单厂，无菌的缩影和结瘤的豆科植物生长苜蓿与根瘤菌共生体根瘤菌

该程序的总体目标是使用由标准实验室板制成的单株无菌微观世界，量化接种了固氮菌 sino oum me latte 的不同突变变体的 medic cargo Tula 植物的共生表型。这是通过首先将 Mula（17 颗种子）用酸划伤并在琼脂平板上发芽来实现的。第二步是使用弯曲的热刮刀制备单个植物无菌微观世界，每个固化板及其盖子关闭板。

稍后，我们将在侧面留下一个椭圆形的孔。接下来，将单个 Mula 幼苗放在微观世界上，根尖接触琼脂和共铅蛋白以及从板中 U 形缺口伸出的 0.5 厘米的溜槽。最后一步是用 SME 拿铁接种并将板作为铝箔包裹的堆栈在发光的生长室中孵育。

最终，植物芽长度和重量以及根瘤类型的量化用于显示每个 S milliot 高菌株或 ULA 突变体的相对共生成功。与其他允许连续目视检查根生长的方法（如生长袋和 cason）相比，该技术的主要优点是接种了不同 Cy Melo 菌株的植物交叉污染的风险非常小。这种方法可以帮助回答 Zoia 豆科植物共生领域的关键问题，例如接种了以不同效率侵入根部的 s rosa melodi 菌株的 mego trica 植物的根瘤发育时间范围。

这种方法的视觉演示至关重要，因为微观世界的构建和幼苗的转移很难用文本来描述。协助我演示该程序的是我实验室的研究生 Haji Mendez 和博士后 Clotilde Caru。该程序从 M 躯干 aula 的消毒开始。

A 17 颗种子通过酸松首先称量足够所需数量的幼苗的种子。Mula A 17 种子每粒约 4 毫克，将种子转移到带有无菌铝箔盖和移液管的无菌 125 毫升烧瓶中。沿烧瓶侧面吸取 20 毫升浓硫酸，沿烧瓶侧面吸取酸会升高，对与未灭菌种子接触的烧瓶内部进行灭菌。

用无菌玻璃移液管打碎种子块。经常旋转每个培养瓶 10 到 12 分钟。种子上会出现棕色的小坑。

当至少 10% 的种子有棕色小坑或 12 分钟过去时，这些是种皮上的小孔，以先到者为准，用无菌玻璃移液管从烧瓶中去除所有酸。倾斜烧瓶以收集烧瓶曲线中剩余的酸，并使用小玻璃移液器将 100 毫升无菌超纯水快速倒入每个烧瓶中，以去除所有剩余的酸冲洗种子。过量的水会稀释酸，防止酸与水反应过程中过热和种子损坏，倒出水并对烧瓶的边缘进行火焰消毒。

向每个培养瓶中加入 50 毫升无菌超纯水并旋转。倒掉水，在烧瓶的边缘燃烧。再加入 50 毫升无菌超纯水，以这种方式旋转。

最后一次冲洗后，冲洗种子 8 到 10 次。将 50 毫升无菌超纯水倒入每个培养瓶中，并将无菌铝箔盖置于 4 摄氏度处避光过夜。为了让种子在第二天吸收，将两个培养瓶带到无菌层流罩中。

所有后续步骤都必须在无菌层流罩中进行，因为空气中的霉菌孢子是最有问题的污染物。倒出每个培养瓶中的水，然后用大约 25 毫升的超纯水冲洗两次。第二次冲洗后，向每个培养瓶中加入 20 毫升无菌超纯水涡流以重悬种子，并将种子倒入 1.1% 至 1.2% 琼脂发芽板中，涡流板以分布种子。

种子应均匀分布在 4 到 5 厘米的范围内。在板的一端，这将是板的顶部。底部 5 到 6 厘米应保持无种子。

用无菌移液器吸出水。将板倾斜 45 度 10 到 20 分钟，让剩余的水排到板底部。接下来，用无菌移液器去除收集在倾斜板底部的所有水。

装回盖子并用 param 密封板。堆叠发芽板，然后将它们全部翻过来。以 90 度角，种子将躺在琼脂的垂直表面上。

完全吸收的种子应该很容易粘附在琼脂上。根会向下生长。用箔纸包裹一叠发芽板以阻挡光线，并在 25 摄氏度下保持三天。

要开始此过程，请按照随附手稿中的配方和说明准备 jenssen 培养基。培养基冷却后，添加添加剂并检查 pH 值，开始将培养基倒入直径为 100 毫米的圆形。15 毫米深的板。

板应倒入约 0.9 至 1 厘米深。每板使用约 70 毫升培养基。在倾倒过程中堆叠板，以防止在板盖上形成冷凝水。

Jenssen 培养基的成分会形成浑浊沉淀，因此定期将水罐放回磁力搅拌板以防止成分沉淀非常重要。詹森板凝固后，必须用弯曲成 U 形的称重刮刀将板和盖子切开。用燃烧器加热抹刀的弯曲处，直到红热的缺口，五到六个盘子，然后再次加热并开槽，还要在板盖上开槽。

当缺口盖放在缺口板上时，将创建一个椭圆形的门户，幼苗的滑槽将通过该门户生长。如前所述，在 Mula 种子铺板发芽三天后，打开发芽板并立即用无菌超纯水淹没。将镊子浸入乙醇中并短暂燃烧以消毒。

用无菌镊子将所有幼苗的根尖轻轻推入水下，防止干燥，选择根部平直、无明显缺陷的幼苗。检查 jenssen 的介质微观世界的盖子是否有冷凝水积聚。用镊子轻弹盖子以去除冷凝水。

轻轻地从伊丁旁边的发芽板中挑选一棵幼苗，然后将根放在 jenssen's 上。中等微观世界。确保根尖与琼脂接触。

如果种皮仍然存在，请轻轻去除它。用镊子轻轻地搅动种皮，直到它让位并丢弃 co leadin 和大约 0.5 厘米的滑槽。如果从板中的 U 槽中伸出，小心地用幼苗上盖子的 U 槽盖代替板的盖子，为幼苗创建一个门户，在接种微观世界之前，从 S mil latte 培养物制备接种悬浮液，如随文所述。

将每种悬浮液用无菌超纯水稀释至 OD 600 为 0.05，并且肉眼几乎无法察觉悬浮液的混浊。打开每个微观世界，将 100 微升适当的 salvati 悬浮液接种到幼苗根部。盖上盖子，并放在 6 到 10 个微观世界的水平堆叠中，用于要比较的每种 SEL 菌株。

接种至少 15 株植物，用于在共生生产力方面存在细微差异的菌株。接种 30 至 35 株植物：至少未接种 10 株植物作为阴性对照，至少 20 分钟后，用 Esme Lata 1 0 2、1 或其他合适的野生型菌株接种 30 至 35 株植物作为阳性对照，让 Esme Lata 悬浮液吸收到根表面，悬浮液浸入琼脂中，用石蜡薄膜板单独包裹每个板包裹到缺口的最边缘，但石蜡膜不应阻止幼苗的生长。将每堆 6 到 10 个板的幼苗门户排成一排。

将堆栈以 90 度角放置，幼苗朝上。石蜡膜的粘性会将板固定在适当的位置足够长的时间，以将整个堆栈包裹在箔纸中，在幼苗出现的地方留下一到两厘米的条带解开。将铝箔包裹的堆栈放入设置到适当条件的照明生长室或生长室中。

植物可以在微观世界中维持长达 9 周。通过从每个堆栈中解开箔片并计算结节，可以在一系列时间点量化结节数。接种 SME 1 0 2 1 野生型的植物在接种后 10 至 14 天出现根瘤。

共生生产力也可以通过测量新出现的溜槽的长度来测量每个时间点。共生生产力的最终定量通常在接种后 7 周进行，方法是拆下溜槽并测量 ch young mula 幼苗的鲜重。这张照片显示了在培养箱中的微观世界中生长。

如果紧密包装，大于 220 个微观世界将放在 73.8 厘米 x 67.5 厘米的培养箱架上。接下来的四张图片显示了包含 Mula 的微观世界的几种不同视图。A 17 株接种野生型 S 的植物，马耳他 1 0 2 1 图 B 和 C 在铝箔包裹的堆栈中显示了微观世界，植物从微观世界的门户中出现。

芽长可以从微观世界出现的点开始测量，而不会干扰植物。图 D 显示了一个去除了箔片的单个缩影，根部和结节通过板的正面显示出来。图 E 显示了相同的微观世界，植物从板的门户中出现。

微观世界的生长非常适合收集结节发展和芽长的一系列时间点。此图表显示了 emran atula 的拍摄长度数据。A 17 株接种野生型 Es Malta 1 0 2 1 的植物在接种后 7 周和 9 周与未接种的植物进行比较。

在接种后 9 周，剪掉芽以测量芽鲜重。未接种的植物将停止生长并变黄，它们的嫩芽重量仅为约 0.01 克。接种了更有效地侵入 Mula 的 ssta 菌株的植物会生长得更快，并在接种后 9 周达到 0.10 至 0.12 克的体重。

该图显示了接种后 7 周的三种共生表型的示例。MTR aula 的相对共生生产力。A 17 株接种了不同 smeta 流的植物通过以厘米、米为单位的芽长和以克为单位的芽鲜重进行量化。

嫁接条上的星号表示与未配对 T 检验中 1 0 2 1 野生型参考菌株的统计学显着差异。接种这些菌株的植物上的根瘤数量显示在图 C 中，粉红色表示根瘤具有功能并能够固氮，而小的白色根瘤通常没有功能，棕色根瘤衰老和坏死。该图中的比较表明，接种携带 P-S-T-B-L-A FFR 5 XOY 质粒的 SML Lavati 1 0 2 1 的 M 主干 aula A 17 植物的共生生产力大于野生型 S me 1 0 2 1 和携带阴性对照质粒 P-S-T-B-L-A-F-R 5 的菌株。

这些 ex oy over 表达菌株比对照菌株产生更多的共生外多糖 SAG 聚糖。量化需要数周才能显现的共生表型差异的能力是该方法对于共生生产力的所有测量的主要优势。在 MTR Aula A 17 上，Sano Zoia Medicaid 菌株 WSM 4 1 9 和 ABS 7 的表现优于接种 XO YN 5 无效突变体的 Smeta 1 0 2 1 植物，该突变体不产生任何 suc 和 O 聚糖，与未接种的植物具有相似的芽长和鲜重，并且在拆卸微观世界时仅产生无效的根瘤，并测量芽部的新鲜重量，芽可以也被删除。

用于 M 躯干 atula 的成像代表性视图。A 从微观世界中取出后有 17 个根。数字。图 A 和 B 是接种后 10 天的图像，图 C 是接种后 14 天的图像，每个图像中的条形对应于 100 微米。

此处显示的根接种了 smeta 1 0 2 1 野生型、携带卵的 smeta 菌株、C Gus Fusion 和携带 SMC 0 0 9 1 1 的 smeta 菌株。图 C 中的 Gus 融合携带 SMC 0 0 9 1 1 Gus 融合的 STI 细胞的阵风染色在根毛和根表面可见。在尝试此程序时，重要的是要记住始终保持幼苗根部或琼脂与琼脂接触。遵循此程序。

其他方法，如根瘤的切碎和染色，是从根和根瘤制备总 RNA，以便分析与每种共生表型相关的解剖学、生理学和基因表达的差异。看完这个视频，你应该对如何设置单株不育微观世界来观察 Mego Tula Sino Rosa Melo 共生有一个很好的了解，包括种子发芽、微观世界制备和幼苗接种。