Optogenetically有针对性的前脑电路的激光扫描光刺激

该程序的总体目标是在体外切片制备中应用现代光遗传学技术对靶向神经元通路进行光刺激。这是通过首先在感兴趣的神经元细胞系中表达通道杆 Dossin 来实现的。该程序的第二步是对要研究的相关大脑结构进行急性切片准备。

下一步是记录切片制备中神经元对通道（表达 RO Dossin 纤维）的光刺激的反应。最后一步是对表达通道视蛋白的神经元和纤维的分布进行成像。最终，这种方法能够使用光遗传学靶向神经成分的激光扫描光刺激来评估神经回路的功能拓扑和突触特性。

与传统电刺激方法相比，该技术的主要优点是能够专门靶向和刺激特定的神经元细胞类型，并在体外检查它们的长距离投射。这种方法可以帮助回答系统神经科学领域的关键问题，例如复杂 war sockets 的功能组织。准备注射器和针头来注射病毒溶液，每毫升含有 4 微克的聚合物以增强转染。

然后用注射泵加压注入 200 纳升的溶液，两到三周后，就会有充分的通道棒 Dossin 切片表达。准备工作应尽快进行 取出注射的大脑后，使用干净的剃须刀片在所需的方向上制作一个大脑块。接下来，使用瞬干胶将大脑的阻塞表面粘贴到切割阶段。

然后将载物台转移到冷冻冷藏的 vibram 切割室中，将冰冷的 A CSF 倒入切割室中。使用 viome 将大脑切片成 4 到 500 微米厚的切片。将脑切片转移到含氧的保温室中，让它们在 30 摄氏度下孵育至少一个小时，然后再进行实验。

当准备好开始实验时，将脑切片转移到电生理记录装置的载物台上。使用标准全细胞膜片钳技术记录神经元。在对移液器施加正压的同时，通过神经元短暂定位记录移液器。

与电池接触后，释放压力并施加吸力以形成千兆密封。然后短暂抽吸以打破整个细胞配置的膜，并在电压或电流钳模式下进行记录。使用潮汐波或 EFA 数据采集软件作激光扫描仪。

使用前必须根据光电二极管校准软件，以控制激光器的功率。在其路径中放置一个可变的中性密度轮。旋转轮子通过在后焦平面上测量来调整激光器的功率。

功率通常设置为 25 到 D 毫瓦之间。快门的脉冲参数控制软件中刺激的长度和时间。可以通过抓取视频功能制作要刺激的区域的图像。

接下来，设置刺激网格，例如间距为 16 微米的 16 x 80 网格。然后将网格叠加到采集的图像上，并调整 XY 坐标和偏移度以优化方向以开始刺激。激活地图功能。

数据被保留下来，可以使用 tidal wave 中的离线分析程序进行分析，也可以使用 EFAs 软件中的地图分析程序进行分析。在切片上完成生理记录后，可以记录 YFP 标记的通道视蛋白的表达模式。首先，在 4 摄氏度下，在 0.01 摩尔 PBS 中的 4% PFA 中固定切片过夜。

第二天，将切片转移到 30% 蔗糖 4%PFA 溶液中，以进行过夜冷冻保护。第二天，在低温恒温器上切下 50 微米的切片。在 PBS 中冲洗切片并安装它们，以便在共聚焦显微镜上用抗褪色介质进行成像。

在白光中找到感兴趣区域后，使用 514 纳米激发波长和 527 纳米发射波长。对驱动通道杆 Dobson 表达的 YFPA 病毒构建体进行成像，EYFP。在兴奋性中，谷氨酸能神经元被注射到 BSY 小鼠的初级视觉皮层中。

在初级和次级视觉皮层之间的轨迹中发现病毒表达，并在 LGN 全细胞膜片钳皮层的皮层丘脑纤维中发现，该记录来自次级视觉皮层中由星号显示的 e PSC 标记的神经元。在对通道进行激光扫描光刺激后，棒状 Dossin 在 V 的下层表达纤维，来自初级体感皮层第六层的两个皮层丘脑突起。使用 CRE LAX 方法研究腹侧后核，以在第 6 层皮质丘脑神经元中表达通道杆 dossin，并在它们的投影中，如预期的那样，通过成群的 a V 构建体转染到 CRE 转基因小鼠中导致通道杆 dosin 在目标第 6 层神经元中表达，其纤维延伸到第 4 层。

通道杆 Dobson，EYFP 表达也出现在从 VP 神经元投射到 VP 生理记录的纤维中。使用全细胞膜片钳显示，在记录的神经元附近进行光刺激后，可以引发 e PSCs，该神经元以星号为标志。离线分析描述了 VP 中对光刺激的平均反应振幅切除的 50 微米切片的第六层皮层丘脑神经元表达通道 Rodin EYFP，揭示了标记纤维的精细模式，从第 6 层穿过到第 4 层，在那里它们终止并广泛地弯曲。

此外，观察到皮质丘脑纤维进入白质并穿过丘脑。看完这个视频，你应该对如何在体外切片制备中应用现代光遗传学技术对靶向神经元通路进行光刺激有了很好的了解。不要忘记，当您执行与此程序相关的校准步骤时，使用激光器可能非常危险。

佩戴防护眼镜。