于制备和使用。

现有的将试剂皮升注射到微流控液滴中的方法需要将金属电极集成到微流控芯片中。这种集成……

本实验的总体目标是设计、制备并利用微流控芯片，实现将试剂精确且可控地注入油包水液滴中，该过程称为皮升注射（pico injection）。首先，设计一种具有乳液通道的装置，该通道逐渐变窄，其直径小于球形液滴的直径，从而使液滴在惰性载油中均匀分布。第二步，将水相和油相液滴引入装置，并流向注射位点。一个垂直通道，用于注入待注射的试剂。随后，当液滴通过注射位点时，向注射流体施加高电压，以促使液滴与注射流体融合。实验结果表明，通过调节所加电压的大小，可实现对皮升级体积试剂的精确控制。该技术源于简化器件制备过程的需求，其优势在于无需使用金属电极。与现有技术相比，本方法的优势在于装置设计、制造和使用的简便性。先前方法中使用的金属电极在制造过程中容易断裂，并且对通道内的灰尘和碎屑较为敏感。通过消除电极，我们使装置更加耐用，并提高了制造效率。第一步是根据实验需求设计一款微流控芯片。使用计算机辅助设计软件进行此步骤，以便后续采用光刻技术。该芯片设计中的乳化通道小于将要使用的球形液滴，以实现更有效的皮升级注射。皮升级注射位点基于文献中报道的设计，但去除了金属电极。附加通道可作为法拉第护城河，使上游液滴免受电场干扰。设计完成后，采用软光刻技术制备器件，随后将器件键合至玻璃载玻片上，即可投入使用。准备一个空气压力控制泵，用于对含有液体的储液池加压。通过调节泵的输出，使加压空气经由一段内径为2.7毫米的聚乙烯管排出。将管子末端套在注射器针头后端的乳头状接口上。用环氧树脂密封注射器与管子之间的间隙后，使用适合实验的试剂安装一根27.5号针头。制备均匀的乳液，其中水相液滴悬浮于载油中。将乳液装入配备27.5号针头的1毫升注射器中。然后将注射器固定在注射泵上，并使针头朝上放置。下一步是准备引入微流控装置及其储液池的试剂。取一个15毫升离心管及管盖，使用皮肤组织打孔器或其他合适的工具，在管盖上打三个直径为0.5毫米的孔。准备一根直径为0.5毫米、长度比离心管长出几厘米的金属丝电极。将该电极插入管盖的一个孔中，确保其到达管底，并在顶部伸出几厘米。接下来，准备一段长约20厘米的聚乙烯管。将其插入第二个孔中。同样，应使其延伸至剩余孔中试管的底部。取一段长约2.5厘米的聚乙烯管。该管将位于液面之上。在瓶盖顶部涂抹紫外光固化环氧树脂，以密封缝隙。当固化完成后，用所需的皮升注射液（此处为 100 毫摩尔氯化钠）填充毛细管，并拧紧盖子。将气压控制泵的输出端连接到盖子中较短的一段管路上。通过将针头插入管腔，针头应能紧密贴合。将离心管放入其支架中。取一支1毫升注射器，吸入1摩尔氯化钠溶液。连接一根27.5号针头作为法拉第护沟液的导流装置，并将注射器固定在注射泵上。用另一支1毫升注射器吸取载流间隔油。连接27.5号针头，并将其固定在注射泵上。此时可将注射器与微流控芯片连接。首先，确保芯片固定在平坦的表面上。接着

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